Свобод-норадикальные процессы и их регуляция, структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов при метаболическом синдроме

Крайнова Наталья Николаевна; Попова Татьяна Петровна; Сафроненко Виктория Александровна; Волкова Наталья Ивановна; Внуков Валерий Валентинович

УДК 616.4

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И ИХ РЕГУЛЯЦИЯ, СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ

Южный федеральный университет, 344006, Ростов н/Д, Б. Садовая, 105, [email protected]

2Ростовский государственный медицинский университет, 344022, г. Ростов н/Д, пер. Нахичеванский, 29, [email protected]

Southern Federal University, 344006, Rostov-on-Don, B. Sadovaya St., 105, [email protected]

2Rostov State Medical University, 344022, Rostov-on-Don, Nakhichevanskiy Lane, 29, [email protected]

Представлены данные о характере изменений в системе антиоксиданты — прооксиданты у 50 пациентов в возрасте от 16 до 58 лет с метаболическим синдромом (МС) без нарушения углеводного обмена, а также структурное состояние мембран эритроцитов. Исследован уровень свободнорадикалъных процессов в организме больных МС системой люминол-индуцированной хемилюминесценции, содержание в крови первичных — диеновых конъюгатов, вторичных — малонового диалъдегида и шиффовых оснований — конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Исследована микровязкостъ липидного бислоя мембран эритроцитов и активность антирадикалъных ферментов в крови больных с МС. Выявлена активация свободнорадикального окисления в крови у пациентов с МС по сравнению с группой доноров, усиление процессов ПОЛ, приводящие к дестабилизации эритроцитарной мембраны, компенсаторное увеличение активности антирадикалъных ферментов.

Ключевые слова: свободнорадикалъные процессы, метаболический синдром, структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов.

The facts submitted in the article are about the nature of changes in the antioxidative — perooxidative system activity and structure-dynamics parameters of erythrocyte membranes in patients with metabolic syndrome without violation of carbohydrate metabolism. The level of free-radical processes, the content ofproducts ofperoxide oxidation of lipids and the activity of antiradical enzymes in blood ofpatients with metabolic syndrome have been studied.

Keywords: free-radical processes, metabolic syndrome, structure-functional state of erythrocyte membranes.

Цель работы - исследование интенсивности сво-боднорадикального окисления (СРО) и активности ан-тиоксидантной системы крови, а также структурного состояния мембран эритроцитов при инсулинорези-стентности (ИР) без нарушения углеводного обмена.

Материалы и методы

Обследовано 50 пациентов в возрасте от 16 до 58 лет, имеющих избыточную массу тела (ИМТ > 29 кг/м2), абдоминальный тип ожирения (ОТ/ОБ > 0,85), в 86 % случаев висцеральное ожирение (ОТ > 90 см). Оценку толерантности к углеводам осуществляли с помощью 2-часового перорального глюкозотолерантного теста (ПГТТ) по протоколу, предложенному ВОЗ (1985). Содержание глюкозы в капиллярной крови определяли глюкозооксидантным методом с помощью стандартного клинического набора («Ольвекс-диагнос-тикум», Санкт-Петербург). Для оценки ИР при проведении ПГТТ одномоментно определяли концентрацию глюкозы и иммунореактивного инсулина (ИРИ) в сыворотке крови с последующим расчетом индекса САЯО (отношения концентрации глюкозы и концентрации ИРИ). Если индекс становился меньше 0,33, состояние расценивали как ИР [1]. Базальный и стимулированный глюкозой уровень ИРИ определяли иммуноферментным методом с помощью клинического набора («DRG Insmklan», Москва). В качестве контроля обследовано 20 доноров соответствующего пола и возраста, худощавого телосложения, без вредных привычек.

Для изучения процессов СРО и антиокси-дантной системы исследовали спонтанную и Н2О2 - люминол - индуцированную хемилю-минесценцию (ХЛ) [2]. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по содержанию первичных продуктов - диеновых коньюгатов (ДК) [3], вторичных - малонового диальдегида (МДА) по методике из [4] и конечных - шиффовых оснований (ШО) [5]. Количество общих липидов (ОЛ) в хлороформном экстракте [6] плазмы крови и гемолизата определяли по цветной реакции с фосфованилиновым реактивом по методу Колба и Камышникова (1982) с помощью стандартного клинического набора («ЭКОлаб», Россия).

