CC BY
30
КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
Кашин Р.Ю., Циркин В.И., Костяеи Л.Л. СЫВОРОТКА КРОВИ ЧЕЛОВЕКА СПОСОБНА БЛОКИРОВАТЬ ЭНДОТЕЛИЙ-ЗАВИСМЫЙ РЕЛАКСИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ АЦЕТИЛХОЛИНА В ОПЫТАХ С ЦИРКУЛЯРНЫМИ ПОЛОСКАМИ ПОЧЕЧНОЙ АРТЕРИИ КОРОВЫ ГОУ ВПО Кировская ГМА, г. Киров Кировский НИИ ГиПК, г. Киров
Введен ие.
Известно, что реакция гладких мышц (ГМ) сосудов на вещество может зависеть от состояния эндотелиоцитов, продуцирующих NO [8,-21,22,25]. Это доказано и в отношении вазоди-латации, вызываемой ацетилхолином [21,22,25]. Известно, что сыворотка крови (СК) в разведениях 1:50, 1:100 и 1:500 снижает эффективность активации М-холинорецепторов (М-ХР) гладких мышц матки, трахеи, желудка [2,3,5,6,10,-11,12], а также миокарда [4], а в отдельных случаях (1:103,1:104), наоборот, повышает её [5,6]. Это объясняется наличием в крови эндогенного блокатора М-ХР (ЭБМХР) и эндогенного сенсибилизатора М-ХР (ЭСМХР). Но до настоящего времени способность СК модулировать эффективность активации М-ХР эндотелиоцитов не изучалась, хотя эти сведения могут иметь большое значение для понимания патогенеза артериальной гипертензии. Учитывая, что вопрос о модуляции трансмембранной передачи сигнала от рецептора внутрь клетки сегодня находятся в центре внимания многих исследователей [7], считали возможным более детально изучить его в отношении гладких мышц почечной артерии коровы (ПАК). Мышцы этого сосуда не часто становятся предметом физиологических исследований [2,13,14,16,18,20,24] Это в полной мере касается почечной артерии коровы [2]. В то же время, эффективность нервных и гуморальных влияний на миоциты этого сосуда может иметь большое значение для функционального состояния почки как органа выделения и участника регуляции системного кровотока и гомеостаза. С учетом сказанного в работе была поставлена цель - изучить характер сократительных ответов гладких мышц ПАК на ацетилхолин (АХ) в зависимости от функционального состояния эндотелия и влияние на эти ответы сыворотки крови (СК) как источника эндогенного блокатора М-холинорецепторов (ЭБМХР).
Материалы и методы исследования.
В 14 сериях опытов, проведённых на 574 циркулярных полосках почечной артерии 52 коров, оценивали тоническую активность полосок при действии гиперкалиевого (30-80 мМ КС1) рас-
твора Кребса (ГРК), адреналина (10 |0-10'6 г/мл) и АХ (10'9- 5x10’5 г/мл) и модулирующее влияние СК (1:50, 1:100, 1:500, 1:1041 1:104) небеременных женщин (п=26) При этом в 6 сериях (2,4,6,11,-13,14) опыты проводили одновременно на полосках группы 1 (с интактным эндотелием, т.е. от артерий, полученных в переделах 2 часов от момента забоя животного) и на полосках группы 2 (с поврежденным эндотелием - от артерий, хранившихся 24 ч. при 4°С и у которых перед опытом удаляли эндотелий ватным тампоном). В остальных 8 сериях использовали полоски с интактным эндотелием, но взятые в опыт спустя 2-24 часа после забоя животного.
Регистрацию сокращений полосок вели по методике Циркина В.И. и др. [9] при 38°С, постоянной перфузии раствором Кребса со скоростью 0.7 мл/мин, пассивной аэрации рабочей камеры и исходной нагрузке в 500 мг (4.9 мН) на многоканальном «Миоцито графе», включающем прибор Н-3020, механотрон 6МХ1С, термо-статирующее устройство и шприцевой дозатор. Во всех сериях началу опытов предшествовал 30-минутный период адаптации полосок, т.е. период перфузии их раствором Кребса до установления стабильного базального тонуса. Опыты проводили по различным схемам, указанным ниже, при длительности этапов не менее 10 мин. В сериях 11-14 использовали неселективный (3-адреноблокатор обзидан (10‘6 г/мл).
Венозную кровь получали на станции переливания крови у 19-50-летних женщин. Её исследовали спустя 2-4 ч. после забора. СК получали центрифугированием крови (1000 об/мин, 15 мин.) и разводили раствором Кребса, который содержал (мМ): ЫаС1- 136; К.С1-4.7; СаС!,
- 2.52; МцС1, - 1.2; КН2Р04 - 0.6; №НСО, - 4.7; С6Н]206 - 11 (pH 7.4). Применяли адреналина гидрохлорид (Москва), ницерголин (Оболенск), атенолол (Щелково), обзидан (Германия), аце-тилхолина хлорид и Ы-нитро-Ь-аргинин-мети-ловый эфир, или Ь-ЫАМЕ (оба— США-Бельгия).
Результаты исследования обрабатывали параметрическим методом и представляли в виде средней арифметической и её ошибки (М±т); различия оценивали по критерию Стьюдента, считая их достоверными при р<0.05 [1].
Результаты исследования и их обсуждение.
