Свободнорадикальное окисление мембранных липидов лейкоцитов при хронической пневмонии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПНЕВМОНИИ

Л. В. Кузьмичева, доктор биологических наук (Саранск), Е. В. Романова (Саранск), Ю. В. Орешина (Саранск),

В. В. Ревин, доктор биологических наук (Саранск)

Хроническая пневмония (ХП) характеризуется многообразным проявлением симптомов в зависимости от распространения по долям и сегментам, фазы течения заболевания (обострение, ремиссия), нарушения функции внеш-| него дыхания и наличия осложнений. Пневмонию следует считать хронической, если после двух месяцев лечения динамическое клиническое и рентгенологическое наблюдение не обнаруживает дальнейших положительных изменений, а также в случаях, когда после кажущегося выздоровления наступают повторные обострения воспаления в одной и той же части легкого [2; 6].

Распространенность пневмонии повсеместно сохраняется на высоком уровне. Так, в Рос-| сии среднестатистические показатели заболеваемости составляют 10 — 15 %. В последние годы в нашей стране отмечается устойчивая тенденция, демонстрирующая увеличение смертности от пневмонии [7].

Как и любой воспалительный процесс, хроническая пневмония сопровождается локальной аккумуляцией фагоцитирующих клеток (нейтрофилов и моноцитов) и активацией их кислородного метаболизма. Избыточная генерация активных форм кислорода инициирует свободнорадикальное окисление липидов \ (СРО) [15]. Усиление процесса СРО сопряже-

но с глубокими нарушениями структуры и функции фосфолипидного слоя мембран (повышение их проницаемости, накопление Са2+ и в клетке, разобщение окислительного фосфорилирования, активация лизосомальных ферментов, разрушение БН-групп ферментов, полимеризация белков, набухание и деструкция мембран) [11; 13; 14]. В течение всего периода воспаления при ХП сохраняется усиление процессов СРО в мембранах нейтрофилов и угнетение антиоксидантной защиты. Антиоксидантная система включает ферментативные и неферментативные механизмы действия. Нами были рассмотрены лишь ферментативные механизмы действия, в частно-

г

сти, активность ферментов супероксиддисму-тазы (СОД) и каталазы [3; 5].

Цель данного исследования — определить содержание продуктов СРО мембранных липидов лейкоцитов и их антиоксидантную активность при хронической пневмонии в фазе обострения.

Материал и методы исследования. Материалом исследования служила кровь практически здоровых людей и больных хронической пневмонией. Кровь была получена с городской станции переливания крови и пульмонологического отделения 4-й городской клинической больницы г. Саранска. Кровь за-

доноры

Е232/220

Е278

Е278/220

Рисунок 2

Динамика изменения содержания продуктов СРО мембранных липидов лейкоцитов в изопропанольной фазе

доноры

Каталаза

Рисунок 3

Динамика изменения содержания МДА и активности антиоксидантов мембранных липидов лейкоцитов

© Л. В. Кузьмичева, Е. В. Романова, Ю. В. Орешина, В. В. Ревин, 2007

ВЕСТНИК Мордовского университета | 2007 I № 4

бирали стерильно из локтевой вены. Отобранную кровь помещали в пробирку с консервантом (3,8 % раствор цитрата натрия). Лейкоциты выделяли из венозной крови центрифугированием (В. И. Шепотиновский 3. И. Микашинович, 1979). Была обследована кровь 10 больных хронической пневмонией в возрасте от 30 до 60 лет. Контрольную группу составили практически здоровые люди (доноры) в количестве 10 человек.

Содержание продуктов СРО в лейкоцитах изучали спектрофотометрическим методом в гептановой и изопропанольной фазах липидно-го экстракта [16]. При длине волны (X), равной 220 нм, измеряли поглощение изолированных двойных связей, при X = 232 нм поглощение диеновых коньюгатов (ДК), при X = 278 — ке-тодиеновых и сопряженных триенов (КД и СТ). Так же рассчитывали содержание продуктов СРО по отношению Е232/220 и Е278/220 Для изучения уровня малонового диальдегида

практически здоровых людей составило 3,56 ± ± 0,09 мкМ / л. Активность ферментов лейкоцитов в крови практически здоровых людей

составила: СОД — 402,5 ± 14,5 мкат / л, ката-лазы — 2,54 ± 0,02 мкат/л.

