CC BY
10УДК 577.152.632.754.1:633.11
СВОЙСТВА НАТИВНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРОТЕИНАЗ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ КЛОПА ВРЕДНАЯ ЧЕРЕПАШКА (EURYGASTER INTEGRICEPS PUT ), ГИДРОЛИЗУЮЩИХ
КЛЕЙКОВИНУ ПШЕНИЦЫ
Ал.В. Конарев*, В.В. Долгих*, И.В. Сендерский*, Л.И. Нефедова*, А.В. Конарев**, Н.К. Губарева**
*Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург **Всероссийсшй НИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова, Санкт-Петербург
Вредная черепашка и другие хлебные клопы рода Eurygaster Lap. наносят огромный ущерб качеству зерна пшеницы в России, Европе и на Ближнем Востоке. Протеиназы слюнных желез данных клопов, гид-ролизующие основные белки клейковины пшеницы - глиадины и глютеины и ухудшающие качество муки, являются экономически важными факторами вредоносности, а также представляют интерес как потенциальные маркеры для диагностики повреждения зерна и модификаторы клейковины. Для разработки подходов к снижению ущерба от действия ферментов вредителя необходимо изучение их природных и реком-бинантных форм. С помощью электрофореза, хроматографии и изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в сочетании с методом глютениновой реплики сопоставлены свойства гидролизующих глютенин протеиназ из слюнных желез клопов и поврежденных зерен, собранных в различных регионах России и Турции. Обнаружено, что в слюнных железах вредной черепашки синтезируется сложный комплекс гидролизующих клейковину протеолитических ферментов, в котором преобладают формы с молекулярной массой 28-31 кДа. В поврежденном зерне присутствуют сериновые протеиназы с молекулярной массой около 28 кДа. Протеиназы, выявляемые после ИЭФ белков поврежденного зерна с помощью глютениновой реплики, лишь частично совпадают с протеиназами слюнных желез по компонентному составу. Протеиназы, выделенные из образцов поврежденного зерна различного происхождения, сходны по молекулярной массе и способности гидролизовать глютенины пшеницы, но отличаются по составу компонентов при ИЭФ. С использованием трех вариантов гетерологичной экспрессии в клетках бактерий и дрожжей получен ряд активных форм одной из протеиназ, синтезируемых в слюнных железах клопа. Показано, что наиболее близкой к природным протеиназам по изоточке и специфичности является форма, экспрессированная в дрожжах в виде зимогена с сигнальным пептидом. Результаты исследований расширяют представления о пищеварительных протеиназах хлебных клопов и могут быть использованы при решении широкого круга проблем защиты растений и в пищевых технологиях.
Ключевые слова: вредная черепашка, слюнная железа, поврежденное зерно, протеиназа, клейковина, глютенин, глютениновая реплика, гетерологичная экспрессия, Pichiapastoris, рекомбинантный фермент.
Вредная черепашка Eurygaster integriceps Put. и другие хлебные клопы рода Eurygaster Lap. наносят огромный ущерб качеству зерна пшеницы в России, Европе и на Ближнем Востоке (Critchley, 1998; Алехин, 2002; Sivri et al., 2002; Vaccino et al., 2006; Павлюшин и др., 2010). Данные вредители при питании вводят в эндосперм секреты слюнных желез, содержащие карбогидразы, протеиназы и другие пищеварительные ферменты, и затем всасывают частично гидролизованные белки и углеводы. Помимо общего снижения количественных параметров урожая, а также всхожести поврежденных семян (Капусткина, Нефедова, 2013), оставшиеся в них в следовых количествах протеиназы способны нарушить процесс формирования клейковины при замесе теста, что негативно сказывается на качестве хлеба и других изделий из муки пшеницы (Hariri et al.,
2000; Талонов и др., 2009; Каменченко и др., 2010; Torbica et al., 2014). Действие протеиназ клопов выражается в гидролизе главных белков клейковины - глиадинов и глютенинов. В последнее время наблюдается расширение ареала хлебных клопов и усугубление связанных с ними проблем. Среди возможных экологически безопасных подходов к снижению потерь, вызываемых хлебными клопами, можно выделить использование устойчивых сортов. Эта устойчивость может базироваться на различных факторах (Вилкова, Конарев, 2010; Крупнов, 2011), в т.ч. на особенностях состава и структуры запасных белков зерна пшеницы (Fatehi et al., 2008; Werteker, Kramreither, 2008). Известны примеры создания устойчивых к вредителям и болезням форм растений, в которые были внедрены гены белковых ингибиторов пищеварительных протеиназ и дру-
гих гидролаз (Dunaevsky et al., 2005; Мосолов, Валуева, 2008; Gatehouse, 2011; Jamal et al., 2012). Однако в отношении хлебных клопов такой подход пока невозможен вследствие того, что протеиназы их слюнных желез малочувствительны к известным ингибиторам из растений (Konarev et al., 2011). В медицине при необходимости подавить патологическую активность определенной протеиназы конструируют ее специфичный ингибитор, взяв за основу одну их известных форм. Например, обнаруженный нами ранее циклический ингибитор трипсина из подсолнечника SFTI-1 (Luckett et al., 1999; Konarev et al., 2000) модифицируют для придания ему активности к протеиназам, активность которых возрастает при различных патологиях (Avrutina et al., 2012; Zoller et al., 2012). Ингибиторы протеи-наз также конструируют на основе антител, специфичных к их активному центру (Ganesan et al., 2010). Подобные подходы могут быть применены и при решении задач защиты растений, поскольку гены ингибиторов протеиназ могут быть встроены в геном растений для блокирования активности чужеродных проте-иназ.
Поиск более эффективных путей к снижению ущерба от действия протеиназ хлебных клопов невозможен без их детального изучения. Исследования ферментов клопов, повреждающих клейковину, ведутся с первой половины XX века как в России, так и за рубежом (Blagoveschensky, Sossiedov, 1933; Kretovich, 1944; Вилкова и Буринская, 1977; Sivri et al., 2000). Однако лишь недавно удалось частично охарактеризовать некоторые из них - пролил-эндопротеазу (Darkoh, 2010), возможно специфичную к глиадинам, и трипсиноподобную протеиназу, гидролизующую высокомолекулярные субъединицы глютенина (HMW-Gn), белки, ответственные за наиболее важные качества клейковины (Konarev et al., 2011). Та-
Методика
Образцы зерна пшеницы, поврежденного вредной черепашкой и другими клопами рода Eurygaster Lap. урожая 2004-2012 гг., получены из различных регионов России и Турции: образец мягкой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Тарасовская 87 (Ростовская область), смеси образцов различных сортов пшеницы из Ростовской области и смежных регионов России (См1), Самарской области (См2), а также сортов мягкой (Ikizce, Bayraktar) и твердой
Вестник защиты растений, 2, 2014 кая задержка отчасти может быть объяснена спецификой свойств протеиназ клопов и отсутствием простых методов их анализа. Помимо деструктивной роли данных протеиназ в отношении хлебопечения, также представляет интерес возможность их использования как модификаторов белков клейковины в пищевых технологиях (Olanca, Sivri, 2010) и в медицине для снижения токсичности компонентов клейковины пшеницы в отношении чувствительных к ним людей, в т.ч. страдающих от опасного заболевания - целиакии (Konarev et al., 2011; Pena, 2014; Gasbarrini et al., 2014) наряду с другими протеиназами насекомых, грибов и растений (Elpidina, Goptar, 2007; Stenman et al., 2009; Mika et al., 2013). Выявленная нами ранее специфичность протеиназ черепашки к высокомолекулярным субъединицам глютенина пшеницы, в частности к эпитопам, иммуногенным для ряда пациентов (Konarev et al., 2011), указывает на принципиальную возможность использования данных ферментов вредителя в сочетании с другими протеиназами, более специфичными к основным иммуногенным белкам клейковины -глиадинам. Для исследований в связи с перечисленными выше проблемами необходимо располагать достаточным количеством очищенной протеиназы насекомого, чего можно добиться, в частности, за счет получения ее рекомбинантных форм. Однако последние не всегда полностью соответствуют по свойствам природным (нативным) формам. Целью работы было охарактеризовать по свойствам и изменчивости природные протеиназы вредной черепашки и родственных ей клопов, выделенные из слюнных желез и поврежденных зерен, отработать подходы к получению активных рекомбинантных форм данных ферментов, а также сопоставить свойства нативных и рекомбинантных про-теиназ.