Состояние ферментной антиоксидантной системы оценивали по активности суперок-сиддисмутазы (СОД) [7], каталазы [8] и церу-лоплазмина (ЦП) [9]. Структурное состояние мембран эритроцитов определяли с помощью флюоресцентного зонда пирена в суспензии эритроцитов [10]. Стабильность эритроци-тарных мембран оценивали по содержанию внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) в

плазме гемоглобинцианидным методом Каркашова и Вичева (1973) и суммарной пероксидазной активности (СПА) (Покровский, 1969 в модификации Лукаша и др. 1996) [11]. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Excel 8,0. Значимость различий между изучаемыми величинами определяли по критерию t Стюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05.

Результаты

У пациентов с метаболическим синдромом (МС) по сравнению с группой доноров амплитуда быстрой вспышки (h) Н2О2 - люминол индуцированной ХЛ увеличилась на 25 %, максимальная светимость (Н) и светосумма (Sm) медленной вспышки - на 31 и 54 %, скорость окисления липидов - на 35 % относительно того же показателя, измеренного у доноров (табл. 1).

Таким образом, в плазме крови больных с ИР без нарушения углеводного обмена интенсивность ХЛ по пяти показателям достоверно увеличилась, что свидетельствует об увеличении уровня СРП в организме.

В результате проведенных исследований нами установлено, что в сравнении с группой доноров в

Таблица 1

Параметры спонтанной и Н2О2 - люминол - индуцированной ХЛ и содержание продуктов ПОЛ в крови у пациентов с МС без нарушения углеводного обмена М±т

Показатель Группа доно- Пациенты с

ров, n = 20 MQ n = 50

Sm спонтанной 2,67±0,11 3,58±0,22

ХЛ за 8 с, отн.ед 0,002 <р<0,01

Вспышка (Ь) Н2О2 - 44,61±1,49 55,74±1,6

люминол индуцированной ХЛ, отн.ед р<0,001

Максимальная светимость - 37,97±2,87 58,5±3,63

(Н) Н2О2 - люминол инду- р<0,001

цированной ХЛ, отн.ед

Бш Н2О2 - люминол 168,26±10,95 221,42±9,9

индуцированной ХЛ за 5 мин, отн.ед 0,002<р<0,01

tg угла наклона Н2О2 - 25,81±2,26 34,77±1,84

люминол индуцированной ХЛ, отн.ед 0,002<р<0,01

ДК в плазме, 9,50±0,31 12,86±0,54

нмоль/мг ОЛ р<0,001

ДК в гемолизате, 9,91±0,48 13,78±0,43

нмоль/мг ОЛ р<0,001

МДА в плазме, 23,88±0,67 30,63±0,52

нмоль/мл р<0,001

МДА в гемолизате, 2,91±0,10 3,90±0,11

нмоль/мг НЬ р<0,001

ШО в плазме, 0,54±0,02 0,67±0,02

ед фл/мг ОЛ р<0,001

ШО в гемолизате, 0,56±0,02 0,73±0,03

ед фл/мг ОЛ р<0,001

Примечание. Здесь и в табл. 2-3: р по сравнению с группой доноров.

достоверность изменений показателя

плазме крови больных с МС содержание ДК было выше на 35 %, вторичных (МДА) и конечных (ШО) продуктов перекисного окисления - на 28 и 22 %.

В эритроцитах прослеживалась аналогичная динамика. Содержание ДК превышало контрольный уровень на 39, МДА - на 34, ШО - на 30 % соответственно, что свидетельствует о нарушениях в системе ан-тиоксиданты - прооксиданты в организме (табл. 1). Таким образом, у пациентов с МС наблюдается активация СРО окисления полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) липидов в плазме крови и эритроцитах, выражающаяся в увеличении концентрации первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ.

Основной вклад в систему регуляции СРО вносят антиоксидантные ферменты - важный компонент первой линии антирадикальной защиты. Они способны ингибировать активные кислородные метаболиты и предотвращать развитие СРП на различных стадиях цепного процесса [1, 9]. В плазме крови пациентов по сравнению с группой доноров активность СОД увеличилась на 98, каталазы на 28, оксидазная активность ЦП - на 45 %, что, по-видимому, носит компенсаторный характер. В гемолизате эритроцитов активность СОД и каталазы возрастала по сравнению с группой доноров на 60 и 42 %.

Таким образом, мы полагаем, что у больных с МС в крови наблюдается повышенная генерация активных кислородных метаболитов, которые способны инициировать ПОЛ в биомембранах и липопротеидах крови. Наряду с этим наблюдается параллельное увеличение антиоксидантных ферментов, что говорит о повышенной активации защитной системы организма у пациентов с МИ без нарушения углеводного обмена (табл. 2).