В результате исследования выявлены изменения в содержании продуктов СРО в суспензии лейкоцитов. Так, у больных хронической пневмонией в изопропанольном экстракте продукты СРО составили при Е.

продукты 0,98 ±0,1 ед / мл, при Е

278

при _232

0,65 ± 0,1 ед / мл,

в гептановой фазе липидного экстракта при Е232 — 0,61 ± 0,07 ед / мл, при Е278 0,52 ± ± 0,2 ед / мл.

Содержание МДА в суспензии лейкоцитов у больных хронической пневмонией составило 4,4 ± 0,4 мкМ / л. Активность ферментов СОД и каталазы лейкоцитов в крови больных ХП составила 262,9 ± 28,1 мкат / л и 1,14 ± 0,06 мкат / л соответственно. Анализ полученных результатов свидетель-(МДА) использовали тест с тиобарбитуровой ствует, что при ХП в острой фазе увеличива-кислотой (Л. И. Андреева, Л. А. Кожемякин, ется содержание интермедиатов ПОЛ как в А. А. Кишкун, 1988). Активность ферментов гептановой, так и в изопропанольной фазах,

причем в последней гораздо значительнее: у больных ХП содержание ДК по сравнению с таковым в контрольной группе повышалось на 27,1 % в гептановой фракции и на 46,3 % — в изопропанольной. Соотношение диеновых коньюгатов и ненасыщенных липидов (Е232/220) в изопропанольной фракции при ХП превышало этот показатель контрольной группы на 16 %. В гептановой фазе повышение было незначительно (рис. 1, 2).

У больных ХП уровень КД и СТ по сравне-

супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы определяли по В. С. Гуревич и др. (1990) и М. А. Королюк и др. (1988). Результаты обработаны методом вариационной статистики с расчетом коэффициента достоверности по Стьюденту.

Результаты и обсуждение. Содержание продуктов СРО в суспензии лейкоцитов у практически здоровых людей в изопропанольном экстракте составило при Е232 0,67 ± 0,2 ед / мл, при Е278 — 0,46 ±0,1 ед / мл, в гептановой фазе липидного экстракта — при Е232 —

0,48 ± 0,09 ед / мл, при Е278 — 0,35 ± 0,1 ед / мл.

О

Содержание МДА в суспензии лейкоцитов у

доноры

Е232/220

Е278

Е278/220

Рисунок 1

Динамика изменения содержания продуктов СРО мембранных липидов лимфоцитов в гептановой фазе

нию с таковым в контрольной группе повышался на 48,6 % в гептановой фракции и на 41,3 % — в изопропанольной. Соотношение кетодиенов и сопряженных триенов с ненасыщенными липидами (Е278/220) при ХП превышало контрольное значение на 14 % в гептановой фракции, на 8 % — в изопропанольной фазе (см. рис. 1, 2).

Содержание МДА в суспензии лейкоцитов у больных хронической пневмонией выше, чем у практически здоровых людей, на 24 % (рис. 3).

Повышение концентрации МДА в лейкоцитах свидетельствует об активации липидной пероксидации при воспалении [4]. Высокая активность воспаления сопровождается максимальным повышением МДА, что создает условия для повреждения клеточных структур

Серия «Биологические науки»

89

свободными радикалами [8].

Измеряя активность СОД и каталазы лейкоцитов в крови больных ХП, выяснили, что активность ферментов ниже, чем у практически здоровых людей соответственно на

65,3 % и 44,9 % (рис. 3).