исследований
T. durum Desf. (сорт Ege-88) пшеницы из Турции. Смесь См2 составлена из изначально неповрежденных зерен, на которых в течение четырех дней в лабораторных условиях питались имаго вредной черепашки, собранные в Самарской области. Поврежденные и неповрежденные зерна отбирались из образцов по принятой в ВИЗР методике. Неповрежденные зерна использовались в качестве контроля. Слюнные железы выделяли из имаго вредной чере-
пашки E. intrgriceps (Павловский 1957; Konarev et al.,
2011), полученных из различных регионов Поволжья (Самарской и Саратовской областей) и Северного Кавказа (Ставропольский край). Отбор клопов из Ставропольского края по морфотипам проводили по С.Р.Фасулати (2010).
Белковые фракции, содержащие протеиназы, экстрагировали из размолотых поврежденных зерен 0.01% Triton X-100 (1:5) в течение 20 мин. Для изофокусирования (ИЭФ) препараты концентрировали осаждением в ацетоне с последующим растворением преципитата в 0.01% Triton X-100 в объеме, эквивалентном весу зерна. Слюнные железы от 10 особей гомогенизировали с 50 мкл 1% CHAPS и центрифугировали. Над осад очную жидкость хранили при -20°С с 50% глицерином.
ИЭФ белков проводили в пластинах 5% полиакрила-мидного геля (ПААГ) с амфолинами pH 5-8 на приборе Multiphor II (LKB) или в пластинах Phast Gel pH 5-8 на приборе Phast System (Pharmacia) (Konarev, Lovegrove,
2012). При фракционировании препаратов протеиназ на гель в области анода с помощью бумажных полосок наносили 0.2-3 мкл экстракта. После ИЭФ протеиназы выявляли с помощью варианта метода глютениновой реплики, основанного на гидролизе растворимой в уксусной кислоте фракции данного белка (Конарев и др. 2013). Электрофорез белков с додецилсульфатом натрия в полиакрила-мидном геле (ДСН-ПААГЭ) проводили в пластинах гомогенных 12% или градиентных (8-25 и 10-15%) полиакри-ламидных гелей по U.K.Laemmly (1970) или протоколам фирмы Pharmacia с последующим окрашиванием красителями Кумасси (R-250 или G-250) или серебром.
Активность гидролизующих клейковину протеиназ определяли модифицированным полуколичественным микрометодом ДСН-седиментации клейковины (Konarev et al., 2013).
Наличие глютенин-гидролизующей активности у анализируемых белков выявляли также с помощью микромода, включающего инкубацию муки из неповрежденного зерна пшеницы с протеиназой, центрифугирование, экстракцию белков из осадка буфером нанесения, содержащим меркаптоэтанол, с последующим ДСН-ПААГЭ. Субстратом служили компоненты высокомолекулярных субъединиц глютенина (HMW-Gn) определенных сортов пшеницы, легко гидролизуемые протеиназами черепашки, а электрофорез осуществляли в компактных Phast гелях. Это позволило использовать для анализа минимальные количества субстрата (1 -2 мг муки) и фермента. О наличии активности судили по ослаблению (по сравнению с контролем без фермента) или исчезновению компонентов HMW-Gn. Параллельно ставили пробы с суммарным препаратом протеиназ вредной черепашки, выделенным из поврежденных зерен пшеницы или обогащенным аффинной хроматографией на иммобилизованном ингбиторе химотрипсина I из картофеля (ИХт-I; Konarev et al., 2011). Для сравнения субстратной специфичности изучаемые протеиназы инкубировали с набором рекомбинантных пептидных аналогов HMW-Gn, отличающихся по структуре повторяющихся последовательностей (Wellner et al., 2006), и анализировали результаты гидролиза с помощью ДСН-ПААГЭ.
Для препаративного фракционирования белков зерна и насекомых применяли гель-фильтрацию и ионообмен-
ную хроматографию (Konarev et al., 2011). Для очистки протеиназ из слюнных желез клопов использовали микропрепаративное ИЭФ в ПААГ. Экстракт из гомогенизированных слюнных желез наносили на пластину геля 100x125 мм с помощью полосы фильтровальной бумаги 10x90 мм, наложенной вдоль анода на расстоянии 1 см от него. Проводили ИЭФ в интервале pH 5-8 и выявляли протеиназы с помощью узких полосок глютеиновой реплики. Соответствующие зоны геля вырезали, измельчали и экстрагировали из них протеиназы раствором, содержащим 15% этанол, 0.7% CHAPS и 0.1% трифторуксусную кислоту, а затем раствором, содержащим 15% этанол и 0.01М этаноламин (по 30 мин). Экстракты объединяли и концентрировали центрифугированием в ячейках Centricon 10 ("Millipore").
Для очистки рекомбинантных ферментов применяли препаративное изофокусирование в слое гранулированного геля Ultrodex (LKB, Швеция) в интервале pH 5-8 с последующим выявлением компонента протеиназы с помощью полосок глютеиновой реплики. Протеиназу элюиро-вали на колонке из соответствующего участка геля 0.01% тритоном X-100 и концентрировали добавлением сухого сефадекса G-25 или в ячейках Centricon 10.
Для гетерологичной экспрессии глютенин гидроли-зующей протеиназы (GHP), синтезируемой в слюнных железах вредной черепашки, использовали полученный в ходе предыдущей работы (Konarev et al., 2011) препарат кДНК, кодирующий сигнальный пептид, пропептид и зрелый фермент изоформы 3 (GHP3; GenBank: HM579787.1).
Для осуществления гетерологичной экспрессии зрелой формы протеиназы GHP3 в бактериях E. coli белок-кодирующая последовательность была ампли-фицирована с помощью прямого праймера 5'ATGCCTCGAGATTGTCGGCGGTTCTCAGGCGCT3', соответствующего N-концевому участку фермента без сигнального пептида и продомена. Обратный праймер 5' AGTCGAATTCTTACTTCGATTTCTTTGACATC 3' строго соответствовал С-концевому участку молекулы. Для встраивания фрагмента ДНК в экспрессирующий вектор в 5' концевые участки праймеров включали сайты ферментов рестрикции XhoI и EcoRI (отмечены подчеркиванием). Реакционная смесь для ПЦР кроме 1 мкл кДНК содержала 67 мМ Трис-HCl (pH 8.б), 2.5 мМ MgCb , 16.6 мМ (NH4)2SO4, 0.5 мМ каждого дНТФ, 10 пмоль прайме-ров, 2.5 Е Pfu ДНК полимеразы (Fermentas, Литва). Матрицу денатурировали 3 мин при 94°С и ДНК амплифици-ровали в течении 30 циклов, каждый из которых включал денатурацию (94°С, 30 сек), отжиг (58°С, 30 сек) и синтез (72°С, 2 мин). Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в агарозе и фрагмент ДНК размером около 800850 пн выделяли из геля с помощью технологии GENECLEAN®. Очищенный фрагмент встраивали в экс-прессирующий вектор pRSETA (Invitrogen, США) по сайтам XhoI и EcoRI с использованием Т4 ДНК лигазы (Fermentas, Литва). Секвенирование полученной конструкции с помощью T7 прямого и обратного праймеров подтвердило 100% идентичность клонированной последовательности гену протеазы клопа, а также ее корректное встраивание в экспрессирующий вектор.
