CC BY
64
Л1СОВЕ ТА САДОВО-ПАРКОВЕ ГОСПОДАРСТВО
Розшл I
УДК 630*165.53 Доц. Р. Т. Гут, канд. бюл. наук; тж. М.В. Радченко;
проф. Г. Т. Криницький, д-р бюл. наук - УкрДЛТУ
СУЧАСН1 МЕТОДИ ВИД1ЛЕННЯ СУМАРНО1 ДНК З РОСЛИННИХ ОРГАН1ЗМ1В
Наведено сучасш даш щодо особливостей структурно-функщонально'1 органь зацп геному рослинних opгaнiзмiв, пpoaнaлiзoвaнo oснoвнi методичш пiдхoди до ви-дiлення сумарно'1 ДНК з рослинного мaтеpiaлу та принципи, що лежать в 1хнш осно-Bi. Знання переваг та недолшв вказаних метoдiв е запорукою отримання успiшних pезультaтiв при проведенш мoлекуляpнo-бioлoгiчних дoслiджень.
Doc. R.T. Gout; Eng. M.V. Radchenko; Prof. G.T. Krynytskyy - USUFWT Plant nucleic acid purification, technical hints and application
This guide gives an overview of recent advances in molecular genetics to genome structure and organization in plants, and also main techniques used for plant nucleic acid purification which provides useful guidelines for successful results.
Бюрозмагття нашо!" планети включае близько двох мшьйотв вид1в ор-гашзм1в. У ход1 евoлюцii бюсфери одш види оргашзм1в виникали, inmi зни-кали. У найближчш перспектив1 бюрозмагття нашо1' планети може скороти-тись на 500 тисяч вид1в i шдвид1в тварин та рослин [4]. Тому вивчення гене-тичного потенщалу лшв, розробка заход1в щодо збереження 1'хнього бюрозмагття е завданням першочергового значення.
Питання охорони i збереження лшв тюно пов'язане з генетико-селек-цшними роботами. В ютори розвитку цих робгт можна видшити декшька принципово важливих i яюсно вщмшних напрямюв: еколого-географ1чний, фенотишчний, генетикo-пoпуляцiйний та морфо^зюлопчний [1, 6, 7]. На даний час особливо актуальним е використання в цих напрямках молекуляр-но-генетичних мapкеpiв, oскiльки вони дозволяють зрозумгти структуру геному рослинних opгaнiзмiв, його opгaнiзaцiю та функцюнування [9, 50], досль дити гени, що визначають розвиток будь-яко1' ознаки рослинного оргашзму [5]. Незважаючи на те, що молекулярно-генетичш маркери в дослщженнях лiсoвих пopiд використовуються значно рщше, нiж в дoслiдженнях сшьсько-
господарських культур, в останш роки нагромадилась велика кшьюсть шфор-мацп стосовно оргашзаци, картування та еволюци 1хнього геному, диферен-цшно1 експреси гешв [10, 18, 21], а також молекулярних маркерiв, методiв створення рекомбшантних ДНК та мiжродового перенесення гешв. Отримаш данi дають змогу долати мiжвидовi бар'ери у дерев люових порiд. З викорис-танням методiв генетично! шженери створено ряд трансгенних рослин, що мiстять гени фшогенетично неспорiднених рослин i навiть вищих i нижчих органiзмiв, включаючи бактери та вiруси [12, 28, 35, 74].
Водночас необхщно зауважити, що генно-шженерш методи дослщ-жень люових деревних порiд, якi б дозволили створити банки даних для щен-тифшаци генотипiв у популяцiях, на люонасшневих дiлянках i плантацiях, скласти генетичш карти плюсових та ел^них дерев, дослiдити фундамен-тальнi процеси первинного та вторинного бюсинтезу, створити трансгенш рослини е нерозробленими. Для виршення сучасних лiсiвничих завдань, в першу чергу, необхщно освогги методи екстракци та очистки ДНК основних люоутворюючих порiд Украши.
