CC BY
31Клиническая медицина
УДК 616
© 2011 Н.А. Лысов, А.П. Горис, Е.Г. Зарубина, С.В. Москвин
СВЯЗЬ СПОСОБНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ К ДЕФОРМАЦИИ СО СТРУКТУРНЫМИ ПЕРЕСТРОЙКАМИ МЕМБРАН КРАСНЫХ КЛЕТОК КРОВИ
У ЛИЦ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП
Физиологические возрастные изменения мембран эритроцитов затрагивают и липидную, и белковую компоненты мембраны эритроцитов. Выявленные нарушения приводят к изменению вязко-эластических свойств крови, что связано со снижением деформируемости эритроцитов, и к нарушению эритроцитарного звена микроциркуляции
Ключевые слова: деформируемость эритроцитов, старение эритроцитов, реологические свойства
Введение. Одним из важнейших свойств эритроцита является его способность к деформируемости. Главное значение для деформируемости эритроцитов имеют вязкостноэластичные свойства мембраны, которые определяются, прежде всего, состоянием спектри-но-актинового комплекса и его взаимодействием с другими структурными элементами мембраны, в частности, с липидным бислоем [1]. Деформируемость эритроцитов претерпевает значительные изменения с возрастом. В процессе старения эритроцитов происходит снижение функционального уровня реологических свойств красных клеток крови [2-3]. Это может быть связано с морфофункциональными изменениями в строении их мембран.
Цель исследования: определить основные изменения в состоянии и структуре липидной и белковой компонент мембран эритроцитов в разных возрастных группах, влияющих на деформируемость мембран эритроцитов.
Материал и методы исследования. Были обследованы практически здоровые люди (п=111) в возрасте от 20 до 59 лет, из них - 45 женщин и 66 мужчин. Для изучения возрастных особенностей эритроцитов все обследуемые люди были разбиты на четыре группы: от 20-29 лет; от 30-39 лет; от 40-49 лет; от 50-59 лет. Эритроциты получали из крови обследуемых людей путем пункции локтевой вены.
Определения микровязкости мембран по флюоресценции зонда пирена проводили по методу Г.Е.Добрецова [4], причем мономеры и эксимеры имеют четко различимые спектры флюоресценции с максимумом соответственно 390 и 480 нм. Индекс микровязкости мембран определяли как отношение флюоресценции пирена при 480 и 390 нм. Осмотическую резистентность эритроцитов определяли с помощью модифицированного метода В.К.Петрова [5] с применением антибиотика амфотерицина Б (АМТБ), основанного на его специфическом каналообразующем воздействии на липидную часть мембраны эритроцитов.
Для проведения исследований белков мембраны эритроцитов их трижды отмывали 0,9 % раствором хлорида натрия, затем гемолизировали, отмывку теней проводили по методу
I.Tannert [6]. Термообработку белкового препарата (в течение 5 минут) и электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na) проводили в ступенчатом градиенте плотности геля от 13,5 до 5 % в течение 5,5 часов. Гели окрашивали Кумасси G 250 бриллиантовым голубым, вымачивая в растворе красителя-фиксатора, содержащего 45 % метанола и 25 % уксусной кислоты в течение 12 часов, дифференцировали 10 % уксусной кислотой и денситометрировали. Количественную оценку содержания отдельных белковых фракций проводили методом взвешивания пиков.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica for Windows 6.0. Достоверность различий средних величин оценивали при уровне значимости p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. Сложность строения эритроцитов обусловливает зависимость их деформируемости от вязкости внутреннего содержимого и структурно-функционального состояния мембраны, причем, деформируемость клетки в большей степени связана с конформантными перестройками липидного бислоя. Об увеличении его вязкости в мембранах эритроцитов судили по изменению индекса микровязкости (табл.1), определяемому с помощью липотропного зонда пирена.
Таблица 1
Значение индекса микровязкости мембран эритроцитов у пациентов разных возрастных групп
Показатель I группа, n=31 II группа, n=29 III группа, n=28 IV группа, n=23
Индекс микровязкости мембран эритроцитов Q,88 і Q,Q2 Q,84 і Q,Q3* Q,62 і Q,Q1* Q,52 і Q,Q2*
*p<0,001 по сравнению со следующей группой
Было зарегистрировано достоверное (р<0,001) уменьшение индекса микровязкости мембран эритроцитов, коррелирующее с возрастом пациентов в ряду 1-11-Ш-1У группы. Обращает на себя внимание и тот факт, что статистически значимое снижение микровязкости липидов мембран эритроцитов происходит именно после 40 лет - на 35,5 %, после 50 лет это снижение не превышает 19,2 %. В качестве дополнительного критерия состояния липидного бислоя учитывалась степень гипотонического гемолиза эритроцитов в присутствии антибиотика АМТБ, обладающего специфическим каналообразующим воздействием на липидную часть мембраны.
