CC BY
29
О. Н Макшакова, Д. А. Файзуллин, В. Д. Федотов
СВЯЗЬ МЕЖДУ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРОЙ а -ХИМОТРИПСИНА, СУСПЕНДИРОВАННОГО В СМЕСЯХ ВОДА-АЦЕТОНИТРИЛ
Методом ИК-спектроскопии исследовали вторичную структуру а-химотрипсина в смесях вода-ацетонитрил широкого состава. В области составов, где происходит денатурация белка, не наблюдается значительного изменения в общем содержании упорядоченных вторичных структур - а - спиралей и fi -слоев. Однако, кардинально меняется соотношение между конформационно различными видами укладки полипептидной цепи в пределах каждой из канонических структур. Наблюдается тесная корреляция между активностью химотрипсина и содержанием нативной fi -структуры в осадке.
Белки в присутствии органических растворителей проявляют уникальные свойства. В неводной среде меняется их энантио- и региоспецифичность, гидролитические ферменты приобретают способность катализировать реакции синтеза и т.д. Успехи в практическом применении подобных систем дали толчок к быстрому развитию нового направления биохимии -неводная энзимология [1]. Значительное число работ конца XX века посвящено исследованию каталитических свойств белков в водно-органических средах [2-4]. Функциональная активность фермента сильно зависит от природы растворителя и концентрации смеси. Получена масса зависимостей скорости реакции от состава реакционных смесей, предпринимались поиски корреляций активности ферментов и природы растворителя. Ряд работ посвящен поискам связи каталитической активности с состоянием вторичной и третичной структуры белка.
Методами кругового дихроизма и флуоресценции было показано, что изменения каталитической активности химотрипстна в неводных смесях с нерастворяющими белок органическими растворителями, связаны с изменениями в третичной структуры белка [4]. Установили, что распад третичной структуры ведет к инактивации фермента. В растворяющих белок органических растворителях обнаружена корреляция между активностью и содержанием упорядоченных вторичных структур в белке [5]. Попытки выявить подобную корреляцию для белков, суспендированных в различных водно- органических смесях, не дали удовлетворительных результатов [6-8].
Данная работа посвящена исследованию методом инфракрасной (ИК) спектроскопии отдельных компонент вторичной структуры а-химотрипсина и сопоставлению структурных изменений с каталитической активностью химотрипсина в водно-ацетонитрильных смесях.
Экспериментальная часть
Лиофилизованный препарат бычьего панкреатического а-химотрипсина фирмы Sigma (содержания жирных кислот не более 0.005 %) использовали без дополнительной очистки. Ацетонитрил очищали и осушали в соответствии с известными методиками [9]. Очищенный безводный ацетонитрил выдерживали над молекулярными ситами 3 Â.
ИК-спектры регистрировались на Фурье ИК-спектрометре УекЮг22 (Вгикег) при температуре 25°С в диапазоне 4000 - 1000 см 1 с разрешением 4 см'1, число сканов 256. Суспензии белка готовили следующим образом: навеску 10 мг лиофильно сухого порошка химотрипсина добавляли к 0,5 мл смеси ацетонитрил-вода различного состава (в интервале концентраций 0-100 об.% воды). В интервале концентраций 90 - 100 об.% воды белок растворялся полностью, в интервале 76 -82 об.% воды наблюдали три фазы - раствор, гель и твердый осадок, и в интервале 50 - 60 об.% воды образовывался раствор и осадок. При меньшем содержании воды белок практически весь оставался в осадке, и его присутствие в растворе на ИК-спектрах не обнаруживалось. Разделение фаз для анализа проводили способом центрифугирования.
ИК-спектры жидкой фазы и смесей вода - ацетонитрил того же состава, но не содержащих белок, снимали в разборной кювете из СаР2 с толщиной слоя 10 мк. Пробы твердой фазы, содержащие некоторое количество жидкости с общим объемом 20 мкл, помещали между двумя флюори-товыми окошками и регистрировали ИК-спектр, из которого затем вычитали спектр жидкой фазы. Полученные таким образом спектры химотрипсина в жидкой и твердой фазе обрабатывали, вычитая спектры растворов вода-ацетонитрил соответствующего состава, добиваясь компенсации поглощения ацетонитрила по полосе 2255 см'1, и затем, если это было необходимо, дополнительно вычитали спектр чистой воды в соответствии с критерием [10]. Тем не менее, при высоких концентрациях воды ее состояние в присутствии белка значительно отличается от ее состояния как в бинарной смеси, так и в объеме чистой воды, что делает невозможным компенсацию ее поглощения в области частот 1600 - 1700 см'1, где она перекрывается с полосой амид 1 белка. Анализ структуры в этом случае проводился лишь по полосе амид 3, где вклад воды незначителен.