Экспрессию зрелой формы протеиназы в бактериях осуществляли с использованием штамма С41 E. coli, созданного для эффективной наработки белков на основе
клеток BL21(DE3) (Dolgikh et al., 2011). Свежие колонии бактерий, трансформированных полученной конструкцией, инокулировали в среду LB, содержащую ампицилин (100 мкг/мл), и культуру растили при 37°С до оптической плотности 0.6 (измерение при длине волны 600 нм). После добавления в среду в качестве специфичного индуктора экспрессии изопропил-Р-О-тиогалакто-пиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ инкубацию продолжали в течение ночи. Бактерии осаждали центрифугированием при 3000 g 10 мин, отмывали дистиллированной водой и разрушали ультразвуком в 50 мМ Трис-НС1 буфере (рН 8.0). Рекомбинантную форму фермента, накапливающуюся в бактериях в виде нерастворимых белковых включений, осаждали центрифугированием при 1500 g 10 мин, отмывали тем же раствором и хранили при -20°С или сразу экстрагировали в присутствии 8М мочевины.
Процедура рефолдинга, имевшая целью получение активной формы протеиназы, включала растворение телец включения в 8 M мочевине, диализ против трис-HCl буфера pH 8.5 с 30 mM DTT, диализ против буфера и концентрирование, инкубацию рекомбинантного белка с энтеро-киназой (Novagen, США) для отделения вспомогательной полигистидиновой последовательности и диализ против Трис-HCl буфера pH 10.5 с 2M мочевиной и 1.25 mM/0.25 mM восстановленного/окисленного глутатиона при 4°С в течение ночи.
Для выяснения внутриклеточной локализации реком-бинантного белка бактерий осаждали из жидкой культуры с помощью центрифугирования при 3000 g 10 мин и разрушали ультразвуком на льду в присутствии 50 мМ Трис-HQ (pH 8.0) буфера. Гомогенат центрифугировали при 18000 g 10 мин и осадок ресуспендировали в 50 мМ Трис-HQ (pH 8.0) буфере. Рекомбинантный продукт выявляли в полученных фракциях с помощью иммуноблоттинга с антителами против полигистидиновой последовательности (Sigma-Aldrich).
Для получения поликлональных антител белковые включения солюбилизировали в присутствии 8М мочевины, приготовленной на 50 мМ Трис-HCl буфере (pH 7.4). Нерастворимый дебрис удаляли с помощью центрифугирования, а супернатант диализовали против 100 объемов буфера ТБС pH 7.4. Диализат смешивали с равным объемом адъюванта Фрейнда (Sigma-Aldrich, США) (полный для первой инъекции и неполный для последующих) и иммунизировали кроликов с помощью четырех внутримышечных инъекций по 0.3 мг белка с десятидневным интервалом. Через 10 дней после последней иммунизации было отобрано 15 мл крови.
Для очистки специфичных антител 0.5 мг рекомби-нантного белка разделяли с помощью ДДС-ПААГЭ в 12% геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, США) и окрашивали с помощью Понсо. Полоски мембраны, соответствующие перенесенному белку, вырезали, отмывали ТТБС (50 мМ Трис-Hd (pH 8.0), 0.3 M NaCl, 0.05% Твин-20), блокировали 1 час при комнатной температуре в ТТБС в присутствии 1% БСА и инкубировали с 50 мл иммунной сыворотки, разведенной 1:5 в ТТБС, в течение 12 часов. Мембраны тщательно отмывали ТТБС и затем ТБС (ТТБС без добавления Твин-20). Антитела элюировали в 250 мкл 0.2 M глицин-HCl (pH 2.5) и нейтрализовали добавлением 15 мкл 1M Tрис и 2.5 мкл 5M NaCl. Элюцию повторяли несколько раз, фракции объ-
Вестник защиты растений, 2, 2014 единяли, концентрировали с помощью концентраторов Centricon и очищенные антитела хранили при -20°С в присутствии БСА (1 мг/мл) и 50% глицерина. Полученные антитела использовали в иммуноблоттинге для выявления нативных и рекомбинантных форм протеиназы GHP3 после ДДС-ПААГЭ и ИЭФ белков.
При экспрессии зрелой формы протеиназы в метило-трофных дрожжах P. pastoris белок-кодирующая последовательность была слита с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид альфа-фактора дрожжей, входящей в состав вектора pPIC9 (Invitrogen, США). Данная плазмида была создана для наработки белков, секретируе-мых в среду для культивирования. Поскольку сайт XhoI вектора pPIC9 находится внутри последовательности, кодирующей сигнальный пептид альфа-фактора дрожжей, для ПЦР-амплификации белок-кодирующей последовательности был подобран прямой праймер
5'ACGACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATTGTCG GCGGTTCTCAGGCGCT3', в котором непосредственно за сайтом XhoI (отмечено подчеркиванием) была добавлена последовательность, необходимая для секреции рекомби-нантного белка, но удаляемая при разрезании вектора по сайтам XhoI/EcoRI.
Последовательность, кодирующая зрелый фермент, была амплифицирована с использованием в качестве матрицы плазмиды для бактериальной экспрессии (см. выше). Линеаризованную с помощью фермента SacI плазмиду ш встроенным геном очищали с помощью последовательной экстракции фенолом (1 раз), хлороформом (2 раза), переосаждали спиртом, растворяли в воде и переносили в дрожжевые клетки GS115 с помощью электропоратора 2510 (Eppendorf, Германия). Клетки высевали на твердую минимальную среду MD (1.34% YNB, 4 х10"5 биотин, 2% глюкоза) и растили двое суток при 28°С. Эффективность рекомбинации полученной конструкции в геном дрожжей анализировали с помощью ПЦР (Ling et al., 1995) с использованием тех же праймеров.
Для осуществления экспрессии протеиназы клопа ПЦР-положительные трансформанты, а также отрицательный контроль инокулировали в 10 мл среды BMGY (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 мМ К-фосфатный буфер (pH 6.0), 1.34% азотной основы для дрожжей (YNB), 4 10"5°° биотина, 1% глицерола) и культивировали 2 дня при 28°С. Выросшие клетки осаждали центрифугированием, а среду BMGY, содержащую глицерин в качестве источника углерода, заменяли на 10 мл среды ВММУ с таким же содержанием метилового спирта - индуктора промотора гена AOX1, контролирующего экспрессию изучаемого белка. Инкубацию продолжали в течение 2 суток, добавляя на второй день свежую порцию метанола до конечной концентрации 0.5%. После осаждения клеток при 2000 g 10 мин, культуральную жидкость концентрировали приблизительно в 20 раз с помощью ячеек Centricon и анализировали с помощью ДСН-ПААГЭ и иммуноблоттинга с полученными ранее антителами.
Для экспрессии полноразмерной кДНК, кодирующей сигнальный пептид, продомен и зрелый фермент, последовательность была амплифицирована с помощью праймеров, строго соответствующих 5' и 3'- концевым участкам гена. Для этого был синтезирован прямой праймер
5'CCATAGATCTATGCGGTGTACATTGGTACTGGT3',
Вестник защиты растений. 2. 2014 содержащий сайт рестриктазы Б§1И (подчеркнут). ПЦР-амплифицированная копия гена была встроена в вектор рР1С3.5, не содержащий какого-либо сигнального пептида, по сайтам БашШ и ЕооШ, поскольку ферменты Б§1И и БашШ генерируют комплементарные липкие концы.
Трансформацию клеток Р. раяХоопя (штамм 08115), метанол-индуцируемую экспрессию белка, концентриро-
Результаты
Использование ИЭФ в сочетании с методом реплики, где в качестве субстрата для протеиназ использовался тонкий слой растворимого в уксусной кислоте глютенина, позволило сопоставить компонентный состав гидролизующих глютенин протеиназ
вание и анализ культуральной жидкости осуществляли с помощью методов, описанных в предыдущем разделе.