Установлено, что все три используемые концентрации (0,006 %; 0,008 %; 0,01 %) АМТБ вызывали достоверно (р< 0,001) большую степень гемолиза в пробах эритроцитов у практически здоровых людей старших возрастных групп по сравнению с показателями пациентов I группы (табл.2).
Между чувствительностью эритроцитов обследованных групп к АМТБ и индексом микровязкости имеется отрицательная корреляционная связь (г=-0,94), то есть чем больше возрастает микровязкость их липидного бислоя, тем ниже их осмотическая резистентность. Это явление вполне закономерно, так как «жесткий» эритроцит менее эластичен и при проникновении в него жидкости из гипотонической среды (через образуемые АМТБ «каналы») разрушается быстрее, чем обычный.
Таблица 2
Осмотическая резистентность эритроцитов в присутствии АМТБ у пациентов разных групп
Группы наблюдения Количество гемолизированных эритроцитов в присутствии разных концентраций АМТБ, %
0,006 0,008 0,01
I группа, п=31 13,5 ± 0,1 16,9 ± 0,2 21,9 ± 0,2
II группа, п=29 14,8 ± 0,2 24,3 ± 0,1 34,3 ± 0,2
III группа, п=28 28,4 ± 0,2 49,9 ± 0,3 76,3 ± 0,6
IV группа, п=23 38,9 ± 0,4* 62,2 ± 0,7* 97,4 ± 0,6*
*р<0,001 по сравнению с 1-ой группой
Кроме того, как показал индекс микровязкости, у пациентов старших возрастных групп имеются изменения в структуре липидного бислоя (при старении изменяется липидный состав поверхностных мембран форменных элементов крови в пользу преобладания в мембране холестерина [7]), которые приводят, по-видимому, к образованию в эритроцитах у пациентов старших возрастных групп большего количества «каналов», чем в клетках лиц из групп «контроля» (1,11-я группы).
Поскольку деформируемость клеток контролируется мембранным белком спектрином, то логично предположить, что за уменьшение коэффициента деформируемости ответственны изменения количественного содержание и (или) изменения структуры взаимосвязи спектри-на в процессе жизнедеятельности клетки. Для подтверждения этого предположения нами были изучены характеристики белковой части мембран эритроцитов пациентов всех групп наблюдения.
Количественные изменения в белках эритроцитов у пациентов разных групп приведены в табл.3.
Таблица 3
Содержание белков в мембранах эритроцитов
Группы наблюдения Обозначения фракций белков Содержание фракций белков в мембранах Э, %
1 4,26 ± 0,1
2 2,75 ± 0,2
3 2,89 ± 0,2
I группа, п=31 4 4,36 ± 0,2
5 8,45 ± 0,2
6-10 17,98±0,4
11 8,76 ±0,4
Продолжение табл.3
12 23,57±0,6
13 24,61±0,5
1 4,11± 0,3
2 2,56±0,2
3 2,87±0,1
4 3,81±0,2
II группа, п=29 5 8,43±0,3
6-10 17,52±0,4
11 8,65±0,2
12 24,54±0,4
13 25,35±0,4
1 2,32±0,1*
2 2,37±0,2
III группа, п=28 3 2,29±0,2
4 2,75±0,5
5 8,36±0,6
6-10 16,21±0,5
11 8,41±0,4
12 23,62±0,2
13 29,65±0,8*
1 1,32±0,3*
2 2,17±0,1
3 2,18±0,5
4 2,37±0,2*
IV группа, п=23 5 6,34±0,6**
6-10 16,11±0,4
11 8,23±0,2
12 23,58±0,4
13 38,13±0,6**
*р<0,05 ,**р<0,001 по сравнению с группой контроля
Как видно из этой таблицы, относительное содержание высокомолекулярных скелетных белков спектринов (фракция 13) в первых двух группах статистически не отличается друг от друга. Спектрин является важным компонентом белковой сети (цитоскелета), поддерживающей структурную целостность и двояковогнутую форму эритроцитов. Именно цитоскелет, в основу которого входит спектрин, позволяет эритроцитам противостоять давлению на мембрану при прохождении через капилляры [8]. В то же время его избыток может привести к повышению ригидности клетки и нарушению деформируемости эритроцитов.