1. Влияние АХ на базальный тонус циркулярных полосок ПАК. Показано, что полоски обеих групп (т.е. независимо от функционального состояния эндотелия) имеют низкий базальный тонус и не обладают свойством автоматии. Исследование, проведенное на 7 полосках группы 1 (серия 1) по схеме: раствор Кребса (РК) -* АХ, в одной из концентраций (10'9-5х10‘5 г/мл) -* РК, показало (рис. 1, табл. 1), что в концентрациях 109-107 г/мл АХ не изменяет базальный тонус полосок, а в концентрациях 10 й, 10'5 и
5x10'5 г/мл в первые 5 минут воздействия дозозависимо увеличивает его (до 5.4-5.9 мН), а в последующие 5 минут - снижает до исходного уровня или ниже (на 0.4-4.7 мН, т.е. на 84.0-126.7% от первоначального подъема). В серии 2, которую проводили одновременно на 23 полосках группы 1 и на 17 полосках группы 2 по аналогичной схеме, при использовании АХ в концентрации 5x10-5 г/мл также отмечена двухфазная реакция на АХ. При этом первичный подъем тонуса у полосок группы 1 был ниже, чем у полосок группы 2 (5.4±0.6 мН против 9.5±1.9, р<0.05). Это говорит
0 том, что релаксирующий эффект АХ в группе
1 (из-за наличия эндотелия) выражен в большей степени, чем в группе 2. Учитывая представле-
ние о механизме влияния АХ на гладкие мышцы [6], полагаем, что в обеих группах вазоконстрик-торный эффект АХ обусловлен активацией М-ХР миоцитов ПАК, а его прекращение - десенсити-зацией М-ХР миоцитов к АХ и разрушением АХ ацетилхолинэстеразой, а для полосок группы 1 также ещё и усилением продукции N0 эндотели-оцитами при активации их М-ХР. Таким образом, результаты серий 1 и 2, интерпретация которых требует ряд допущений, не противоречат представлению о том, что релаксирующий эффект АХ является эндотелийзависимым. В то же время, эти результаты указывают на то, что данная модель не является оптимальной для изучения влияния СК на эффекты АХ.
Б (-----------_
АХ-5х10-5
Рис.1. Механограммы циркулярных полосок ПАК с интактным (группа 1, панель А) и повреждённым (группа 2, панель Б) эндотелием, демонстрирующие ответ полосок на АХ (5х10'5г/мл; АХ-5х10'5). Калибровка - 5 мН, 5 мин.
Таблица 1
Величина тонуса (в мН) циркулярных полосок ПАК при воздействии АХ (10-9'5х10-5 г/мл) на фоне базального тонуса
Концентрация АХ, г/мл Г рупиа и 1-й этап: ацетилхолин, Ю-0 г/мл 2-й этап: раствор Кребса
1 а - после 5 минут воздействия 16 - после 10 минут воздействия
IO'7“ 1 7 0 0 0
10'“ 1 7 0 0 0
ю- 1 7 0,6±0.6 -1.0Ü.0 -1.0*1.0
|- .. 'ff* 1 7 1.81-0.4 -0.4±0.2 -2.4±0.5
10 1 7 5.9±0.5 1,0±0.3 0.0±0.5
5x10'5 1 23 5.0±0.6 -1.7±1.1 -4.7±1.4
5x10''' 2 17 9.5±1.9 1 -0.8-11.4 -8.4±1.б
Примечание: 1 - различие с группой 1 достоверно (р<0.05), по критерию Стьюдента.
2. Влияние АХ на тонус циркулярных полосок ПАК, вызванный гиперкалиевым (60 мМ КС1) раствором Кребса. В серии 3, проводимой на полосках группы 2 (п=17) по схеме: раствор Кребса (РК) -* ГРК (20 мМ КС1) -*• РК -* ГРК (30 мМ КС1) -* РК -* ГРК (80 мМ КС1)
-* РК, показано, что повышение концентрации в среде КС1 (30, 40, 50 и 60 мМ) дозозависимо и обратимо повышает тонус полосок соответственно до 1.7±1.0; 4.2±1.7; 12.8±2.9 и 17.9±3.8 мН. Различия в величине тонуса, вызванного при действии ГРК, содержащего 60, 70 и 80 мМ КС1 (17.9±3.8, мН. 18.6±3.8 и 19.3±3.6 мН) носили недостоверный характер (р>0.1). Ответная реакция на ГРК у 100% полосок проявлялась при 60 мМ КС1 и выше. Исходя из этого, в следующих сериях (4-6) мы использовали ГРК, содержащий 60 мМ КС1.
В серии 4, выполненной на 23 полосках группы 1 и на 31 полоске группы 2 по схеме: РК -» ГРК, 60 мМ КС1, 60 минут -* РК, показано (рис.2), что в обеих группах ГРК повышал тонус полосок. При этом у полосок группы
2 тонус повышался до максимальной величины уже в первые 10 минут перфузии ГРК и на этом уровне сохранялся на протяжении последующих 50 минут (табл. 2). У полосок группы 1 величина тонуса в первые 10 минут воздействия ГРК была на 44% меньше, чем в группе 2 (9.2-±1.6 против 16.4±1.5 мН, р<0.05). Это мы объясняем способностью эндотелиоцитов полосок группы 1 продуцировать N0, который препятствует развитию тонического ответа на ГРК. В дальнейшем тонус полосок группы 1 постепенно возрастал и к 50-й минуте становился таким же (16.6±1.9 мН), как у полосок группы 2 (17.6*2.7
мН, р>0.1). Повышение тонуса у полосок группы вая данные Меп(^аЬа1 V. еГ а1. [19] о повышении
1 мы объясняем тем, что по мере воздействия АХ продукции N0 в эндотелии брыжеечной артерии
в эндотелиоцитах этих полосок снижается запас Ь- крысы под влиянием ГРК (70 мМ КС1), мы не ис-
аргинина (как источника синтеза N0), что снижает ключаем, что и в нашим опытах ГРК (60 мМ КС1)
продукцию N0, а, следовательно, и его релаксиру- тоже увеличивал продукцию N0 и тем самым поющее воздействие на миоциты. При этом, учиты- вышал скорость истощения запасов Ь-аргинина.
Таблица 2
Величина тонического ответа (в мН и в % к тонусу, вызванному ГРК на 10-й минуте воздействия) циркулярных полосок ПАК при 60-минутном воздействии ГРК (60 мМ КС1) у полосок с интактным (группа 1) и поврежденным (группа 2) эндотелием.
Длительность воздействия ГРК, мни. Группа 1 Группа 2
п мН % к тонусу | 11 на 10-й минуге мН % к тонусу j на 10-й минуте !