К СОД относят семейство металлофермен-тов. Этот фермент катализирует реакцию взаимодействия (дисмутации) двух супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода. Пероксид водорода не является радикалом. Это соединение достаточно стабильно, не имеет заряда и может путем диффузии мигрировать в клетки и ткани. Поэтому пероксид водорода осуществляет роль «дальнобойного оружия», вызывающего окислительную модификацию отдаленно расположенных ферментов и макромолекул [1; 9].

Функция каталазы — предотвращение накопления Н202, образующегося при дисмутации супероксидного аниона и при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов. Низкая активность каталазы в нейтрофилах должна приводить к повышению содержания

пероксида водорода, высокий уровень которого может инактивировать СОД, способствуя тем самым накоплению активных форм кислорода

[Ю; 12].

Выводы:

1. Обострение хронической пневмонии сопровождается локальным усилением свобод-норадикального окисления и увеличением продуктов ПОЛ в суспензии лейкоцитов.

2. Относительное содержание диеновых коньюгатов гидроперекисей и изолированных двойных связей липидов выше при определении в изопропанольной фазе липидного экстракта.

3. Повышение концентрации МДА в лейкоцитах свидетельствует об активации липид-ной пероксидации при воспалении. Высокая активность воспаления сопровождается максимальным повышением МДА, что создает условия для повреждения клеточных структур свободными радикалами.

4. У больных хронической пневмонией активность супероксиддисмутазы и каталазы в лейкоцитах снижена соответственно в 1,5 — 2 раза по отношению к контрольной группе.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Активные формы кислорода и их роль в организме / А. Н. Осипов, О. А. Азизова, Ю. А. Владимиров // Успехи биологической химии. 1990. №2. С. 43 — 47.

2. Ананенко А. А. Метаболизм легких при неспецифических заболеваниях органов дыхания / А. А. Ананенко, Ю. Е. Вальтищев. Л., 1979. 156 с.

3. Величковский Б. Т. Свободнорадикальное окисление как звено срочной и долговременной адаптации организма к факторам окружающей среды / Б. Т. Величковский / / Вестник Российской академии наук. М.: Медицина, 2001. С. 45 — 52.

'4. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю. А. Владимиров / / Вестник Российской АМН. 1998. №7. С. 43 — 54.

5. Влияние препарата супероксиддисмутазы на содержание эндогенной супероксиддисмутазы и пери-кисное окисление липидов / М. И. Агаджаков, М. И. Симонян, Ш. А. Казарян / / Вопросы медицинской химии. 1989. № 4. С. 28 — 30.

6. Ландышев С. Ю. Факторы риска и молекулярные клеточные механизмы затяжного течения пневмонии / С. Ю. Ландышев / / Терапевтический архив. 1998. № 3. С. 41 — 44.

7. Малахова М. Я. Метаболизм липидов при поражении легких / М. Я. Малахова / / Национ. конгресс по болезням органов дыхания. СПб., 1992. 408 с.

8. Мануйлов Б. М. Регулирующая роль легких и других органов в генерации активных форм кислорода лейкоцитами, их фагоцитарной активности и механизмы этого явления в норме и патологии: автореф. дис. ... д-ра биол. наук / Б. М. Мануйлов. М., 1994. 95 с.

9. Меныцикова Е. Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е. Б. Меньшикова, Н. К. Зенков / / Успехи современной биологии. 1993. № 4. С. 32 — 36.

10. Определение биохимических показателей перекисного окисления и состояния антиоксидантной системы в организме / Л. А. Романчук, Э. А. Фактор, В. И. Журавков. СПб.: Государственная академия физической культуры имени Лесгафта, 1997. 31 с.

11. Перекисное окисление и стресс / В. А. Барабой, И. И. Брехман, В. Г. Голотин, Ю. Б. Кудряшов. СПб.: Наука, 1992. 148 с.

12. Пиунов Л. А. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной защиты / Л. А. Пи-унов. Вестник АМН. 2000. С. 9 — 13.

