CC BY
83
mitochondria. Polarography and electrophoresis]. Moscow, NPK PROMEKSPOEKOBEZOPASNOST' Publ., 2004, 98 p.
4. Ponomarev A.G., Tatarinova T.D., Perk A.A., Vasil'eva I.V., Bubyakina V.V. Degidriny, assotsiiro-vannye s formirovaniem morozoustoichivosti berezy ploskolistnoi [Dehydrins associated with the development of frost resistancе of Asian white birch]. Fiziologiya rastenii - Plant Physiology, 2014, vol. 61, no. 1, pp. 144-120.
5. Popov S.Ya., Dorozhkina L.A., Kalinin V.A. Os-novy khimicheskoi zashchity rastenii [Fundamentals of
chemical plants protection]. Moscow, Art-Lion Publ., 2003, 208 p.
6. Prusakova L.D., Chizhova S.I. Primenenie pro-izvodnykh triazola v rastenievodstve [Application of triazole derivatives in plant cultivation]. Agrokhimiya -Agrochemistry, 1998, no. 10, pp. 37-44.
7. Trunova T.I. Rastenie i nizkotemperaturnyi stress [Plants and cold stress]. Moscow, Nauka Publ., 2007, 54 p.
8. Close T.J. Dehydrins: emergence of a biochemical role of a family of plant dehydratation proteins. Physiol. Plant., 1996, vol. 97, pp. 795-803.
Статья поступила в редакцию 3.11.2015 г.
После переработки 21.12.2015 г.
УДК 664.857.53:547.29:547.39
СВЕРХКРИТИЧЕСКАЯ ЭКСТРАКЦИЯ ДИОКСИДОМ УГЛЕРОДА ПЛОДОВОГО ТЕЛА ГРИБА PLEUROTUS OSTREATUS
© А.А. Гришин, Н.В. Зорина, В.И. Луцкий
Иркутский национальный исследовательский технический университет, 664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83, [email protected]
Впервые начато изучение сверхкритической экстракции диоксидом углерода плодового тела гриба Pleurotus ostreatus (вешенка обыкновенная). Установлен групповой состав флюидного экстракта методом ГХ-МС и выход экстракта в зависимости от условий экстракции (давления и наличия сорастворителя). Выход флюидного экстракта от 2,8% до 3,8% от воздушно-сухого сырья. Групповой состав флюидного экстракта: насыщенные и ненасыщенные карбоновые кислоты (~ 70% от экстракта), углеводороды (~ 6%), стерины (~ 2%) и другие классы (спирты, альдегиды и кето-ны, терпены, сложные эфиры и др.) менее 1% каждого. ГХ-МС-анализ продуктов щелочного и кислотного гидролиза нативного экстракта показал, что большая часть насыщенных и ненасыщенных жирных кислот находится в плодовом теле гриба в виде глицеридов, а фитостерины - в виде стеридов. В то же время часть жирных кислот обнаружена и в свободном (несвязанном) состоянии.
Ключевые слова: Pleurotus ostreatus; СО2 флюидная экстракция; ГХ-МС; состав экстракта.
SUPERCRITICAL CARBON DIOXIDE EXTRACTION OF THE FUNGAL OF THE PLEUROTUS OSTREATUS
A.A. Grishin, N.V. Zorina, V.I. Lutsky
Irkutsk National Research Technical University,
83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia, [email protected]
For the very first time the study of supercritical carbon dioxide extraction of the fungal fruit of the Pleurotus ostreatus was started. Using the GC-MS method the group composition of fluid extract and the extract yield was determined depending on the extraction conditions (pressure and the presence of co-solvent). The yield of fluid extract ranges from 2.8% to 3.8% of the air-dry material. The group composition of fluid extract consists of fatty acids (~ 70% of the extract), hydrocarbons (~6%), sterols (~2%) and other classes (alcohols,
aldehydes and ketones, terpenes, esters, etc.) less than 1% each. GC-MS analysis of native extract alkali and acid hydrolysis products showed that most of the saturated and unsaturated fatty acids in the fungal fruit are in the form of glycerides, and phytosterols - as sterides. At the same time, a number of unbound fatty acids were found.