10 2 3 9.2±1.6* 100 31 I6.4A1.5 100
20 23 10.5±1,8* 124.3±9.б' ; 31 18.5±1.8 112.9±4.0
° с*-, 23 11.9±1.8* 145.3Ü4.51 ! 3! 17.9±2.2 105.3±7.1
40 23 13.2±1.7 166.0±17,0''2 i 31 17.7Í2.5 97.7±9.0
50 23 I6.6±1.9¡- 217.7±25.1 l2’J 31 17.6i.2.7 92.9± 11.6
60 23 19.2±2.0'-2Л4 257.7±31.1Ш’4 [31 20.4±2.8 1 1 1.8+14.7
Примечание: 1,2,3,4 - различия с 1, 2, 3 и 4 этапами достоверно (р<0.05), по критерию Стьюдента; * - различия с группой 2 достоверно (р<0.05) по критерию Стьюдента.
Для доказательства представления о N0 как факторе, препятствующем развитию тонического ответа миоцитов на ГРК, была проведена серия 5 с использованием L-NAME, который, как считается [8,21], блокирует синтез NO. Эти опыты проводили лишь на полосках группы 1 (п=9) по схеме: РК L-NAME (104 г/мл) РК -» ГРК (60 мМ КСЛ, 10 минут) -* ГРК + L-NAME -*■ ГРК -» РК. Установлено, что L-NAME не изменяет базальный тонус полосок (это, однако, не исключает способность L-NAME снижать сократимость миоцитов). Вопреки ожиданию, в присутствии L-1MAME тонус полосок, вызванный ГРК, не возрастал (как должно происходит при блокаде синтеза NO), а, наоборот, снижался; удаление же L-NAME сопровождалось быстрым ростом тонуса (с 25.9±4.7 до 37.8=2.8 мН, р<0.05). Выявленный феномен противоречит представлению о L-NAME как ингибиторе синтеза N0, но согласуется с данными литературы о способности L-NAME блокировать Са2+-каналы миоцитов сосудов [15,17]. Вероятно, это является одной из причин торможения тонического ответа на ГРК в присутствии L-NAME. Ранее Mendizabal V. et al. [19] отметили, что L-NAME (10'6-10'4М) не влияет на синтез N0, индуцированный ГРК; авторы объяснили это наличием NOS-независимого пути синтеза N0 в эндотелиоцитах. Полагаем, что это наблюдение Mendizabal V. et al. [19] частично объясняет отсутствие ожидаемого результата от применения L-NAME. Таким образом, результаты серии 5 не позволили доказать предположение о снижении синтеза NO при длительном воздействии ГРК. В то же время они косвенно подтверждают данные
литературы о блокирующем влиянии Ь-КАМЕ на Са2+-проницаемость [15,17] и о существовании 1Ч05-независимого пути синтеза N0 в эндотелиоцитах ПАК [19].
В целом, результаты серий 3-5 позволяют заключить, что ГРК (60 мМ КС1) можно использовать для повышения тонуса миоцитов ПАК, в том числе с целью изз^чения вазодилатирующей активности АХ. Это и было реализовано в серии
6. Опыты проводили на полосках группы 1 (п=45) и группы 2 (п=36) по схеме: РК -> ГРК (60 мМ КО) -> ГРК + АХ (в одной из концентраций, 10'9-10'5 г/мл) -» ГРК -» РК. На полосках группы 2 установлено (рис.2, табл.З), что АХ в концентрациях 10'9-10'бг/мл не влияет на тонус, вызванный ГРК, а в концентрации 10'5 г/мл повышает его (до 149.3±17.2%; р<0.05). Па полосках группы 1 АХ в концентрациях 10-9-10-7 г/мл также не влияет на тонус, вызванный ГРК, а в концентрациях 10'6 и 10'5 г/мл снижает его (соответственно до 78.1±8.7% и 60.2±16.7% от первоначальной величины, р<0.05). Следовательно, на фоне тонуса, вызванного ГРК, направленность эффекта АХ зависит от состояния эндотелиоцитов - при их способности продуцировать N0 (группа 1) АХ оказывает вазодилатирующий эффект, а при отсутствии такой способности (группа 2) - он проявляет вазоконстрикторный эффект. Это согласуется с представлением об АХ как эндоте-лийзависимом вазодилататоре [8,21], а также свидетельствует о способности АХ оказывать вазодилатацию на фоне тонуса, вызванного ГРК, и говорит о перспективности применения такой модели для изучения вазодилатирующего эффекта АХ и его модуляции.
60 мМ КС1
ÄX-5'
Рис.2. Механограммы циркулярных полосок ПАК с интактным (группа 1, панель А) и повреждённым (группа 2, панель Б) эндотелием, демонстрирующие ответ полосок на воздействие АХ (5х10"5 г/мл; АХ-5) на фоне тонуса, вызванного ГРК (60 мМ КС1). Калибровка - 5 мН, 5 мим.
3. Влияние АХ на тонус циркулярных полосок ПАК, вызванный адреналином (10'6 г/мл), и моделирующее действие СК человека. В серии 7 оценивали характер эффекта адреналина от его концентрации в среде. Её проводили на по-
лосках группы 2 (п=7) по схеме: РК -» адреналин (Адр), 10'6 г/мл -* РК -» Адр, 10'10 г/мл -* РК -» Адр, 10'9 г/мл -* РК-» Адр, 10 8 г/мл -* РК -» Адр, 10-7 г/мл -* РК Адр, 10'6 г/мл -» РК.
Таблица 3
Величина тонуса циркулярных полосок ПАК (в мН и в % к 1-му этапу опытов), вызванного ГРК (60 мМ КС1) до (1), на фоне (2) и после удаления АХ (10"9-10"5 г/мл) у полосок с интактным (г руппа 1) и поврежденным (группа 2) эндотелием.