ВЕСТНИК Мордовского университета | 2007 | № 4

13. Роль переписного окисления липидов мембран (ПОЛ) и антирадикальной защиты в патогенезе бронхиальной астмы / В. Г. Аматуни, К. Г. Карагезян, М. Д. Сафарян // Терапевтический архив. 1980.

№ 3. С. 96 — 99.

14. Состояние процессов перекисного окисления липидов при хроническом бронхите / Г. Я. Игнатова, И. А. Волчегорский, Э. Г. Волкова // Терапевтический архив. 1998. № 3. С. 36 — 37.

15. Тяжелые внебольничные пневмонии / Л. Д. Сидорова, Л. Н. Можина, Т. Н. Курбетьева, Е. Г. Тихомирова / / Проблемы клинической медицины. 2005. № 1. С. 36 — 39.

16. Хышиктуев Б. С. Метод определения продуктов перекисного окисления липидов / Б. С. Хы-шиктуев, Н. А. Хышиктуева / / Вопросы медицинской химии. 1990. № 1. С. 25 — 26.

Поступила 18 АО.06.

\

%

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРОВ Са2+-ПРОНИЦАЕМОСТИ НА Н202-ИНДУЦИР0-ВАННЫЙ АПОПТОЗ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРО- 1 ФАГОВ

Ж

В. А. Трофимов, доктор биологических наук (Саранск), |

О. Н. Аксенова, кандидат биологических наук (Саранск), I

А. В. Никулин (Саранск)

Генетическая детерминированность апоп-тоза определяется наличием генов индукторов апоптоза, транскрипционная активность которых резко возрастает при окислительном стрессе [5]. Мощными индукторами апоптоза являются активные формы кислорода, в частности перекись водорода, продуцируемые активированными макрофагами [1]. Показано, что перекись водорода влияет на кальциевую проницаемость и способствует накоплению Са2+ в цитоплазме перитонеальных макрофагов [3]. В свою очередь запуск триггерных звеньев программы апоптоза клетки также является зависимым от кальция [2; 8]. В этой связи представляет интерес изучение роли Са2+ в реализации программы Н202-индуцированного апоптоза перитонеальных макрофагов.

В данной статье представлены данные о влиянии модификаторов Са2+-проницаемости на Н202-индуцированный апоптоз перитонеальных макрофагов.

Методика исследования. Объектом исследования служили резидентные перитоне-альные макрофаги (ПМФ) крыс линии АМэ1аг весом 200 — 250 г, полученные по методу

Conrad [7]. Клетки культивировали в течение 2 ч в монослое на предметных стеклах влаж- j ных камер и в эппендорфовых пробирках при j температуре 37 °С. Рабочая концентрация I суспензии составляла 106 кл / мл. Жизнеспособность клеток проверяли с помощью теста | с трипановым синим. Эксперименты проводи- \ ли при комнатной температуре (20 — 22 °С) j на 1-е сутки культивирования макрофагов. В J культуральную среду добавляли Н202 (1 мМ), j модификаторы Са2+-проницаемости: Са2+- j ионофор А23187 (0,1 и 1 мкМ); Са2+-блокаторы: j верапамил (0,05 мг / мл) и LaCl3 (0,5 мМ); j Са2+-хелатор-ЭДТА (2 мМ) (все реактивы про- j изводства «Sigma»). Инкубировали в термо- j стате при температуре 37 °С в течение 3 ч.

t

Затем монослои клеток фиксировали и окра- ¡

шивали для световой микроскопии, используя j

краситель Гимза («Sigma»). На эксперимен- j

тальную точку анализировали 100 клеток. Вы- j

деление и электрофоретический анализ ДНК j

проводили по стандартной методике j

S. Н. Kaufmann. Размер фрагментов ДНК оп- !;

ределяли путем сравнения их подвижности с j

маркером (фрагменты фага А,). Количествен- J

© В. А. Трофимов, О. Н. Аксенова, А. В. Никулин, 2007 j

ия «Биологические науки»

91