Результаты
В связи с тем, что химотрипсин плохо растворяется в смесях вода-ацетонитрил и в области средних и высоких концентраций воды присутствует и в виде осадка, и в растворенном виде, логично рассмотреть изменения вторичной структуры в твердой и жидкой фазе отдельно.
Раствор. В водно-ацетонитрильных смесях различной концентрации спектральные характеристики химотрипсина значительно изменяются. Спектры второй производной для жидкой фазы трехкомпонентной системы белок - вода - ацеторнитрил в областях амид 1 (1600 - 1700 см’1) и амид 3 (1200 - 1350 см'1) показывают значительное изменение структуры. Так, Р-струкгура химотриисина из конформации нативного типа, поглощающей на частоте 1639 см'1 (амид 1) или 1234 см'1 (амид 3), в значительной своей части преобразуется в конформацию, образованную межмолекулярными водородными связями и характерную для агрегированного белка, с поглощением на частотах 1620 - 1615 см'1 (амид 1) или 1218 -1222 см'1 (амид 3). Для определения доли содержания отдельных типов вторичной структуры спектры в этих областях раскладывали на компоненты в виде гауссиановских кривых методом подгонки.
На рисунке 1 представлены зависимости процентного содержания отдельных вторичных структур а-химотрипсина жидкой фазы в смеси в зависимости от концентрации воды.
Суммарное содержание Р-структуры химотрипсина в пределах погрешности измерений остается постоянным. Суммарное поглощение спиральных структур при изменении содержания воды от 100 до 75 об.% изменяется сложным образом, сначала возрастая от 12% до 24% и затем понижаясь до 20%. При этом положение и форма, а также число полос поглощения отдельных структур в спектре амид 3 варьируют весьма существенно, указывая на значительные изменения в конформации белка.
О ------1----1----1----1---1----'----1----'----1----'----1---->
75 80 85 90 95 100
Концентрация воды, % об.
Рис. 1 - Процентная доля содержания суммарных а-, Р~, неупорядоченной структуры и поворотов химотрипсина (обозначения соответственно белые квадраты, черные квадраты, черные треугольники, белые треугольники) в жидкой фазе в смесях вода - ацетонитрил от объемной концентрации воды
На рисунке 2 приведены зависимости относительного поглощения различных компонент а-структуры. Как можно заключить, содержание «нативной» а-структуры, поглощающей на 1320 - 1316 см'1, при изменении концентрации воды от 100 до 75 об.% несколько уменьшается, но при этом резко (от 0 до 8%) возрастает содержание спиральных структур, не характерных для нативного состояния. Увеличение «нативной» а-структуры происходит в области роста ферментативной активности химотрипсина. Общий рост спи-ральности сопровождается падением содержания одного из типов Р-поворотов, поглощающих на частоте около 1298 см'1 и. возможно, представляющих собой концевые участки нативных а-спиралей. Изменение содержания Р-слоев и неупорядоченной структуры не проявляют общих тенденций с ростом активности.
Осадок. На рисунке 3 представлены спектры второй производной для твердого химотрипсина в виде осадка в спектральной области амид 1. Как и в растворе спектральные характеристики химотрипсина в осадке сильно изменяются. В зависимости от содержания воды в системе максимум интенсивности поглощения варьирует между частотами, характерными для нативной (1635 - 1639 см'1) и агрегационной (1615 - 1620 см'1) Р-структуры.
На рисунке 4 приведены зависимости процентного содержания вторичной структуры на частотах поглощения Р-структур - нативной и агрегационной - твердой фазы белка. Содержание структур определялось, как описывалось выше, разложением спектра в области амид 1 на компоненты. Доля нативной Р-структуры падает в области концентраций воды в смеси 50 - 80 %. Одновременно растет уровень агрегационной структуры. Во всем диапазоне концентраций нативная и агрегационная Р-структура антикоррелируют друг с другом. При этом общий уровень Р-структуры в белковом препарате остается постоянным.