; Концентрация АХ, г/мл _ Этапы эксперимента
п 1-й: ГРК 2-й: ГРК + АХ 3-Г : ГРК
мН мН % к 1 этапу мН % к 1 этапу
Группа 1
10‘" 8 7.6±3.0 7.3±2.7 98.4± 1.6 8.1 ¿3.4 103.1*3.1
10-* 5 10.4±3.6 9.4*2.7 95.8*4.2 13 .3*4.5 124.2+11.2*
10' 17 14.5*3.2 13.9±3.5 91.3*7.8 15.2*4.2 94.5±9.8
10^ 9 13.3±3.5 10.9*3.5 78.1*8.7* 1>.2*4.5 118.8±24.5
10-' 6 22.2*4.4* 10 7=3..5 60.2*16.7* 26.5*6. Г! 1 19.2:1:11.2*
Группа 2
IO’’ 4 11.8±3.9 13.2±5.4 109.4*9.4 13.2*5.4 109,4*9.4
10'* 4 12.7±2.9 15.4±3.3 122.4±9.9 15.4±3.3 122.4*9.9
10-' 1 1 1 1.3*1.6 12.9±2.1 1 14.2±7.0 11.4±2.5 106.7*15.8
ю* 5 9.8±7.1 11.2±7.0 153.9*38.7 12.9*7.4 185.4*39.1
10-' 12 10.5±3.0 13.4*3.3 149.3*17.2* 13.4+3.3 148.6*25.7
Примечание: * и # - различия соответственно с 1 рию Стьюдента.
Установлено, что в концентрациях 1010 и 10"9 г/мл адреналин не влияет на базальный тонус, а в концентрациях 10‘8, 10'7 и 10‘6 г/мл дозозависимо и обратимо повышает его (соответственно до 0.9±0.5; 3.4±0.9 и 32.2±4.6 мН), что наблюдалось у 42.9%, 85.7% и 100% полосок. С учетом этих данных, в следующих сериях адреналин использовали в концентрации 10~6 г/мл.
В сериях 8,9 и 10, проведённых на полосках группы 2 (п=72) по схеме: РК -» Адр, 106 г/мл —*• Адр + блокатор, 10'5 г/мл —> Адр —> РК, показано, что ницерголин (блокатор а-АР) снижает вызванный адреналином тонус до 16.7±5,4% от его первоначальной величины, а обзидан (блокатор [31- и (52-АР) и атенолол (блокатор [31 -АР)
(*) и 2 (#) этапом достоверны (р<0.05), по крите-
— лишь до 79.6±7.9% и 64.5±7.6% соответственно. Это свидетельствует о наличии в миоцитах ПАК а-АР (вероятнее всего, а1-АР), (31-АР и (32-АР. С учетом степени снижения тонуса, вызванного адреналином, мы полагаем, что тонус миоцитов ПАК возрастает при активации а-АР
и, в меньшей степени, (31-АР и снижается при активации (32-АР. С учетом этих данных серии 11-14 проводили на фоне блокады (3-АР обзида-ном (10"6 г/мл).
В серии 11 оценивали влияние функционального состояния эндотелия на тонотроп-ный эффект адреналина при его 60-минутном воздействии. Опыты проводили на полосках группы 1 (п=22) и группы 2 (п=33) по схеме:
60 мМ КС1
зз
РК —» Адр, 10-6 г/мл, 60 мин. — РК. Установлено (табл.4), что в обеих группах тонус повышался до максимальной величины уже в течение первых 10 минут перфузии адреналином и оставался на этом уровне (11.0-11.8 мН в группе 1 и 13.1-14.6 мН в группе 2) еще 50 мин, при этом на протяжении первых 40 минут перфузии в группе 1 тонус был на 16-20% ниже (р<0.05), чем в группе 2 (например, в первые 10 минут эти значения составили соответственно 11.0+0.5 мН и 13.1±0.6 мН, р<0.05). Эти данные означают, что базальная секреция N0 функционально ак-
тивными эндотелиоцитами препятствует развитию тонуса при активации а-АР на протяжении всего периода воздействия адреналином. В то же время, очевидно, что тонотропный эффект адреналина не обусловлен торможением продукции NO, что согласуется и с данными Wang
S. et al. [23]. Кроме того, результаты серии 11 демонстрируют устойчивость реакции полосок на адреналин. Это говорит о том, что активация а-АР на полосках ПАК протекает без выраженной десенситизации. Это важно в методическом отношении.
Таблица 4
Величина тонуса (в мН и в % к тонусу, вызванному адреналином на 10-й минуте наблюдения) циркулярных полосок ПАК при 60-мин. воздействии адреналина (10‘6 г/мл) у полосок с интактным (группа 1) и поврежденным (группа 2) эндотелием.
Длительность воздействия адреналина. мин. Группа 1 Группа 2
п 22 мН % к тонусу на 10-й минуте п мН % к тонусу на 10-й минуте
10 11.0±0.5* 100 33 13.1=0.6 100
20 О? 11.0+0.5* 100+0 33 14.3+0.8 108.8+2.8
30 22 11.8*1 1 * 106.7*6.7 33 14.6+0.9 1 10.5+3.2
40 22 1 1,4±0.7* 103.3+3.3 33 14.3+1.1 106.2+5.4
50 -) -) 11.4+0.7 103.3+3.3 33 13.3+1.4 97.9+8.7
60 22 11.6±0.6 105.0+3.3 33 13.1+1.6 95.3+10.4
Примечание: Различия между этапами (10-60 мин.) недостоверны (р>0.1), по критерию Стью-дента. * - различие с группой 2 достоверно (р<0.05), по критерию Стьюдента.
Отметим, что попытка (при использовании Ь-ЫАМЕ, 10"' г/мл) подтвердить наш вывод роли N0 в эффектах адреналина (как в опытах с ГРК) оказалась безуспешной. Действительно, в серии 12, проведенной на полосках группы 1 (п=17) по схеме: РК -» Адр, 10'6 г/мл -* Адр + Ь-ЫАМЕ, 10'4 г/мл -* Адр -» РК, установлено, что Е-ЫАМЕ (10‘4 г/мл) не повышает тонус, вызванный адреналином, а, наоборот, снижает его (до 61.3+12.1% от первоначальной величины, р<0.05). Это феномен мы объясняем способностью Ь-КАМЕ блокировать Са2^-проницаемость миоцитов сосуда, как это отмечено в литературе [15,17] и нами в серии 4.