Активацию профермента (зимогена) осуществляли путем инкубации сконцентрированной культуральной жидкости (250 мкл) с 1 мг препарата иммобилизованного трипсина Trypsin Enzygel (Boehringer Mannheim) в 50 mM Трис-HCl буфере pH 8.5 в течение 2 часов.
исследований
из ряда образцов зерна пшеницы, поврежденного клопами рода Eurygaster, полученных из различных регионов России и Турции (анализировались навески зерна), а также слюнных желез вредной черепашки (рис. 1).
Рис. 1. Анализ гетерогенности и изменчивости гидролизующих глютенин протеиназ из слюнных желез вредной черепашки и родственных ей видов рода Eurygaster Lap. и из поврежденных ими зерен разных сортов мягкой и твердой пшеницы. Водорастворимые белки разделены методом ИЭФ в пластине ПААГ и протеиназы выявлены с помощью глютениновой реплики. 1, 13 и 14 - смесь поврежденных зерен разных сортов пшеницы из Ростовской области и смежных регионов России (См1); 2, 3, 10, 30 и 31, сорт Ikizce, Турция (2, 10 и 30 - поврежденные, а 3 и 31 - неповрежденные зерна); 4, 5 и 11 - сорт Bayraktar, Турция (4 и 11 - поврежденные и 5 - неповрежденные зерна); 6, 7, 8 и 12 сорт EGE-88 (T. durum), Турция (6, 8 и 12 поврежденные и 7 - неповрежденные зерна); 15 - сорт Тарасовская 87, Россия, поврежденные зерна; 16 и19, смесь зерен различных сортов пшкеицы (См2, Россия), на которых питались имаго вредной черепашки; 17.18 и 21-28 - слюнные железы имаго клопов: 17 и 21-25, морфотипы из Ставропольского края: 17 и 21 морфотип № 1; 22 и 23 - № 2; 24 - № 3, 25 - черная экоформа. 18, 26 и 27 - клопы из Самарской, а 28 - из Саратовской области. Б и В - фрагменты реплики A с обозначениями компонентов протеиназ. 9, 20 и 29 -пустые дорожки. 7.4 - позиция маркера ИЭТ, ~5.0 - ориентировочное значение ИЭТ.
Экстракты из поврежденных зерен и слюнных желез дали четкие спектры гидролизующих глютенин протеиназ. В свою очередь в неповрежденных зернах (дорожки 3, 5, 7 и 31) компоненты протеиназ не выявлялись. Изо-электирческие точки (ИЭТ) большинства компонентов из поврежденных зерен находились в интервале рН от 6 до 7.5. ИЭТ компонентов протеиназ из слюнных желез, в целом, несколько выше. Лишь некоторые из компонентов протеиназ, выделенных из российских образцов поврежденного зерна, отчетливо сов-
падали по ИЭТ с компонентами из слюнных желез. Очевидно сходство двух компонентов протеиназ из образца, на котором питались клопы (дорожки 16 и 19), с отдельными компонентами протеиназ из слюнных желез (дорожки 17 и 18). Возможно, что не все компоненты протеиназ секретируются в зерно из слюнных желез в исходном состоянии или в созревшем зерне сохраняются лишь отдельные фракции протеиназ. Спектры протеиназ из российских образцов зерна, поврежденного вредной черепашкой, в целом совпадали меж-
ду собой, а также с отдельными компонентами протеиназ образца твердой пшеницы сорта Ege-88 из Турции (дорожка 12). Остальные компоненты образца Ege-88 соответствовали по ИЭТ протеиназам двух других образцов из Турции. Последние не имели компонентов, общих с российскими образцами. Возможно, образец Ege-88 повреждался формой клопа, промежуточной между E. integriceps и каким-то другим видом рода Eurygaster, обитающим в Турции. Нельзя исключить также, что на поле, где был собран образец, помимо вредной черепашки присутствовали другие виды клопов.
Эти результаты совпадают с теми, что описаны в другой нашей работе (Конарев и др., 2013), где изменчивость протеиназ описана более детально.
ИЭФ спектры протеиназ из слюнных желез клопов, собранных в трех регионах России, в целом незначительно различались между собой, за исключением компонента "V" (рис. 1В), который выявлялся в железах клопов из Поволжья, но отсутствовал или был ослаблен в материале из Ставропольского края. Интересно, что соответствующий по ИЭТ компонент протеиназы встречался во всех изученных образцах зерна из разных регионов России (рис. 1Б,:Г). Анализ трех (№ 1-3) из четырех известных морфотипов клопов не обнаружил различий между ними по составу протеи-наз слюнных желез (дорожки 21-24), а в железах из черной экоформы протеиназы не выявлялись (дорожка 25).
Для сравнительного изучения физико-химических свойств протеиназ из слюнных желез вредной черепашки и зерен, поврежденных ею или другими представителями рода Eurygaster, был опробован ряд методов фракционирования и очистки. Результаты ДСН-ПААГЭ полученных фракций белков показаны на рисунке 2.
После гель-фильтрации белков слюнных желез одна из фракций оказалась практически гомогенной и содержала лишь один полипептид с молекулярной массой около 31 кДа (дорожка 4). Он соответствовал компоненту, преобладающему в суммарном спектре белков слюнных желез (дорожка 2). Его относительная близость по размеру известным серино-вым трипсиноподобным протеиназам насеко-
Вестник защиты растений, 2, 2014 мых и млекопитающих допускала вероятность того, что он также является протеиназой. Ко времени начала этих исследований нами было установлено, что протеиназы слюнных желез клопа слабо реагируют с известными белковыми ингибиторами протеиназ, в отличие от сериновых протеиназ многих других насекомых.
Рис. 2. ДСН-ПААГЭ отдельных фракций белков слюнных желез вредной черепашки (2-7) и поврежденного зерна пшеницы (8-13) 1 - белки маркеры молекулярной массы (в кДа); 2 -экстракт из слюнных желез; 3 и 4 фракции, полученные гель-фильтрацией; 5 - фракция, элюирован-ная с иммобилизованного ингибитора химотрипси-на I из картофеля (ИХт-I) 0.015М HCl; 6 и 7 - фракции после препаративного ИЭФ. 8-10 - фракции белков поврежденного зерна, элюированные с ИХт-I: 8 - сорт Ege-88; 9 - Bayraktar; 10 - смесь поврежденных семян разных сортов из России (См1); 11, фракция, элюированная с ИХт-I (дорожка 10), дополнительно очищенная гель-фильтрацией. 11-12 -фракции белков с протеолитической активностью, полученные ионообменной хроматографией. Стрелкой указано положение компонента протеиназы, соответствующего тому, что был частично секвенирован (Konarev et al., 2011). Гель окрашен серебром.
Однако было известно, что активность протеиназы другого вредителя пшеницы -клопа Nysius huttoni White (Lygaeidae) из Новой Зеландии, также повреждающего клейковину пшеницы, подавляется ингибитором хи-мотрипсина I (Every et al., 2005). Это позволило использовать данный ингибитор в качестве лиганда для выделения протеиназы слюнных желез черепашки методом аффинной хроматографии. Экстракт слюнных желез был пропущен нами через колонку с ингибитором, а связавшиеся белки были элюированы 0.01М HCl. Главный белковый компонент, содержащийся
в элюате (дорожка 5), соответствовал по размеру полипептиду, выявленному после гель фильтрации (дорожка 4). Третий подход включал фракционирование белков слюнных желез микропрепаративным ИЭФ в ПААГ с последующим выявлением компонентов гид-ролизующих глютенин протеиназ по активности с использованием глютениновой реплики.