Keywords: Pleurotus ostreatus; CO2 fluid extraction; GC-MS; composition of the extract.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы в мире уделяется все больше внимания вопросам извлечения на-тивных биологически активных веществ (БАВ) из растительного сырья грибного происхождения, использование которого перспективно в фармацевтической [10], косметической [1] и пищевой промышленности [5].
Базидиомицеты обладают огромным фармакологическим потенциалом и являются перспективными продуцентами БАВ. Грибами синтезируется большое количество веществ, обладающих бактерицидным, фунгицидным, противоопухолевым, противовоспалительным и иммуностимулирующим действием [7-9].
Методы выделения БАВ из грибов такие же, какие применяются при работе с растительным сырьем - экстракция органическими растворителями, удаление растворителя, разделение полученного экстракта на отдельные компоненты (или фракции), тестирование изолированных веществ на биологическую активность и установление строения новых веществ (или идентификация известных).
В то же время интенсивно развивается относительно новая методика выделения биологически активных веществ из растительного сырья - сверхкритическая флюидная (СКФ) экстракция [2, 8]. Главные преимущества этого метода - использование невысоких температур при выделении биологически активных компонентов и отсутствие в выделяемых БАВ остаточных количеств растворителя. Благодаря этим преимуществам сверхкритическая флюидная углекислотная экстракция заняла прочное место в промышленном производстве полимеров, фармацевтики, продуктов питания, новых материалов и биодизельного топлива [3], а объемы веществ, экстрагируемых при помощи этой технологии в мире, растут с каждым годом [4]. Таким образом, сверхкритическая экстракция базиомицетов является очень актуальным направлением научного поиска. А проведенные исследования могут в короткое время найти применение в промышленном производстве.
Кроме вышеперечисленных ценных фармакологических свойств, грибы представляют собой богатый и быстро возобновляемый источник белковой пищи. Помимо белка грибы содержат и другие ценные ингредиенты, необходимые человеческому организму: углеводы,
жиры, витамины, минеральные вещества, пищевые волокна и т.д. Одним из перспективных видов грибов для промышленного производства, а также использования в качестве источника БАВ и недорогого, белкового источника питания является гриб Pleurotus ostreatus (ве-шенка обыкновенная).
Вешенка обыкновенная - съедобный гриб рода вешенок семейства вешенковых. Плодовые тела вешенки являются ценным диетическим продуктом, поскольку имеют низкую калорийность (38-41 ккал) [6]. Вешенка обыкновенная культивируется в промышленных масштабах во многих странах мира, включая Россию. Условия СКФ экстракции и состав флюидного экстракта вешенки обыкновенной до наших работ не изучались.
Цель настоящей работы - изучение экстракции БАВ из вешенки обыкновенной в ^Ф условиях и определение группового состава полученного экстракта.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материал для исследования - измельченное плодовое тело гриба вешенка обыкновенная - был предоставлен старшим научным сотрудником, кандидатом биологических наук Т.А. Пензиной (Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск).
Флюидная экстракция проводилась на установке R-401, Series SFE System (Южная Корея), состоящей из насоса высокого давления, блока управления, термостатируемых экстрактора и приемника. Газ из баллона с СО2 поступает в теплообменник, где при давлении около 5-6 МПа (давление в баллоне) охлаждается до сжиженного состояния, после чего насосом высокого давления закачивается в экстрактор объемом 500 см3 для проведения экстракции. Давление, температура в экстракторе и приемнике контролируются датчиками.
Образец помещался в экстрактор (масса навески - 5±0,1 г), туда же вносили модификатор - 20 мл этилового спирта, экстрактор герметически закрывали и вводили экстрагент (флюид СО2) в нижнюю часть экстрактора. Через определенное время открывали дроссельный вентиль между экстрактором и приемником и из верхней части экстрактора экстракт выпускали в приемник, затем вентиль перекрывали и в экстрактор вводили новую порцию эстрагента. Разделение сверхкритического флю-
ида и экстракта происходит за счет понижения давления в приемнике до значений ~0,8 МПа, что исключает возможность вторичного растворения экстракта.
Экстракция грибов проводилась в динамическом режиме, с модификатором (спирт) и без модификатора.
Условия динамического режима - при постоянной температуре (65 оС) набрали заданное (табл. 1) давление экстрагента (СО2), экстракция продолжалась 20 мин, затем давление сбросили на 100 МПа снова набрали давление до заданного и через 20 мин вторично сбросили на 10 МПа. Эта операция повторялась 3 раза.