В целом, результаты серий 7-12 позволили нам в сериях 13 и 14, отличающихся последовательностью воздействий, оценить эффекты АХ на фоне тонуса, вызванного адреналином, и влияние на них СК. Серию 13 проводили на полосках группы 1 (п=84) и группы 2 (п=44) по схеме: РК -> Адр, 10-6 г/мл (этап 1) -» Адр + АХ, 5x10'5 г/мл (этап 2) -» Адр + АХ + СК в одном из 5 разведений, 1:50-1:104 (этап 3) -» РК. В опытах на полосках группы 2 установлено (рис.З, табл.5), что адреналин повышал их тонус (до 15.0-20.0 мН). Введение АХ на фоне тонуса, вызванного адреналином, приводило к тому, что к
концу 5-й минуты этот тонус, как правило, достоверно возрастал (до 127.9-138.4% от его исходной величины, р<0.05). К концу 10-й минуты воздействия АХ в опытах с СК в разведении 1:50 тонус оставался повышенным (129.5±11.8%), а в опытах с СК в разведениях 1:100-1:104 он снижался почти до исходного уровня (до 102.8-115.9%). На полосках группы 1 адреналин также повыш&т базальный тонус, хотя и на меньшую величину, чем на полосках группы 2 (до 9.6-15.1 мН). Введение АХ не изменяло тонус, вызванный адреналином, ни к 5-й минуте (97.1-118.3% от первоначального уровня, р>0.1), ни к 10-й минуте (88.0-101.1%, р>0.1); в отдельных экспериментах к 10-й мин. АХ снижал тонус (рис 3, панель А).
Эти данные можно объяснить следующим образом: в обеих группах АХ вызывает вазокон-стрикцию (за счет активации М-ХР миоцитов), но в группе 1 АХ (за счет активации М-ХР эндо-телиоцитов) одновременно вызывает и вазодила-тацию, которая компенсирует вазоконстрикцию. Анализ результатов следующего (3-го) этапа этой серии показал (рис.З, табл.5), что на полосках группы 2 введение 50-кратного разведения СК на фоне тонуса, вызванного адреналином и АХ, повышало его (до 135.4±10.0% от первоначальной величины, р<0.05).
Адр-б+Обз-6
АХ-5
Сыв-50
Рис. 3. Механограммы циркулярных полосок ПАК с интактным (группа 1, панель А) и повреждённым (группа 2, панель Б) эндотелием, демонстрирующие ответ полосок на воздействие адреналина (10'6 г/мл) с обзиданом (10'6 г/мл; Адр-б+Обз-6), АХ (5х10'5 г/мл; АХ-5) и 50-кратного разведения сыворотки крови (Сыв-1:50). Калибровка - 5 мН, 5 мин.
не проявляли а-адреносенсибилизирующую активность. Иные результаты получены в группе
1 (рис.З, табл.5) - разведение 1:50 не повышало тонус, вызванный адреналином и АХ (он составил 109.6*9.9% от первоначальной величины, р>0.1), разведения 1:100 и 1:500 также не меняли тонус (он составил 107.3±8.0% и 85.5±10.3%), а разведения 1:10Э и 1:104 снижали тонус (соответственно до 81.6*6.9% и 77.5±8.4%, р<0.05).
Таблица 5
Величина тонуса (в мН и % к 1-му этапу) полосок ПАК с интактным (группа 1) и поврежденным (группа 2) эндотелием, вызванного адреналином (10б г/мл), АХ (5х10'5 г/мл) и СК (1:50-1:104).
Этот эффект мы расцениваем как проявление а-адреносенсибилизирующей активности СК (за счет наличия в СК эндогенного сенсибилизатора -»-АР, или ЭСААР), реализации которой не препятствует наличие АХ в среде. Остальные разведения СК (1:100, 1:500, 1:103, 1:104) не повышали тонус (он составил соответственно 112.3±13.4%, 106,2*11.2%, 105.1±14.9% и 88.3±8.9% от первоначальной величины), т.е.
і у = 5 Ї о ь : 3 о. г, со £ £ІГ б і і ' 1руппы п Этапы эксперимента (все -на фоне обзидана, 10‘6г/мл)
1-й: адреналин, 10* г/мл 2-й: адреналин, 10'° г/мл + АХ, 5x10'5 г/мл 3-й: адреналин, 10" " г/мл + АХ, 5x10’5 г/мл + СК
2а. - после 5 мин. воздействия 26. - после 10 мин.воздействия
мН (100%) мН % к 1-му этапу мН % к 1 -му этапу мН % к 1-му этапу
і 1:104 | І і 1 16 15.0*2.7 15.6* 2.9 109.9 * 9.2 13.8* 2.7 101.1 * 9.5 11.0* 2.5 77.5 * 8.4**
2 8 16.4*1.5 18.4* 2.2 110.5 * 5.4 16.9* 1.7 102.8* 3.8 14.8 * 2.2 88.3*8.9
1:10-’ 1 17 14.0*1.8 16.2* 2.2 118.3 * 10.9 13.3* 1.8 98.0 * 7.6 10.7* 1.4 81.6* 6.9*
2 10 20.0*3.7 24.3 * 4.Iі 128.0 лг 9.1* 21.6* 3.9 113.7* 7.1 17.84* 3.4 105.1 * 14.9
1:500 1 16 9.6*0.9 9.5 ± 1.3 100.4 ± 9.7 8.2 * 1.0 88.0*8.7 7.8* 1.1 85.5* 10.3
2 9 19.9*3. Iі 24.9* 4.2* 127.9 * 11.0* 21.9* 3.4 113.1 * 9.6 20.4* 3.4# 106.2* 11.2
1:100 1 16 15.1*1.5 16.7* 2.2 110.0* 8.0 14.0* 1.4 94.5 * 6.4 15.8 * 1,7 107.3* 8.0
п 8 18.1*3.5 22.8 * 4.0 136.1 * 11.6* 19.1 * 3.7 115.9* 12.6 18.6* 3.8 112.3* 13.4
. 1:50 1 21 14.9*1.7 13.3 * 1.4 97.1 * 7.6 12.6* 1.4 89.7*6.2 і і 1,9 109.6 *9.9
2 9 15.0*3.2 18.7* 3.0 138.4 * 11.1* 17.6* 3.1 129.5* | 19.1* 11.8* і 3.5 135.4* 10.0*
Примечание: * и # - различия с 1 (*) и 2а (#) этапом достоверны, р<0.05; 1 - различия с группой 2 достоверны, р<0.05 по критерию Стьюдента.