Зоны геля с признаками протеолитической активности были вырезаны и содержащиеся в них белки экстрагированы. Данные фракции (дорожки 6 и 7) содержали полипептид, соответствующий по размеру компонентам спектров 2-5, а также полипептид с меньшей массой (дорожка 7).Указанный подход оказался неэффективным при выделении протеиназ из поврежденного зерна ввиду низкого содержания искомого компонента относительно белков зерна. В свою очередь, метод аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным ингибитором химотрипсина из картофеля
I оказался более результативным (дорожки 810). Интересно, что из образцов поврежденного зерна из России и Турции были выделены сходные по размеру компоненты. Дополнительная очистка с помощью гель-фильтрации позволила удалить низкомолекулярные пептиды и дала практически гомогенный белок с молекулярной массой несколько ниже 30 кД (дорожка 11). Важно отметить, что фракции, представленные на дорожках 7-11, обладали глютенин-гидролизующей активностью. Очевидно сходство данного компонента с меньшим из двух компонентов спектра белков слюнных желез, выделенных методом ИЭФ (дорожка 7). Наличие во фракции белков слюнных желез, обладающей протеолитиче-ской активностью, двух компонентов, отличающихся по молекулярной массе на 3-4 кДа, и сходство одного из них с протеиназой из поврежденного зерна позволяет предположить, что полипептиды на дорожке 7 представляют собой зимоген и зрелый фермент. Полипептид, выделенный из поврежденных зерен, соответствующий тому, что показан на дорожке
II (позиция указана стрелкой), был частично секвенирован в другой нашей работе (Копагеу й а1., 2011), что позволило в итоге определить его полную аминокислотную последовательность и установить его принадлежность к
трипсиноподобным сериновым протеиназам. Интересно, что протеиназы из российских и турецких образцов поврежденного зерна, отличавшиеся при ИЭФ по составу и ИЭТ компонентов, в ДСН-ПААГЭ дали сходные полосы, что свидетельствует о близости данных ферментов по размеру полипептидов. Результаты секвенирования позволили сконструировать праймеры, с помощью которых на основе мРНК слюнных желез клопов, питавшихся зерном, были полученны кДНК, кодирующие ряд изоформ гидролизующей глютенин протеиназы. Одна из них (GenBank: HM579787.1), кодирующая изоформу 3 (GHP3), была использована в следующей части настоящей работы для получения рекомбинантных форм фермента.
Были опробованы три варианта получения рекомбинантных протеиназ черепашки. Один включал проведение гетерологичной экспрессии белка в клетках бактерий E. coli, а два других - в клетках метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. Вначале бактерии (штамм С41) трансформировали плазмидой pRSETA со встроенной последовательностью кДНК, кодирующей зрелую форму протеиназы GHP3 без сигнального пептида и пропептида.
Иммуноблоттинг с антителами против вспомогательной полигистидиновой последовательности, кодируемой используемым вектором и присоединенной к целевому белку с N-конца, показал, что полученный в результате экспрессии рекомбинантный продукт накапливается в клетках в виде нерастворимых белковых включений, что типично для большинства чужеродных белков, экспресси-руемых в бактериях, тогда как в растворимой фракции разрушенных ультразвуком бактерий данный белок не обнаруживался (рис. 3A).
Белковые включения, состоящие преимущественно из зрелой формы протеиназы черепашки, были растворены в 8М мочевине (рис. 1Б) и использованы при иммунизации кроликов для получения поликлональных специфичных антител. Методом иммуноблоттинга было установлено, что данные антитела реагируют как с самим рекомбинантным белком (рис. 3В, дорожка 1), так и с белком слюнных желез вредной черепашки с молекулярной массой около 28 кДа, соответствующей про-теиназе GHP3 (рис. 3В,2). Рекомбинантная и нативная протеиназы отличались по молеку-
лярной массе, что связано с присутствием вспомогательного М-концевого пептида в составе экспрессированного белка.
28°С
37°С
кДа 1- 2- 1+ 2+
11666 - » f 1
45- ■ I
35- •
25- • Л. %
А
1- 2- 1+ 2+
М 1
1 2
♦
116-
66-
45-
35- I
, 25-
18- m
13- -
• 926745-
I >-f<
Вестник защиты растений, 2, 2014 ния как окисленная и восстановленная форма глутатиона, аргинин, полиэтиленгликоль и т.д. Нами были испробованы различные варианты рефолдинга, но только один из них, описанный в разделе "Методика", привел к положительному результату (рис. 4).
в
Рис. 3. Выявление рекомбинантного продукта среди белков бактерии E. coli после экспрессии зрелой формы протеиназы вредной черепашки методом ДСН-ПААГЭ. А. 1 - супернатант после центрифугирования разрушенных ультразвуком бактерий (растворимые белки бактерий); 2 - осадки после центрифугирования; "+" - инкубация бактерий в присутствии и "-" - в отсутствии индуктора. Белки растворены перед ДСН-ПААГЭ буфером нанесения с меркаптоэтанолом. Иммуноблоттинг с антителами к полигистидиновой последовательности.
Б. Зрелая форма протеиназы экстрагирована из белковых включений в присутствии 8М мочевины и нанесена на гель в буфере с меркаптоэтанолом (1). Гель окрашен Кумасси R-250. M - маркеры молекулярной массы (в кДа).
В. 1 - зрелая форма протеиназы, экстрагированная из белковых включений 8M мочевиной; 2 - белки слюнных желез вредной черепашки. Имму-ноблоттинг с антителами к рекомбинантной зрелой форме протеиназы.
Поскольку экспрессированная в бактериях зрелая форма протеиназы черепашки не обладала протеолитической активностью, были использованы различные подходы для восстановления естественной конформации (рефол-динга) рекомбинантного продукта. Стандартными этапами восстановления нативной кон-формации денатурированного белка являются растворение белковых включений в присутствии 8М мочевины или 6М гуанидин-HQ и постепенное или быстрое снижение концентрации детергента вплоть до его удаления в ходе диализа. Часто в состав смеси для рефол-динга вводят такие дополнительные соедине-
Рис. 4. Обработка энтерокиназой продукта экспрессии в E. coli зрелой формы протеиназы вредной черепашки (А) и выявление активности у полученного продукта (РП-1) после рефолдинга (Б). ДСН-ПААГЭ белков в 8-25% Phast геле с последующей окраской Кумасси G-250.
А. Белки, экстрагированные из телец включения 8 ММ мочевиной до (1 и 2) и после (3-5) обработки энтерокиназой. а - исходный полипептид, соответствующий экспрессированной протеиназе; b и с -полипептиды, появившиеся после обработки.
Б. Муку пшеницы из неповрежденных зерен сорта Ege-88 инкубировали с препаратом, представленным на дорожках 3-5 геля А после рефолдинга (1), трис-HCl буфером pH 8.5 (2, контроль) и нативной протеиназой вредной черепашки, выделенной из поврежденных зерен (3), после чего из осадка экстрагировали белки, которые разделяли ДСН-ПААГЭ. РП-1 соответствует компоненту "b".
Под действием энтерокиназы у части исходного рекомбинантного белка (компонент "a" (рис. 3А) вспомогательная последовательность была отщеплена. Это привело к появлению компонентов "b" и "c", видимо соответствующих зрелой форме протеиназы и вспомогательному пептиду (с) соответственно (рис. 3А, дорожки 3-5). Инкубация муки пшеницы с препаратом рекомбинантного белка после рефолдинга (рис. 3Б, дорожка 1), как и с нативной протеиназой черепашки (дорожка 3), привела к ослаблению (частичному гидролизу) компонентов высокомолекулярных субъединиц глютенина (HMW-Gn) 1Bx7 и 1By8
Вестник защиты растений. 2. 2014 твердой пшеницы сорта Ege-88. Таким образом, нами была показана принципиальная возможность получения активной формы ре-комбинантной протеиназы вредной черепашки (обозначенной нами как РП-1) посредством гетерологичной экспрессии в бактериях последовательности, кодирующей зрелый фермент без профермента. Однако, нам не удалось добиться выхода конечного активного продукта в количестве, достаточном для изучения свойств протеиназы. Одной из причин этого могло быть наличие в составе рекомби-нантной молекулы дополнительного N концевого пептида, кодируемого вектором рЯ8ЕТ, имеющего размер около 4 кДа. По-видимому, конформация пептида ограничивала доступ энтерокиназы к сайту гидролиза и замедляла его отщепление от каталитического домена.