Полученный в приемнике флюидный экстракт отгоняли от остатков модификатора в вакууме (температура не выше 40 оС), взвешивали, растворяли в диэтиловом эфире и вводили в хроматограф.
Щелочной и кислотный гидролиз СО2 экстракта плодового тела гриба Pleurotus ostreatus. Щелочной гидролиз: 10 мг СО2 экстракта кипятили в колбе с обратным холодильником с 2N спиртовым раствором КОН с добавкой аскорбиновой кислоты (антиокси-дант) в течение 30 мин. Раствор нейтрализовали разбавленной HCl до слабокислой реакции и трижды экстрагировали органические ингредиенты диэтиловым эфиром, последний высушили сульфатом натрия, растворитель отогнали под вакуумом, остаток анализировали методом ГХ-МС.
Кислотный гидролиз: 10 мг СО2 экстракта из растворили в 1,5 мл метилового спирта, добавили 2 мл 10% HCl и кипятили с обратным холодильником 1,5 ч. Раствор нейтрализовали разбавленным раствором NaOH до рН 6 и трижды экстрагировали органические ингредиенты диэтиловым эфиром, последний высушили сульфатом натрия, растворитель отогнали, остаток анализировали методом ГХ-МС.
ГХ-МС-анализ СКФ экстракта плодового тела гриба Pleurotus ostreatus и продуктов щелочного и кислотного гидролиза СКФ экстрактов. Анализируемые образцы в растворе диэтилового эфира вводили в хроматограф 7820. А с селективным масс-спектрометриче-
Условия СО2
ским детектором НР 5975 фирмы «Agilen Technologies». Энергия ионизации - 70 эВ, температура сепаратора - 280 оС, ионного источника -230 оС. Кварцевая колонка 30000 * 0,25 мм со стационарной фазой (95% диметил - 5% дифе-нилполисилоксан). Условия анализа грибных экстрактов и гидролизатов: 3 мин изотермы при 50 оС с последующим подъемом температуры до 250 оС со скоростью 6 град/мин с последующей выдержкой в течение 40 мин при 250 оС. Идентификацию компонентов осуществляем с использованием библиотеки масс-спектров «NIST 11».
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты измерения выхода экстракта представлены в табл. 1, из которой видно, что увеличение давления от 30 до 34 МПа при прочих равных условиях приводит к значительному увеличению выхода экстракта. Добав-бавка к экстрагенту этилового спирта не привела к увеличению выхода экстракта, что объясняется, либо отсутствием полярных соединений в плодовом теле гриба, либо способностью СО2 конкурировать с полярными соединениями в теле гриба за образование водородных связей с данным модификатором [5].
Наибольшее количество компонентов извлеклось в опыте № 2 (табл.1), где полярный модификатор не применялся. Углекислотой экстрагировались следующие классы малополярных компонентов (рис.): углеводороды (порядка 6%), высшие карбоновые насыщенные и ненасыщенные кислоты (~70 %), стерины (~ 2%) и другие классы (альдегиды, спирты, терпены, сложные эфиры) менее 1% каждого.
Карбоновые кислоты являются доминирующими компонентами в этом экстракте (рисунок). Интересно отметить, что кроме высших насыщенных кислот - пентадекановой и пальмитиновой (со следами стеариновой), большую часть экстракта составляла ы-6 ненасыщенная линолевая кислота. Кроме того, в нем обнаружены следы олеиновой кислоты.
Следующим этапом исследования было более детальное изучение полученных экстрактов на наличие в них жиров и гликозидов. Анализ флюидных экстракций осуществляется
Таблица 1
и и выход экстракта
Давление, МПа Плотность сверхкритического СО2, г/л Наличие модификатора (этанол) Выход экстракта, % от сырья
30,0 844 да 2,8
34,0 901 нет 3,8
34,0 901 да 3,5
осуществлялся методом ГХ-МС, однако применяемый в этом случае МС-детектор (ионизации ЭУ) не применим для анализа жиров (сложных эфиров глицерина) и гликозидов. Поэтому следовало провести щелочной и кислотный гидролизы полученных флюидных экстрактов, проанализировать продукты гидролиза и, сравнив хроматограммы экстрактов до и после гидролиза, установить наличие сложных эфиров и гликозидов в экстрактах. Изучение ГХ-МС-хроматограммам продуктов щелочного гидролиза показало, что в гидролизате появились жирные кислоты, которых раньше не было в экстракте (табл. 2). Пальмитиновая и олеиновая кислоты хотя и присутствовали в СКФ экстракте, но после щелочного гидролиза их содержание увеличилось в 3 и 7 раз соответственно.