Молекулярна оргашзащя геному ядра, хлоропласт1в та мггохондрш
л1сових деревних вид1в
Дезоксирибонуклеlновi кислоти (ДНК), рибонуклеlновi кислоти (РНК) та бшки - унiверсальнi детермiнанти генетично1 поведiнки прокарiотичних та еукарiотичних органiзмiв. У рослинних органiзмiв генетична шформащя е роз-подiленою мiж органелами кштини: ядром, мiтохондрiями та хлоропластами.
Загальна характеристика генетичног тформаци ядра. ДНК ядра входить до складу хромосом. Хромосоми - це стабшьш ядерш структури, здатш до самовщтворення i забезпечення рiвного розподiлу генетичного ма-терiалу при подiлi клггин. Цi властивостi забезпечують три структуры еле-менти: реплiкатори, центромери i теломери. До складу хромосом входить: хроматин - комплекс дволанцюгово1 ДНК з пстоновими (Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4) та iншими бшками, якi переважно називають негiстоновими (рис. 1) [59]. В ДНК ядра закодована основна шформащя про будову структурних та ката-л^ичних бшюв i перебiг основних молекулярних та бiохiмiчних процесiв у клiтинi та органiзмi в цiлому.
Нуклеотидний склад ядерно1 ДНК вищих рослин характеризуеться висо-кою варiабельнiстю - вщ 34 % ГЦ-пар у Пнкго до 51 % ГЦ-пар у представниюв роду Ногс1еит [8]. Одночасно яДНК1 характеризуеться дуже високим вмютом 5-метилцитозину. Так, у деяких рослин метильовано до 50 % залишюв цитозину [2, 3]. Кшьюсть хромосом, що припадае на один геном у люових деревних по-рщ, змiнюеться вiд 6 до 23 серед покритонасшних видав [77] та вщ 9 до 19 серед голонасшних [33]. Найкраще дослщженими голонасiнними деревними породами е види родини Ртаевав. Кшьюсть хромосом, що припадае на 1х геном, е кратною 11 або 12, тобто характеризуеться незначною мiнливiстю.
1 яДНК - ядерна ДНК; мДНК - мггохондршна ДНК; хДНК - хлоропластна ДНК; тРНК - транспортна РНК; рРНК - рибосомна РНК, тпн - тисяч пар нуклеотид1в; СТАВ-метод - метод з використанням основного компонента цетилтриметиламоншбромвд, ПЛР - пол1меразна ланцюгова реакщя.
Голонасiннi лiсовi деревнi види - це переважно рослини з диплощним набором хромосом рiвним 24; виняток становить Pseudotsuga menziesii, що мае 2n = 26. Полшлощи серед голонасiнних трапляються дуже рiдко [34, 35, 77]. Вщомо тiльки кiлька природних полшлощв, серед яких вид Sequoia sempervirens - гексаплощ (2n = 6*11 = 66), вид Junipersus chnensis pfitzeriana -тетраплощ (2n = 4x11 = 44).
6
кл]тиннин екстракт
\
шнно-оЬимнна смола (позитивно гаряджена)
0
кароопдратл,
ОШКЧ1, TU ill.
ВИСОКОСО-."1Ы1ВНИ
розчын IMNaCl
0
Ö 6
6 -►
Ö
щ ^ НуКЛЙНОВ!