Адр-б+ОЬэ-б
Ж5 шщ
Сыв-50
Мы интерпретируем эти данные следующим образом: во время 3-го этапа эксперимента, в течение которого на полоски воздействовал адреналин, АХ и СК (в высоких разведениях, т.е. 1:103, !: 104', АХ активировал синтез N0 в эндотели-оцитах, что привело к снижению тонуса, вызванного адреналином. В опытах, в которых СК использовалась в разведениях 1:50, 1:100 или 1: 500, АХ не вызвал релаксацию, так как содержащийся в сыворотке крови ЭБМХР блокировал способность АХ повышать синтез N0 в эндоте-лиоцитах. Таким образом, результаты серии 13 говорят о возможности исследования эффектов АХ на фоне тонуса, вызванного адреналином, а также о способности ЭБМХР (СК в разведениях 1:50, 1:100 и 1:500) снижать эффективность активации М-ХР эндотелиоцитов. Этот вывод подтверждают и результаты серии 14.
Серию 14 проводили на полосках группы 1 (п=50) и группы 2 (п=37) по схеме: РК Адр, 10"6 г/мл Адр + СК, в одном из 5 разведений -* Адр + СК + АХ, 5x10-5 г/мл -* РК. Как и в предыдущей серии, адреналин повышал тонус полосок (рис.4, табл.6) - до 8.2-20.0 мН в группе 1 и до 14.1-15.3 мН в группе 2. Введение на этом фоне 50-кратного разведения СК повышало (р<0.05) тонус в обеих группах - до 137.3±-15.8% (группа 1) и 11 8.6±5.6% (группа 2) от его исходной величины, что мы объясняем наличием в СК эндогенного сенсибилизатора -»-АР (ЭСААР). Этот результат позволяет считать, что способность эндотелиоцитов продуцировать N0 не имеет значения для проявления а-адреносен-сибилизирующей активности СК. Введение АХ на фоне адреналина и СК дополнительно повышало (р<0.05) тонус до 206.2±37.6% (группа 1) и 146.1 ±8.2% (группа 2) от величины тонуса, вызванного адреналином (р12>0.1). Таким образом, если в отсутствии СК при введении АХ на фоне тонуса, вызванного адреналином, у по-
лосок группы 2 тонус дополнительно возрастал, а у полосок группы 1 он не менялся, то в присутствии 50-кратного разведения СК реакция на АХ у полосок с интактным эндотелием (группа
1) стала такой же, как у полосок с поврежденным эндотелием (группа 2), т.е. в ответ на АХ тонус дополнительно возрастал. Это можно объяснить наличием в крови ЭБМХР. Нами также показано (табл.6), что СК в разведении 1:500 в группе 1 (группу 2 не исследовали) не изменяла адреналинвызванный тонус (103.3±5.7%), т.е. не проявляла ЭСААР-активность, а введение АХ на фоне адреналина и СК дополнительно повышало тонус (до 148.4±20.6%, р<0.05). Аналогично, СК в разведении 1:103 в группах 1 и
2 (табл.6) не изменяла адреналинвызванный тонус (100.8±6.5% и 97.5±11.4%), а введение АХ на фоне адреналина и СК повышало (р<0.05) тонус соответственно до 128.4± 10.2% и 131,2±18.3% (р1-2>0Д). СК в разведении 1:104 в группе 1 (группу 2 не исследовали) также не изменяла адреналинвызванный тонус (104.0±6.5%), а введение АХ на фоне адреналина и СК повышало (р<0.05) тонус до 144.7± 11.7%. Следовательно, СК в разведениях 1:500, 1:103 и 1:104 (как и разведение 1:50) препятствует проявлению ре-лаксирующего эффекта АХ и это объясняется наличием в ней ЭБМХР. Отметим, что СК в разведении 1:100 в группе 2 (группу 1 не исследовали) повышала (р<0.05) адреналинвызванный тонус (до 114.2±5.4% от исходного уровня), что объясняется наличием ЭСААР, а введение АХ на фоне адреналина и СК дополнительно повышало (р<0.05) тонус до 152.9±9.8%. Таким образом, результаты серии 14 свидетельствуют о том, что СК в разведениях 1:50, 1:500, 1:10’’, 1:104(и, вероятно, 1:100) снижает способность АХ вызывать релаксацию миоцитов. Это, по нашему мнению, обусловлено наличием в сыворотке ЭБМХР.
Адр-6+Обз-6_
Сыв-ТТ50~
_г"
/
'Л
АХ-5
Адр-б+Обз-б____
СьТв-1:1000 АХ-5
Рис. 4. Механограммы циркулярных полосок ПАК с интактным (группа 1) эндотелием, демонстрирующая ответ полоски на воздействие адреналина (10~6 г/мл) с обзиданом (10'6 г/мл; Адр-6+-Обз-б), СК в разведениях 1:50 (Сыв-1:50; панель А) или 1:103 (Сыв-1:1000; панель Б) и АХ (5x10 5 г/мл; АХ-5). Калибровка - 5 мН, 5 мин.
Как уже отмечалось выше, на полосках груп- М-ХР эндотелиоцитов, повышающей синтез
пы 1 на фоне тонуса, вызванного адреналином, N0). И так как оба эффекта АХ компенсируют
АХ в отсутствии СК вызывает два эффекта - ва- друг друга, то в этих условиях АХ не вызывает
зоконстрикгорный (за счет активации М-ХР ми- дополнительного роста тонуса,
оцитов) и вазодилататорный (за счет активации
Таблица б
Величина тонуса (в мН и в % к 1-этапу), вызванного адреналином (10'6 г/мл), СК (1:100, 1:500 и 1:103) и АХ (5x10'5 г/мл) у циркулярных полосок ПАК с интактным (группа 1) и повреждённым
(группа 2) эндотелием.