Одним из достоинств гетерологичной экспрессии белков высших организмов в бактериях, в целом, является высокий выход конечного продукта, однако он зачастую производится в форме, малопригодной для восстановления активности белка, что и имело место в нашей работе. Однако этот продукт нашел применение при получении антител.
Известно, что клетки эукариотических организмов способны осуществлять более корректную укладку (фолдинг) и процессинг синтезируемых молекул белков животных, чем клетки бактерий. В связи с этим на следующем этапе исследования была предпринята попытка экспрессии зрелой формы протеина-зы в клетках эукариотических микроорганизмов - метилотрофных дрожжевых грибов Р. pastoris. Еще одним преимуществом использования дрожжевых систем экспрессии является возможность секреции нарабатываемого чужеродного продукта за пределы клетки (и получения его в растворимой форме), если он содержит экзогенный или собственный эндогенный сигнальный пептид, ответственный за его секрецию. Конструкция, несущая последовательность, кодирующую зрелую форму фермента, слитую с экзогенным сигнальным пептидом альфа-фактора дрожжей, была ис-
пользована для трансформации клеток P. pastoris. Это позволило получить как ПЦР-положительные колонии, в клетках которых произошла рекомбинация полученной конструкции в дрожжевой геном, так и ПЦР-негативные колонии, использованные в качестве отрицательного контроля в данном эксперименте. Как показал анализ концентрированной культуральной жидкости с помощью ДСН-ПААГЭ и иммуноблоттинга, рост дрожжевых клеток в среде БМ0У и последующее добавление в среду метилового спирта - индуктора промотора гена AOX1 привели к специфичному накоплению белка размером около 28 кДа - рекомбинантной протеиназы 2 (РП-2) в культуральной жидкости в случае ПЦР-положительных клонов, но не в случае отрицательного контроля.
Анализ культуральной жидкости, содержащей белок РП-2, с помощью ИЭФ в комбинации с методом глютениновой реплики выявил компонент с ИЭТ около 6.5, обладающий протеолитической активностью (рис. 5, дорожка 6).
1 2 3 4 5 6 7 С -!Р
М -
*
Рис. 5. Выявление активности у рекомбинант-ных протеиназ РП-2 и РП-3 слюнных желез вредной черепашки, экспрессированных в клетках P. pastoris. Белки поврежденного зерна (дорожки 1 и 7), культуральной жидкости, содержащей протеи-назу РП-3 (2-5) и протеиназу РП-2 (6), разделены методом ИЭФ и протеиназы идентифицированы с помощью глютениновой реплики. Белки треков 2-5 предварительно обработаны иммобилизованным трипсином в течение 10, 60 и 120 мин. М и С - позиции белков метчиков ИЭТ (7.3 и 10.6 соответственно).
Важно отметить, что компонент протеина-зы выявлялся лишь в среде, полученной после инокуляции колоний P. pastoris, для которых присутствие изучаемого гена было подтверждено с помощью ПЦР. Однако ИЭТ реком-бинантной протеиназы была существенно ниже, чем у главных компонентов протеиназ из поврежденных зерен (рис. 5, 1 и 7). Это отличие может быть следствием неодинаковых условий осуществления укладки нативных и рекомбинантных полипептидных цепей после их синтеза в клетках насекомых и дрожжей. Кроме того, в составе данного варианта ре-комбинантного продукта отсутствовал про-пептид, необходимый для правильного формирования структуры многих серино-вых протеиназ.
Исходя из этого была осуществлена гете-рологичная экспрессия в P. pastoris последовательности, кодирующей полноразмерный фермент с сигнальным пептидом, пропепти-дом и зрелой протеиназой. Существенной проблемой данного подхода является то, что протеиназа синтезируется в форме неактивного зимогена. В природных условиях в пищеварительных органах животных зимоген превращается в активный фермент под действием автолиза или другой протеиназы, например энтерокиназа преобразует трипсино-ген в трипсин, отщепляя гексапептидную последовательность с М-конца зимогена. Подобный фермент для протеиназы вИР3 неизвестен, а ее субстратная специфичность и аминокислотная последовательность, установленные ранее (Konarev е! а1., 2011), делают вариант автолиза маловероятным. Исходя из данных по первичной структуре вИРЗ, а именно наличия остатка аргинина в С-конце пропеп-тида, мы предположили, что пропептид может быть отделен обработкой трипсином, как и в случае зимогенов ряда других сериновых протеиназ (Такауата е! а1., 1997).
Экспрессия в клетках P. pastoris копии кДНК, кодирующей полноразмерную протеи-назу, по данным электрофореза и имму-
Вестник защиты растений, 2, 2014 ноблоттинга, сопровождалась специфичным накоплением в культуральной жидкости белка с молекулярной массой около 33 кДа. Инкубация с иммобилизованным трипсином привела к появлению в культуральной жидкости нового компонента (РП-3) с молекулярной массой около 28 кДа, что соответствовало размеру протеиназы РП-2, экспрессированной без про-пептида. Это сопровождалось появлением в обработанной культуральной жидкости про-теолитической активности, выявляемой с помощью глютениновой реплики после ИЭФ белков (рис. 5, дорожки 4 и 5). Компонент, соответствующий РП-3, был ближе к нативной протеиназе по ИЭТ, чем РП-2. В необработанной трипсином или обработанной в течение слишком короткого времени (10 мин) культу-ральной жидкости активные компоненты не обнаруживались (дорожки 2 и 3). Все три полученные активные рекомбинантные формы протеиназы (РП-1, РП-2 и РП-3) по размеру были близки к величине, рассчитанной для природной вИР3 на основании анализа аминокислотной последовательности, а также электрофоретическим компонентам очищенной протеиназы вредной черепашки из поврежденных зерен пшеницы (рис. 2, треки 8-11), и одному из компонентов белков, выделенных из слюнных желез (трек 7). Протеина-зы РП-2 и РП-3, как и описанная выше про-теиназа РП-1 (рис. 4), обладали способностью гидролизовать высокомолекулярные субъединицы глютенина разных сортов мягкой и твердой пшеницы.
Ранее было установлено, что протеиназа, выделенная из зерен, поврежденных вредной черепашкой, специфично гидролизует связь между гекса- и нонапептидными повторяющимися последовательностями НМ^^ви (Konarev е! а1., 2011). В настоящей работе изучаемые протеиназы были сопоставлены по способности гидролизовать рекомбинантные модельные аналоги НМ^^ви, созданные N.We11ner и др. (2006) и отличающиеся по аминокислотным последовательностям повторяющихся элементов (рис. 6).
М 0 2 24 48 0 2 24 48 О 2 24 48 О 2 24 48 0 2 24 0 2 24 0 2 24 0 2 24
4
А* • • Ж Гч^ , л' ' 99
А Б В Г Д Е Ж 3
Рис. 6. Гидролиз модельных аналогов глютенина и глиадина нативными и рекомбинантными протеина-зами вредной черепашки. Белки после инкубации с протеиназами в течение 0-48 часов разделены ДСН-электрофорезом, гели окрашены кумасси 0-250. Гели А, Б и Д - полипептид R1N5; В и Е - R1X5; Г - Я3Ш; Ж - А6; З - глиадин. Белки инкубированы с протеиназами из поврежденного зерна (А), РП-2 (Б, В и Г) и очищенной РП-3 (Д-З).