Повышение содержания - на 16,9 %(р<0,05) по сравнению с пациентами П-ой группы отмечено у лиц старше 40 лет, у пациентов старше 50 лет по сравнению с лицами первой и второй групп это увеличение составляет уже 50,4 % (р<0,001). Поскольку значительный удельный рост спектрина в мембране клеток приходится на возраст старше 50 лет, невозможно связать резкое увеличение жесткости мембран у лиц старше 40 лет с его увеличением.
Согласно современной классификации, белки с молекулярным весом 35 кД (4 фракция) включают в себя глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, важнейший фермент энергетического обмена эритроцита, локализованный на внутренней стороне мембраны. Содержание белка этой полосы достоверно (р<0,001) снижается в мембранах эритроцитов в направлении от I к IV группе, что может приводить к нарушениям энергетического обмена эритроцитов.
У всех пациентов старших возрастных групп нами зарегистрировано также уменьшение содержания глутатион-Б-трансферазы (фракция 1). Динамика количественного снижения фермента (в ряду ЫЫП-ГУ групп) аналогична динамике снижения 4 фракции. Возможно, что снижение ее активности сопряжено с увеличением активности процессов перекисного окисления липидов и изменением качественного состояния липидов мембран эритроцитов. Косвенным подтверждением этого является изменение динамики перекисного гемолиза в присутствии амфотеррицина В.
Содержание полосы с молекулярным весом 43 кД (фракция 5), идентифицируемых как актин, достоверно снижено (р<0,05) только у больных из IV группы.
Одновременное снижение содержания фактически всех белковых фракций с относительно низким молекулярным весом и локализованных на внутренней стороне мембраны эритроцитов отчасти может быть объяснено структурно-функциональными изменениями мембран эритроцитов с возрастом. Представляется вероятным, что нарушение структурной организации мембран ведет к ослаблению связей ряда белков с мембраной и более интенсивному их протеолизу и вымыванию из последней.
Выводы. Таким образом, снижение функционального уровня реологических свойств клеток в процессе их старения выражается в увеличении вязкости мембран клеток, ослаблении их антиоксидантных свойств и энергообмена, снижении их осмотической стойкости на фоне увеличения в структуре мембран количества белков цитоскелета и нарушения белковолипидных взаимодействий их мембран.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Байбеков И.М., Мавлян-Ходжиев Р.Ш., Эрстекис А.Г., Москвин С.В. Эритроциты в норме, патологии и при лазерных воздействиях. М. Тверь: «Издательство Триада», 2008. С. 4-8.
2. Муравьев А.В., Тихомирова И.А., Булаева С.В. и др. Изменение микрореологических свойств эритроцитов с возрастом: роль Са 2+ // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2007. № 4. Т.6. 61 с.
3. Снегирева Л.В., Иванов В.П. Реологические свойства эритроцитов в их онтогенезе //Курский научнопрактический вестник «Человек и его здоровье». 2007. № 1. 35 с.
4. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеидов. М.: « Издательство Наука», 1989. 277 с.
5. Петров В.К. Взаимодействие некоторых вазоактивных веществ с фосфолипидными и эритроцитарными мембранами // Фармакол. токсикол. 1985. № 2. Т. 48. С.72 - 77.
6. Tannert T.C., Lux K.Spreading of red cell bloodsuspensions on paper as a simple test of cell deformability // Acta biol.med.germ. 1981. V. 4Q. P. 739-742.
7. Ганелина И.Е., Денисенко А. Д., Катюхин Л.Н. Липиды плазмы крови и реологические свойства эритроцитов у больных со стабильной стенокардией // Кардиология. 2QQQ. № 8. Т. 4Q. С. б2-б3.
8. Ветчинникова О.Н., Плаксина Г.В., Гоpенков Р.В. Реологические и моpфологические показатели ^ови в оценке тяжести течения и эффективности лечения бpонхолегочных и сеpдечно-сосудистых заболеваний // Гематология и трансфузиология. 2QQ2. № 5. С. 29-33.