О 20 40 60 80 100
Концентрация воды, % об
Рис. 4 - Зависимость доли вторичной структуры химогрипсина (осадок) в смесях вода - ацетонитрил от содержания воды по спектрам области амид 1. При концентрации воды 100% приведены значения для водного раствора химотрипсина. Темные квадраты - нативная Р-структура, светлые квадраты - агрегационная Р* сгруктура, поглощающие в районе частот 1635 см'1 и 1621 см'1, соответственно, треугольники - активность фермента (из работы |3])
Обсуждение результатов
В ряде работ метод ИК-спектроскопии применялся к исследованию изменений вторичной структуры белков в органических растворителях [5-8,11]. Предпринимались попытки найти корреляции между степенью активности фермента и содержанием упорядоченных структур - а-спиралей и Р-слоев - в органических растворителях, растворяющих и не растворяющих белок. Для растворяющих белок растворителей, то есть растворителей, с которыми белок образует растворы, на примере распространенного модельного белка суб-тилизина Карлсберг, обнаружили определенное соответствие. Если упорядоченные вторичные структуры субтилизина, растворенного в органическом растворителе, не меняются по сравнению с водой (например, в глицерине), то активность фермента сохраняется [5]. Это ситуация сильно отличается от белковых суспензий в органических растворителях, где не найдено никакой корреляции между активностью и вторичной структурой. Это указывает на фундаментальное различие между двумя типами белковых систем [5]. В ряде органических растворителей суспендированный белок сохраняет вторичную структуру, количественно определенную как содержание отдельно альфа и бета структуры, как и в сухом белке. Однако проявляемая каталитическая активность по отношению к этиловому эфиру 1М-ацетил-Ь-фенилаланина меняется в широких пределах. Есть исключение, когда сохраняется очень высокая степень активности при структурных изменениях, выходящих за пределы ошибки. Лишь в ДМСО можно сказать, что полная инактивация обусловлена тотальным разрушением вторичной структуры. Таким образом, исключается причинная взаимосвязь двух явлений [8]. Также не удачными оказались попытки найти корреляции активно-
сти с количеством остаточной воды в высушенном белке или в реакционной среде органического растворителя [7].
Наши результаты показывают, что растворенный белок, в области где фермент присутствует в жидкой фазе, сохраняет содержание отдельных структур а-спирали, Р-слоев, поворотов и неупорядоченной практически постоянным вплоть до максимальных концентраций воды, то есть чистой воды, где фермент имеет нативную структуру. В структурных зависимостях наблюдается, в общем, лишь некоторое уменьшение доли спиралей и сим-батное увеличение доли неупорядоченных структур. Несмотря на то, что содержание структур практически не меняется, активность химотрипсина в этой области изменяется от О до 1. Зависимости отдельных компонентов структур в растворе вода-ацетонитрил варьируют с большой амплитудой. И наблюдается общая тенденция роста активности и восстановления «нативной» спирали, при падении доли спиральной компоненты, не свойственной нативному химотрипсину.
Содержание отдельных типов вторичной структуры в твердой фазе белка во всем диапазоне концентраций водно-ацетонитрильных смесей также остается постоянным. В то время как, содержание отдельных компонентов упорядоченных структур меняется от концентрации. Характер изменения количества Р-слоев, поглощающих на частоте нативной структуры, имеет схожий вид с зависимостями степени активности. Обратно им меняется содержание не нативной агрегационной Р-структуры.
Итак, при денатурации а-химотрипсина в смесях вода - ацетонитрил не происходит значительного изменения в содержании упорядоченных типов вторичной структуры - спиралей и р-слоев, однако, кардинально меняется соотношение между конформационно различными видами укладки полипептидной цепи в пределах каждой из канонических структур. Таким образом, суммарное содержание упорядоченных структур не может считаться достаточной характеристикой состояния белка и должно дополняться качественным описанием отдельных конформационных составляющих.
Литература
1. Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями // Биохимия. 1998. Т.63. №3 С.408-421.
2. Zaks A. Klibanov A.M. //J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.3194-3201.
3. Tomiuchi Y., Kijima Т., Kise H.//Bull. Chem. Soc. Jap. 1993. V.66. P.l 176-1181.
4. Sasaki Т., KobayashiM„ Kise H.II Biotechnology Techniques. 1997. V. 11. P.387-390.
5. Xu K., GriebenowK, KlibanovA.M.IIBiotech Bioeng. 1997.V.56. P.485-491.
6. GriebenowK, KlibanovA.M. Hi ACS,. 1996. V.l 18. P.l 1695-11700.
7. DongA., Meyer J.D., KendrickB.S. et.al. //Arch. Biochem. Biophys. 1996. V.334. P.406-414.
8. GriebenowK, KlibanovA.M. IIBiotech. Bioeng. 1997. V.53. P.351-362.
9. PerrinD.D., Armagero W.L.F., PerrinD.R Purification of Laboratory Chemicals. Oxford. 1980.
10. Dong, A., Huang, P., Caughey, W.S. II Biochemistry. 1990 V.29. P.3303-3308.
11. GriebenowK, VidalM., Baez C. et al. //J ACS. 2001. 123.5380-5381.
© О. H. Макшакова - мл. науч. сотр., асп. лаб. молекулярной биофизики Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН; Д. А. Файзуллин - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. той же лаборатории; В. Д. Федотов - д-р физ.-мат. наук, проф., чл.-кор. АНТ, зав. лаб. молекулярной биофизики Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН.