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о жить, что гидролизующие глютеинин протеи-
том, что в слюнных железах вредной черепашки синтезируется сложный комплекс гид-ролизующих клейковину протеолитических ферментов, в котором преобладают формы с молекулярной массой 28-31 кДа, причем более высокомолекулярные формы, возможно, являются зимогенами. В зерне, поврежденном данным вредителем, присутствуют сериновые протеиназы с молекулярной массой около 28 кДа. Протеиназы, выявляемые в поврежденном зерне с помощью глютениновой реплики после ИЭФ белков, лишь частично совпадают с протеиназами слюнных желез по компонентному составу. Это может быть связано с вторичными модификациями протеиназ при секреции, отличиями в составе протеиназ, присутствующих в слюнных железах, и секрете, вводимом в зерно при питании, а также неодинаковой способностью компонентов секрета сохранять активность при созревании и хранении поврежденного зерна. Протеиназы, выделенные из образцов зерна, поврежденного клопами рода Eurygaster в России и Турции, сходны по молекулярной массе и способности гидролизовать глютенины пшеницы, но отличаются по составу компонентов при ИЭФ. Эти результаты, как и данные наших предыдущих исследований, позволяют предполо-
назы представителей рода Eurygaster различного происхождения имеют, в целом, сходную структуру, а незначительные отличия связаны с отдельными аминокислотными заменами и вторичными модификациями.
Возможности дальнейшего изучения свойств протеиназ вредной черепашки могут существенно расшириться за счет использования их рекомбинантных форм. В результате исследований установлено, что гетерологич-ная экспрессия фермента в клетках дрожжей P.pastoris в форме зимогена с собственным сигнальным пептидом и последующим отщеплением пропептида трипсином позволяет получить активную форму гидролизующей глютенин протеиназы черепашки, близкую по свойствам природной протеиназе слюнных желез, и, таким образом, наиболее пригодную для дальнейших исследований. Активная форма, полученная экспрессией зрелой проте-иназы в дрожжах, в большей степени отличается от природной протеиназы по свойствам и специфичности. Экспрессия в бактериях также позволяет получить активный фермент, однако для практического использования данный подход требует доработки. Результаты проведенных исследований расширяют представления о пищеварительных протеиназах хлебных
клопов и могут быть использованы при решении широкого круга проблем защиты растений и в пищевых технологиях.
Вестник защиты растений, 2, 2014 Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 1208-00885).
Авторы благодарны докторам J.Marsh, A.Lovegrove и профессору P.Shewry (Rothamsted Research, Великобритания) за предоставление пептидных аналогов глютенина и препаратов ДНК и профессорам D. Sivri Ozay и H.Koksel (Hacettepe University, Турция) за образцы поврежденного зерна.
Алехин В.Т. Вредная черепашка // Защита и карантин растений, 2002, 4, с. 65(1)-91(27).
Вилкова H.A., Экман-Буринская Н.В. Некоторые аспекты белкового питания вредной черепашки Eurygaster integriceps Put. на различных по устойчивости сортах пшеницы.// Труды ВИЗР, 1977, 52, с. 39-44.
Вилкова Н. А., Конарев А. В. Современные проблемы иммунитета растений к вредителям // Вестник защиты растений, 2010, 3, с. 3-15.
Гапонов С. Н., Васильчук Н. С., Шутарева Г. И. Влияние вредной черепашки (Eurygaster integriceps Put.) на качество зерна твердой пшеницы (Triticum durum Desf.) // Аграрный вестник Юго-Востока, 2009, 2, с. 23-26.
Каменченко С.Е., Лебедев В.Б., Наумова Т.В. Вредоносность клопа вредная черепашка (Eurygaster integriceps) и качество зерна // Аграрный вестник Юго-Востока, 2010, 1, с. 36-37.
Капусткина А.В., Нефедова Л.И. Прорастание и морфогенез семян пшеницы при повреждении вредной черепашкой // Вестник защиты растений, 2013, 2, с. 48-55.
Конарев Ал.В., Конарев А.В., Нефедова Л.И., Губарева Н.К., Д.Сиври Озай. Анализ полиморфизма гидроли-зующих клейковину протеиназ в зерновках пшеницы, поврежденных вредной черепашкой Eurygaster integriceps Put. и родственными ей клопами // Доклады РАСХН, 2013, 5, с. 7-11.
Крупнов В. А. Селекция пшеницы на устойчивость к вредным клопам (Eurygaster spp.): нет ли риска? // Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, 15, 3, с. 572-578.
Мосолов В. В., Валуева Т. А. // Ингибиторы протеи-наз в биотехнологии растений. Прикл. биохим. и микро-биол, 2008, 44, 3, с. 261-269.
Павловский E.H. Методы ручного анатомирования насекомых. М., Л.: Изд-во АН СССР, 1957, 87 с.
Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Сухорученко Г.И., Нефедова Л.И. Вредная черепашка: распространение, вредоносность, методы контроля // Защита и карантин растений, 2010, 1, с. 53(1)-84(32).
Фасулати С. Р. Формирование внутривидовой структуры у насекомых в условиях агроэкосистем на примерах колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say, 1824 (Coleoptera, Chrysomelidae) и вредной черепашки Eurygaster integriceps Puton, 1881 (Heteroptera, Scutelleridae) // Науковий вюник Ужгородського ушверситету. Серия Бюлоггя, 2010, 29, с. 13-27.
Avrutina O., Fittler H., Glotzbach B., Kolmar H., Empt-
ing M. Between two worlds: a comparative study on in vitro and in silico inhibition of trypsin and matriptase by redox-stable SFTI-1 variants at near physiological pH // Organic and Biomolecular Chemistry, 2012, 10, 38, p. 7753-7762.
Blagoveschensky A.V., Sossiedov N.I. The gluten-dissolving ferment of wheat and barley seeds // Biochemical Journal, 1933, 27, 5, p. 1575-1577.
Critchley B.R. Literature review of sunn pest Eurygaster integriceps Put. (Hemiptera, Scutelleridae) // Crop Protection, 1998, 17, 4. p. 271-287.
Darkoh C., El-Bouhssini M., Baum M. and Clack B. Characterisation of a prolyl endoprotease from Eurygaster in-tegriceps Puton (Sunn pest) infested wheat // Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 2010, 74, 3, p. 163-178.
Dewar D.H., Amato M., Ellis H.J., Pollock E.L., Gonza-lez-Cinca N., Wieser H., & Ciclitira, P. J. The toxicity of high molecular weight glutenin subunits of wheat to patients with coeliac disease // European Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2006, 18, 5, p. 483-491. '
Dolgikh V.V., Senderskiy I.V., Pavlova O.A., Naumov A.M., Beznoussenko G.V. Immunolocalization of an alternative respiratory chain in Antonospora (Paranosema) locustae spores: Mitosomes retain their role in microsporidial energy metabolism // Eukaryotic cell, 2011, 10, 4, p. 588-593.
Dunaevsky Ya.E., Elpidina E.N., Vinokurov K.S., Beloz-ersky M.A. Protease inhibitors in improvement of plant resistance to pathogens and insects // Molecular Biology, 2005, 39, 4, p. 608-613.
Elpidina E., Goptar I. Digestive peptidases in Tenebrio molitor and possibility of use to treat celiac disease // Ento-mol. Res., 2007, 37, p.139-147.
Every D., Sutton K.H., Shewry P.R., Tatham A.S., Cool-bear T. Specificity of action of an insect proteinase purified from wheat grain infested by the New Zealand wheat bug, Ny-sius huttoni // J. Cereal Sci., 2005, 42, p. 185-191.