1 - 5 п Этапы эксперимента (все - на фоне обзидана, 104, г/мл)
! ± X | о £ ^ О И Ш f Г) и- ! СЗ -2 ; с- о i 1-й 2-й 3-й
Адр, 10"'1 г/мл .Аар, КГ6 г/мл + СК в различных разведениях Адр, 10‘ь г/мл + СК + АХ, 5x10‘5 г/мл
мН (100%) мН в % к 1 -му этапу мН в % к 1 -му этапу
Полоски группы 1 (с интактным эндотелием)
1:50 11 13.4*2.3 16.4*2.7 137.3*15.8* 21.9*3. * 206.2*37.6*
1:500 17 8.2*1.7 8.1±1.7 103.3*5.7 10.2*2.2 148.4*20.6*"
1:10-’ 9 20.0*1.6 20.7±2.6 100.8±6.5 25.5*2.6 128.4+10.2**'
1:10* 13 17.4±2.4 18.0*2.8 104.0*6.5 24.5*3.4*" 144.7*11.7**
Полоски группы 2 (с поврежденным эндотелием)
1:50 14 15.3*1.8 17.3±1.9 1186*5.6* 20.8*2.1 146.1*8.2*
1:100 18 14 1±1.8 16.1+2.1 114.2*5.4* 20.1*2.4 152.9*9.8**
1:10-’ 5 14.9*3.0 14.5±3.5 97.5*11.4 19.2*4.9 131.2*18.3
Примечание: * и # - различия с 1 (*) и 2 (#) Этапами достоверны (р<0.05), по критерию Стыодента.
Наличие же СК, которая, как известно [2,-3,5,6,10-12] содержит ЭБМХР, приводит к доминированию вазоконстриторного эффекта АХ. Это можно объяснить тем, что под влиянием ЭБМХР снижается эффективность активации преимущественно М-ХР эндотелиоцитов, а не М-ХР миоцитов. Но это утверждение будет правильным в том случае, если предположить, что сродство к ЭБМХР у М-ХР эндотелиоцитов выше, чем у М-ХР миоцитов. Мы также полагаем, что вероятность снижения эффективности активации М-ХР эндотелиоцитов под влиянием ЭБМХР должна быть иыше в том случае, если ЭБМХР оккупирует свободные М-ХР, а не занятые АХ. Действительно, в серии 13, в которой СК вводилась на фоне адреналина и АХ, сыворотка проявляла М-холиноблокирующую активность в разведениях 1:50, 1:100 и 1:500, а в серии 14 (введение СК до воздействия АХ) — в разведениях 1:50, 1:500, 1:10Э и 1:104 (и, очевидно, в разведении 1:100).
В целом, из результатов серий 13 и 14 следует, что 1) эффекты ЭБМХР достаточно универсальны, т.е. в соответствующих концентрациях ЭБМХР может блокировать любые М-ХР;
2) чувствительность разных М-ХР к ЭБМХР неодинакова (у М-ХР эндотелиоцитов она выше, чем у М-ХР миоцитов); 3) наличие ЭБМХР может существенно влиять на способность АХ
проявлять эндотелийзависимое расслабление. С этих позиций полагаем, что высокое содержание в крови у человека ЭБМХР повышает риск развития артериальной гипертензии.
Выводы.
1. В опытах с циркулярными полосками ПАК АХ за счет активации М-ХР эндотелиоцитов оказывает релаксирующий эффект. Этот эффект наблюдается на фоне базального тонуса и на фоне тонуса, вызванного ГРК или адреналином. Эффективность активации М-ХР эндотелиоцитов в условиях тонуса, вызванного адреналином, снижает сыворотка крови человека (в разведениях 1:50-1:104), что объясняется наличием в ней эндогенного блокатора М-холиноре-цепторов (ЭБМХР).
2. В регуляции тонической активности гладких мышц Г1АК важную роль играет NO, продуцируемый эндотелиоцитами. Он снижает тонические ответы полосок на гиперкалиевый (60 мМ КС1) раствор (на 16-40%) и на адреналин (10-6 г/мл; на 16-20%) и повышает вероятность проявления ацетилхолином вазорелакси-руюшего эффекта.
Литература.
1. ГланцС. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. - 459 с.
2. Демина Н.Л., Циркин В.И., Тарловская Е.И., Кашин РЮ. а- и ß-адрено- и М-холиномо-
дулирующая активность сыворотки крови при артериальной гипертензии // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2008. №2. С. 16-22.
3. Мальчикова С.В., Сизова Е.Н., Циркин В.И., Гуляева С.Ф., Трухин A.H., Ведерников
B.А. Изменение ß-адреносенсибилизирующей и М-холиноблокирующей активности сыворотки крови у пожилых людей при остром коронарном инциденте и под влиянием физических тренировок // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2003. №6. С,36-43.
4. Проказова Н.В., Звездина Н.Д., Суслова И.В., Коротаева A.A.. Турпаев Т.М. Влияние ли-зофосфатидилхолина на чувствительность сердца к ацетилхолину и параметры связывания хину клидинилбензилата с мембранами миокарда// Росс, физиол. журн. 1998. Т.84, №10. С.969-978.
5. Сизова Е.Н., Циркин В.И., Трухин А.Н. Наличие в крови и ликворе человека эндогенных модуляторов М-холинорецепторов. // Вестник Поморского ун-та. 2004. №6. С.22-31.
6. Сизова Е.Н., Циркин В.И. Физиологическая характеристика эндогенных модуляторов ß-адрено- и М-холинореактивности. Киров: ВСЭИ,2006.183с
7. Ткачук В.А. Рецепция и внутриклеточная сигнализация // Современный курс классической физиологии - М.: ГЭОТАР-Медиа. 2007.