Основную массу в составе жиров состав-вляют глицериды олеиновой, пальмитиновой, стеариновой, линолевой и эруковой кислот.
Кроме ЖК в продуктах щелочного гидро-
00 70 60 50 40 30 20 10
Угленсдсрода Карбоноеые Стерины др. классы
ни слоты
Рис. Групповой качественный состав СО2 экстракта плодового тела гриба вешенки обыкновенной при давлении 34 МПа (опыт № 2, температура экстракции 65 оС, без модификатора)
Таблица 2
Состав жирных кислот (ЖК) до и после щелочного гидролиза СО2 экстракта
Число атомов и С=С связей в ЖК ЖК, присутствующие в СО2-экстракте до омыления ЖК, обнаруженные в СО2-экстракте после омыления
С 8:0 - +
С 14:0 + +
С 15:0 + +
С 16:0 + +
С 18:0 - +
С 18:1 (п-9) + +
С 18:2 (п-6) + +
С 18:3 (п-3) - +
С 20:0 - +
С 22:0 - +
С 22:1 (п-9) - +
С 9:0 (двухосновная) + +
лиза СО2 экстракта появился фитостерин - р-ситостерин. В связи с тем, что до гидролиза в экстракте это соединение идентифицировано не было, можно сделать вывод, что р-ситостерин находится в вешенке обыкновенной тоже в виде сложного эфира (стерида) с какой-то одной или несколькими из вышеперечисленных жирных кислот. Известно, что кислотными остатками у стеридов обычно являются пальмитиновая, стеариновая или олеиновая кислоты, т.е. те кислоты, которые идентифицированы нами в изучаемом объекте.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в углекислотном экстракте гриба вешенка обыкновенная обнаружены углеводороды, кислоты, спирты, стерины и альдегиды. Омыление флюидного экстракта щелочью показало, что большая часть жирных кислот плодового тела вешенки обыкновенной находится в виде сложных эфиров - глицери-дов.
Наибольший интерес, с точки зрения питательной ценности и биологической активности во флюидном экстракте вешенки обыкно-
венной представляет наличие значительного количества ненасыщенных кислот - олеиновой (ы-9) и линолевой (ы-6).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Вассер С.П. Макромицеты: лекарственные свойства и биологические особенности. Киев: Велес, 2012, 285 с.
2. Гришин А.А., Луцкий В.И., Пензина Т.А., Полякова М.С., Осипенко С.Н., Дударева Л.В. Состав жирных кислот флюидного углекислотного экстракта гриба березовой губки Piptoporus betulinus (Bull.: fr.) Karst. Актуальные проблемы химии и биотехнологии. Материалыi I Всероссийской НПК, посвященной 85-летию ИРНИТУ, Иркутск, 2015, С.113—115.
3. Залепугин, Д. Ю., Тилькунова, Н. А., Черны-шова, И. В., Поляков, В. С. Развитие технологий, основанных на использовании сверхкритических флюидов // Сверхкритические флюиды: Теория и практика, 2006. №1. С. 27-51.
4. Коничев, А. С., Баурин, П. В., Федоровский Н. Н., Марахова, А. И., Якубович, Л. М., Черникова, М. А. Традиционные и современные методы экстракции биологически активных веществ из растительного сырья: перспективы, достоинства, недостатки. Вестник МГОУ//Серия естественные науки. 2011. № 3. С. 49-54.
5. Кравченко О. А., Хачатурян Э. Е., Росляков Ю.Ф. Возможность применения муки из грибов вешенка в качестве биологически активной добавки при производстве хлебобулочных изделий // Известия ВУЗов. Пищевая технология. 2009. №. 4. С. 5051.
6. Соломко Э. Ф. Высший съедобный бази-диальный гриб вешенка обыкновенная Pleurotus ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm., как продуцент биомассы пищевого назначения. Киев: Ин-т бот. им. Н.Г. Холодного АН УССР, 1988, 186 c.