Обнаруженное усиление процессов ПОЛ в плазме и эритроцитах пациентов с МС может явиться причиной изменения структурно-функционального состояния мембранных структур организма, в частности, мембран эритроцитов.

Таблица2

Активность антиоксидантных ферментов в крови пациентов с МС без нарушения углеводного обмена М±т

Группа Пациенты

Показатель доноров, с МС,

n = 20 n = 50

ЦП в плазме, 1,34±0,03 1,94±0,06

мкмоль/л р<0,001

СОД в плазме (СУА), 0,60±0,06 1,20±0,07

у.е./мин в мл плазмы р<0,001

СОД в гемолизате, 0,84±0,12 1,34±0,08

у.е./мин в мг Hb р<0,001

Каталаза в плазме, 15,8±0,84 20,3±1,12

нмоль Н2О2/мл 0,01< р<0,02

Каталаза в гемолизате, 23,36±1,52 33,08±1,25

нмоль Н2О2/мл р<0,001

Анализ спектра флуоресцентного зонда пирена позволил сделать вывод об изменении структуры эрит-роцитарной мембраны у обследованных нами лиц с МС (табл. 3). В сравнении с группой доноров у больных с МС была повышена микровязкость липидного

бислоя на 25 %, текучесть зон белок-липидных контактов увеличилась на 12, снизилась гидрофобность внутренних областей мембраны на 7, степень погружения белков в липидный бислой увеличилась на 38 %. Коэффициент полярности зоны белок-липидных контактов остался без достоверных изменений (табл. 3). Таким образом, наблюдаемая при метаболическом синдроме активация СРП и процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов сопровождается повышением микровязкости липидного бислоя, структурными изменениями мембранных белков без изменения полярности липидного матрикса.

Таблица 3

Структурное состояние мембран эритроцитов, уровни СПА и ВЭГ у пациентов с МС без нарушения углеводного обмена М±т

Показатель Группа доноров, n = 20 Пациенты с МС, n = 50

Fs/FH (334) 0,688±0,023 0,517±0,016 р<0,001

F3/FM(282) 1,554±0,112 1,365±0,032 р<0,05

F0-F1/F0 0,211±0,05 0,291±0,008 р<0,001

F372/F393 (3 34) 1,901±0,067 1,763±0,034 р<0,05

F372/F393 (2 82) 2,146±0,090 2,076±0,049 р>0,05

СПА, ед акт/мл 2,525±0,113 4,766±0,178 р<0,001

ВЭГ, ммоль/л 1,442±0,076 2,514±0,097 р<0,001

Изменение физических характеристик мембран эритроцитов неизбежно отражается на их стабильности. Обнаруженное нами у больных с МС увеличение концентрации ВЭГ на 74 % и СПА - на 89 % в плазме крови (табл. 3) свидетельствует о выраженном нарушении проницаемости клеточных мембран эритроцитов при МС. Эти показатели являются интегральными, по изменению уровня которых оценивают состояние мембран форменных элементов крови, а также наличие потенциальных прооксидантов, содержащих в своем составе Fe+2[11].

Таким образом, у пациентов с МС без нарушения углеводного обмена наблюдаются нарушения в системе антиоксиданты - прооксиданты, которые выражаются в повышенной генерации активных кислородных метаболитов, усилении процессов ПОЛ на фоне компенсаторного увеличения активности антирадикальных ферментов, а также изменения структуры эритроцитарной мембраны, приводящие к её дестабилизации.

Литература

1. Caro J.F. Insulin resistance in obese and nonobese men // J. Clin. Endocrinol Metab. 1991. Р. 7391 - 1995.

2. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах. М., 1991.

3. Стальная И.Д. Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 63-64.

4. Стальная И.Д., Горишвили Т.Г. Современные методы в биохимии. М., 1977.

5. Bidlack W.R., TappelA.L. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation // Lipids. 1973. Vol. 68. № 4. P. 203-209.

6. Bligh E.J., Dyer W.J. Rapid methods of total lipid extraction and purification // J. Biochem. Physiol. 1959. Vol. 37. № 8. P. 911-917.

7. Сирота Т.В. новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использования его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопр. мед. химии. 1999. № 3. С. 14-15.

8. Королюк М.А. и др. Метод определения активности ка-талазы // Лабораторное дело. 1988. № 1. С. 16-19.

9. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии. Минск, 1982.

10. Владимиров Ю.А., Добрецова Г.В. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М., 1980.

11. Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике. М., 1969.

Поступила в редакцию_4 апреля 2008 г.

Free-radical Processes and Their Regulation, Structure-functional State of Erythrocyte Membranes in Patients with Metabolic Syndrome