C.325-348.
8. Хлыбова С.В., Циркин В.И., Дворянский С.А. Роль системы L-аргинина-оксида азота в регуляции висцеральных функций в обеспечении гестационного процесса. Киров: КГМА, 2007. 178 с.
9. Циркин В.И., Дворянский С. А., Ноздра-чев А.Д., Братухина С.В., Морозова М.А., Сизова Е.Н., Осокина A.A., Туманова Т.В., Шушка-нова Е.Г., Видякина Г.Я. Адреномодулирующие эффекты крови, ликвора, мочи, слюны и околоплодных вод человека // Доклады РАН. 1997. Т.352, №1. С. 124-126.
10. Циркин В.И., Ноздрачев А.Д., Сизова Е.Н., Дворянский С.А., Сазанова М.Л. Система эндогенной модуляции, регулирующая дея тельность периферических автономных нервных структур //Доклады РАН. 2002. Т.383, №5. С.6-98-701.
11. Циркин В.И., Кононова Т.Н., Сизова Е.Н., Попова И.В., Вахрушева A.C. О возможной роли эндогенных модуляторов ß-адрено- и М-холино-реактивности в патогенезе бронхиальной астмы //Пульмонология. 2007. №5. С.46-50.
12. Циркин В.И., Ноздрачев А.Д., Куншин A.A. Влияние сыворотки крови человека на М-холинореактивность гладких мышц желудка крысы // Доклады РАН. 2007. Т.414, №3. С.419-422.
13. Chelly J., Tsao G., Nath R.. Doursout M., Buckley J. Effects of norepinephrine on the dog
common carotid, coronary and renal arteries in vitro studies // Eur. J. Pharmacol. 1986. V. 120, №1. P. 137-139.
14. Enkhjargai B., Hashimoto M., Kinoshita H, Sakai Y. Characteristics of contractile activity in the renal artery of ovariectomized rats. // J. Smooth Muscle Res. 2008 . V.44, №1. P. 17-28.
15. Henrion D., Dowell F., Levy B., Michel J. In vitro alteration of aortic vascular reactivity in hypertension induced by chronic NG-nitro-1.-arginine methyl ester // Hypertension. 1996. V.28, №3. P.361-366'
16. Hesse I., Johns E. An in vivo study of the alpha-adrenoreceptor subtypes on the renal vasculature of the anaesthetized rabbit // J. Auton Pharmacol. 1984. V.4, №3. P. 145-152.
17. Lopez R.. Ortiz C., Ruiz A., Velez J., Castillo C., Castillo E.. Impairment of smooth muscle function of rat thoracic aorta in an endothelium-independent manner by long-term administration of N(G)-nitro-L-arginine methyl ester // Fundam. Clin. Pharmacol. 2004. V. 18, №6. P.669-677.
18. Makita Y. Effects of adrenoceptor agonists and antagonists on smooth muscle cells and neuromuscular transmission in the guinea-pig renal artery and vein // Brit. J. Pharmacol. 1983. V.80, JVs4. P.671-679.
19. Mendizabal V., Poblete I., Lomniczi A., Rettori V., Huidobro-Toro J., Adler-Graschinsky E. Nitric oxide synthase-independent release of nitric oxide induced by KCI in the perfused mesenteric bed of the rat. // Eur. J. Pharmacol. 2000. V.409, №1. P85-91.
20. Taniguchi J., Honda H., Shibusawa Y., Iw-ata T., Notoya Y. Alteration in endothelial function and modulation by treatment with pioglitazone in rabbit renal artery from short-term hypercholesterolemia. // Vascul. Pharmacol. 2005. V.43, №1. P.47-55.
21. Vanhoutte P Endothelium-derived free radicals: for worse and for better. // J. Clin. Invest. 2001 .V.107, №1. P.23-25.
22. Vuong T., de Kimpe S., de Roos R., Rabe-link T., Koomans H., Joles J. Albumin restores lys-ophosphatidylcholine-induced inhibition of vasodilatation in rat aorta// Kidney Int. 2001. V.60, Ar°3. P. 108 8-1096.
23. Wang S., DattaS., Segal S. Pregnancy alters adrenergic mechanisms in uterine arterioles of rats. // Anesth. Analg. 2002. V.94, №5. P. 1304-1309.
24. Whitney E., Menice C., Yeh J., Bagwell C, Jerius H., Brophy C. Renal artery smooth muscle is refractory to contraction by angiotensin II // J. Surg. Res. 1996. V.61, №2. P.307-310.
25. Zhang R., Rodrigues B., MacLeod K. Ly-sophosphatidylcholine potentiates phenylephrine responses in rat mesenteric arterial bed through modulation of thromboxane A2. // J. Pharmacol, Exp. Then 2006. V.3 I 7, №1. P.355-361.
Summary
HUMAN SERUM BLOOD IS CAPABLE TO BLOCK ACETYLCHOLINE ENDOTHELIUM DEPENDED RELAXATION EFFECTS IN EXPERIENCES WITH CIRCULAR STRIPS OF THE COW RENAL ARTERY RJu. Kashin, V.I. Tsirkin, A.A. Kostjaev In experiences with 574 circular strips of cow renal artery (CRA; n=52) it is established, that presence functionally active endothelium, producing NO, reduces their tonic responses on the hyperpotassium (60 mM KC1) solution (on 16-40 %) and on adrenaline (10-6 g/ml; on 16-20 %). Acetylcholine (5x10-5 g/ml) due to activation of endothelial M-cholinoreceptors (M-ChR). induced relaxation effect in conditions of basal tone and on the tone caused hyperpotassium (60 mM KC1) solution or adrenaline (10-6 g/ml). Efficiency of this activation as have shown experiences with adrenaline, reduces serum blood (in dissolution 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000 h 1:10000), that is explained presence in serum blood endogenous blocker of M-ChR (EBMChR). It is judged the important role NO which produced by endothelium and contained in serum blood EBMChR in regulation of tonic activity of CRA smooth muscles.