Fatehi F., Behamta M. R., Zali A.A. Evaluating the resistance to sunn pest (Eurygaster integriceps Put.) and its relationship with high-molecular-weight glutenin subunit in wheat. Proc. 11th Int. Wheat Genet. Symp., Brisbane, Australia, Sydney University Press, 2008, 3, p. 741-743.
Ganesan R., Eigenbrot C., Kirchhofer D. Structural and mechanistic insight into how antibodies inhibit serine proteases // Biochem J., 2010., 430, 2, p. 179-189.
Gasbarrini G.B., Mangiola F., Gerardi V., Ianiro G., Corazza G.R., & Gasbarrini A. Coeliac disease: an old or a new disease? History of a pathology. // Internal and Emergency Medicine, 2014, 9, p. 1-8.
Gatehouse J.A. Prospects for using proteinase inhibitors to protect transgenic plants against attack by herbivorous insects // Current Protein and Peptide Science, 2011, 12, 5, p. 409-416.
Hariri G., Williams P.C., Jaby E.L., Haramein F. Influence of Pentatomidae insects on the physical dough properties and two layered flat-bread baking quality of Syrian wheat // J.Cereal Sci., 2000, 31, p.111-118.
Jamal F., Pandey P.K., Singh D., Khan M.Y. Serine protease inhibitors in plants: nature's arsenal crafted for insect predators // Phytochemistry Reviews, 2012, p. 1-34.
Konarev A.V., Anisimova I.N., Gavrilova V.A., Rozhko-va V.T., Fido R., Tatham A.S., P. R. Shewry // Novel proteinase inhibitors in seeds of sunflower (Helianthus annuus L.): polymorphism, inheritance and properties // Theoretical and Applied Genetics, 2000, 100, 1, p. 82-88.
Konarev A.V., Beaudoin F., Marsh J., Vilkova N.A., Nefedova L.I., Sivri D., Koksel H., Shewry P.R., Lovegrove A. Characterization of a glutenin-specific serine proteinase of sunn bug Eurygaster integricepts Put. // Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59, 6, p. 2462-2470.
Konarev A.V., Lovegrove A. Novel detection methods used in conjunction with affinity chromatography for the identification and purification of hydrolytic enzymes or enzyme inhibitors from insects and plants // In: Magdeldin S. (Ed.) Affinity Chromatography, InTech, 2012, p. 187-210.
Kretovich V.L. Biochemistry of the damage to grain by the wheat-bug // Cereal Chem., 1944, 21, p. 1-16.
Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 1970, 227 (5259), p. 680-685.
Ling M., Merante F., Robinson B.H. A rapid and reliable DNA preparation method for screening a large number of yeast clones by polymerase chain reaction // Nucleic Acids Res., 1995, 23, p. 4924-4925.
Luckett S., Garcia R.S., Barker J.J., Konarev A.V., Shewry P.R., Clarke A.R., Brady R.L. High-resolution structure of a potent, cyclic proteinase inhibitor from sunflower seeds // Journal of molecular biology, 1999, 290, 2, p. 525-533.
Mika N., Zorn H., Ruhl M. Insect-derived enzymes: a treasure for industrial biotechnology and food biotechnology. In Yellow Biotechnology II, Springer Berlin Heidelberg, 2013, p. 1-17.
Olanca B., Sivri Ozay D. Preparation and functional properties of gluten hydrolysates with wheat-bug (Eurygaster spp.) protease // Cereal Chemistry, 2010, 87, 6, p. 518-523.
Pena A.S. Immunogenetics of non celiac gluten sensitivi-
ty //Gastroenterology and Hepatology From Bed to Bench, 2014, 7, 1, p. 1-5.
Salis L., Goula M., Izquierdo J., Gordún E. Population density and distribution of wheat bugs infesting durum wheat in Sardinia, Italy // Journal of Insect Science, 2013, 13, 50.
Sivri D., Koksel H. Characterisation and partial purification of gluten hydrolysing proteinase from bug (Eurygaster spp.) damaged wheat // In Wheat Gluten, Royal Society of Chemistry: London, 2000, p. 526-530.
Sivri D., Sapirstein H. D., Bushuk W., Koksel H. Wheat intercultivar differences in susceptibility of glutenin protein to effects of bug (Eurygaster integriceps) protease // Cereal Chemistry, 2002, 79, 1, p. 41-44.
Stenman S. M., Venalainen J. I., Lindfors K., Auriola S., Mauriala T., Kaukovirta-Norja A., Jantunen A., Laurila K. , Qiao S.-W., Sollid L.M., Mannisto P.T., Kaukinen K., Maki M. Enzymatic detoxification of gluten by germinating wheat proteases: implications for new treatment of celiac disease // Annals of medicine, 2009, 41, 5, p. 390-400.
Takayama T.K., Fujikawa K., Davie E.W. Characterization of the precursor of prostate-specific antigen activation by trypsin and by human glandular kallikrein //Journal of Biological Chemistry, 1997, 272, 34, p. 21582-21588.
Torbica A.M., Mastilovic J. S., Pojic M.M., Kevresan Z.S. Effects of wheat bug (Eurygaster spp. and Aelia spp.) infestation in preharvest period on wheat technological quality and gluten composition // The Scientific World Journal, 2014, Article ID 148025
(http://dx.doi.org/10.1155/2014/148025).
Vaccino P., Corbellini M., Reffo G., Zoccatelli G., Migliardi M., Tavella L. Impact of Eurygaster maura (Heteroptera: Scutelleridae) feeding on quality of bread wheat in relation to attack period // Journal of Economic Entomology, 2006, 99, 3, p. 757-763.
Wellner N., Marsh J.T., Savage A.W., Halford N.G., Shewry P.R., Mills E.N.C., Belton P.S. Comparison of repetitive derived from high molecular weight subunits of wheat glutenin, an elastomeric plant protein // Biomacromolecules, 2006, 7, p. 1096-1103.
Werteker M., Kramreither G. Relation between susceptibility to wheat bug attack and digestibility of glutenin // Journal of Cereal Science, 2008, 47, 2, p. 226-232.
Zoller F., Markert A., Askoxylakis V., Altmann A., Barthe P., Weichert W., Zhao W., Mier W., Haberkorn U. Combination of phage display and molecular grafting generates highly specific tumor-targeting miniproteins // Angewandte Chemie - Int. Edition, 2012, 51, 52, p. 13136-13139.
PROPERTIES OF NATURAL AND RECOMBINANT SUNN PEST (EURYGASTER INTEGRICEPS) SALIVARY GLAND PROTEINASES HYDROLYZING WHEAT GLUTEN
Al.V.Konarev, V.V.Dolgikh, I.V.Senderskii, L.I.Nefedova, A.V.Konarev, N.K.Gubareva Sunn pest salivary glands proteinases hydrolyzing wheat gluten and deteriorating quality of flour are of interest as economically important factors of harmfulness, potential markers for the diagnostics of damage to grain, as well as modifiers of gluten. Development of approaches to reduce harm from action of pest enzymes requires study of their natural and recombinant forms. Three active recombinant forms of one of the proteinases synthesized in the salivary glands of bugs have been obtained using methods of heterologous expression in bacterial and yeast cells. The properties of glutenin hydro-
lyzing proteinases from damaged grains, salivary glands and also recombinant forms have been investigated and compared. The degree of similarity of natural and recombinant enzymes of the pest, efficiency of expression variants and possible applications of the results obtained are discussed.
Keywords: Eurygaster integriceps, salivary gland, damaged grain, proteinase, gluten, glutenin, glutenin replica, heterologous expression, Pichia pastoris, recombinant enzyme.
Ал.В.Конарев, д.б.н., [email protected] В.В.Долгих, к.б.н., [email protected] И.В.Сендерский, [email protected] Л.И.Нефедова, к.б.н., [email protected] А.В.Конарев, д.б.н., [email protected] Н.К.Губарева, к.б.н., [email protected]