7. Cheung L. M., Cheung P. C. K., Ooi V. E. C. Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts, Food Chemistry, 2003, vol. 81, no. 2. pp. 249-255.
8. Gupta R. B., Shim J. J. Solubility in supercritical carbon dioxide. - CRC press, 2006.
9. Mau J. L., Lin H. C., Song S. F. Antioxidant properties of several specialty mushrooms. Food Research International, 2002, vol. 35, no. 6, pp. 519-526.
10. Stamets P. Growing gourmet and medicinal mushrooms. Berkeley: Ten Speed Press, 2000, vol. 3.
1. Vasser S.P. Makromitsety: lekarstvennye svois-tva i biologicheskie osobennosti. [Micromycetes : medicinal properties and biological features]. Kiev: Veles, 2012, 285 p.
2. Grishin A.A., Lutsky V.I., Penzina T.A., Polyako-va M.S., Osipenko S.N., Dudareva L.V. Sostav zhirnykh kislot flyuidnogo uglekislotnogo ekstrakta griba berezovoi gubki Piptoporus betulinus (Bull.: Fr.) Karst. [Fatty acid composition of fluid carbon dioxide extract of fruiting body of the fungus Piptoporus betulinus (Bull.: Fr.) Karst.]. Materialy 1 Vserossiiskoi nauchno-prakticheskoi konfer-entsii "Aktual'nye problemy khimii I biotekhnologii" [Proc. 1-st Sci. Pract. Conf. "Actual problems of chemistry and biotechnology"]. Irkutsk, 2015, pp. 113-115.
3. Zalepugin, D.Yu., Til'kunova, N.A., Cher-nyshova, I.V., Polyakov, V.S. Razvitie tekhnologii, osno-vannykh na ispol'zovanii sverkhkriticheskikh flyuidov [Development of the technologies based on the use of supercritical fluids]. Sverkriticheskie flyuidy: Teoriya i praktika - Supercritical Fluids: Theory and Practice, 2006, no. 1, pp. 27-51.
4. Konichev, A.S., Baurin, P.V., Fedorovskii, N.N., Marakhova, A.I., Yakubovich, L.M., Chernikova, M.A. Traditsionnye i sovremennye metody ekstraktsii biolog-icheski aktivnykh veshchestv iz rastitel'nogo syr'ya: per-spektivy, dostoinstva, nedostatki. [Traditional and modern methods of extraction of biologically active substances from plants: prospects, advantages, disadvantages]. Vestnik MGOU. Seriya estestvennye nauki - Bulletin MSRU. Natural sciences, 2011, no. 3, pp. 49-54.
5. Kravchenko O. A., Khachaturyan E.E., Roslya-kov Yu.F. Vozmozhnost' primeneniya muki iz gribov veshenka v kachestve biologicheski aktivnoi dobavki pri proizvodstve khlebobulochnykh izdelii [The possibility of using flour from oyster mushrooms as a dietary supplement in the production of bakery products]. Izvestiya VUZov. Pishchevaya tekhnologiya - News of institutes of higher education. Food technology, 2009, no. 4, pp. 5051.
6. Solomko E.F. Vysshii s"edobnyi bazidial'nyi grib veshenka obyknovennaya Pleurotus ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm., kak produtsent biomassy pishchevogo naznacheniya. [Higher Basidiomycetes edible oyster mushroom Pleurotus ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm., As a producer of biomass edible]. In: Trydy Instituta botaniki imeni N.G. Holodnogo AN USSR [Proc. N.G. Kholodnyi Institute of Botany AS USSR]. Kiev, 1988, 186 p.
7. Cheung L.M., Cheung P.C.K., Ooi V.E.C. Anti-oxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts. Food Chemistry, 2003, vol. 81, no. 2, pp. 249255.
8. Gupta R.B., Shim J.J. Solubility in supercritical carbon dioxide. CRC press Publ., 2006, 894 p.
9. Mau J.L., Lin H.C., Song S.F. Antioxidant properties of several specialty mushrooms. Food Research International, 2002, vol. 35, no. 6, pp. 519-526.
10. Stamets P. Growing gourmet and medicinal mushrooms. Berkeley, Ten Speed Press, 2000, vol. 3, 586 p.
Статья поступила в редакцию 30.11.2015 г.