KIIC.IÖTII
CTOpOIIIII КОМПОНЕНТ»
Ослджения er ¡толом, обробки рнбонуклеазою
очищен» .ДНК
Рис. 1. Видлення сумарноХ ДНК рослин з використанням юнообмтноХхроматографы: а - додавання смоли безпосередньо до клтинних екстракт1в; б - додавання клтинних екстракт1в до смоли, упакованог в хроматограф1чшй колонц
Цитолопчними дослщженнями родини Ртаевав показано значну по-дiбнiсть карютишв (одна субметацентрична та одинадцять метацентричних
хромосом на геном) [56, 62]. Через вщсутшсть процесу подвшного заплщ-нення, ендосперм голонасшних видiв е гаплощним i тому широко використо-вуеться в генетичних наукових дослiдженнях. Яскравими прикладами дерев-них голонасiнних рослин, що мютять гаплощний набiр хромосом в ендоспер-мi, е роди Pinus, Abies, Cedrus [57]. Щоправда у 1997 рощ С. Шкот та М. Ма-утавi [57], використовуючи метод лазерно! цитометрп, продемонстрували, що деякi види роду Cupressaceae мютять полшлощний ендосперм. Зокрема, ендосперми Cupressus arizonica, Juniperus oxycedrus та Thuja orientalis мю-тять в ядрi гапло'дний або дипло'дний набiр хромосом, тодi як Cupressus atlantica та Cupressus sempervirens можуть мютити гапло'дний, дипло'дний, трипло'дний, тетрапло'дний, пентапло'дний та гексапло'дний набори хромосом. Таю полшлощи очевидно виникають внаслiдок внутрiшньоклiтинного повторного подiлу (ендоредуплжацп), або внутрiшньоклiтинного мiтозу [47], якому передуе множинне злиття ядер [57]. Ось чому перед проведенням на-уково-генетичних дослщжень необхiдно перевiрити площшсть ендосперму.
Порiвняно з голонасiнними явище полшлощи у покритонасiнних роз-повсюджене ширше [77], зокрема, у родiв Salix n=19 (родина Salicacea), Tilia n=41 (родина Tiliaceae), Morus, n=14 (родина Moraceae), Acer, n=13 (родина Aceraceae). Явище полшлощп не виявлено, у деяких родiв родини Fagaceae (Fagus, Quer cus, n=12); Myrtaceae (Eucaliptus, n=11); Diptocarpaceae (Dipto-carpus, n=10). Таю дат дозволяють припустити, що полшло'дая вiдiграе важ-ливу роль в еволюцп покритoнасiнних [27].
Лiсовi деревнi рослини характеризуються великою рiзноманiтнiстю ДНК ядра або значною гетерогеншстю яДНК [23, 31, 45, 49, 73]. Для вивчен-ня 1хшх розмiрiв використовуеться ряд методiв: мiкроспектрофотометрiя [49], кiнетика реасощаци [37, 38, 58], проточна цитометрiя [48, 73]. Сукуп-нiсть цих трьох методiв дае чiткi та достовiрнi результати. У табл. 1 подаш розмiри геномiв та кiлькiсть хромосом в кштинах лiсових деревних порiд.
Використовуючи метод юнетики реасощаци ДНК, Мжша та Готта [48, 73] вперше у 1973 роцi показали, що геноми голонасшних видiв, зокрема Pinus resinosa, Pinus banksiana, Picea glauca, мають бiльшi розмiри, шж геноми покритонасiнних [23]. Наступнi експерименти показали, що близько % геному хвойних становлять повторюваш нуклеотидш послщовност i тiльки 2030 % припадае на уткальт послщовност [58, 37]. Таким чином, велик роз-мiри ядерного геному у рослинних органiзмiв пов,язанi iз наявшстю значно1 кiлькостi повторюваних нуклеотидних послщовностей. Водночас унiкальнi послiдовностi (одна котя на геном) у голонасшних можуть становити мен-ше, нiж 1 % вщ загально1 кiлькостi ядерно1 ДНК [37, 38].
Повторюванi послщовност ДНК у геномi належать до двох категорш: тандемнi повторюванi нуклеотидш послщовност^ якi включають теломернi, субтеломерш та центромернi палiндромнi повтори, сателггну ДНК та нукле-отиднi послщовност генiв, що кодують рибосомну (рРНК) та транспортну РНК (тРНК) [16, 17, 20, 29, 30, 43, 51, 61] i нуклеотидш послщовност^ розсь яш по геному (дисперсш), що включають рiзнi родини ретротранспозошв [41],. Основними серед них е ретроелементи з довгими юнцевими повторами
(LT^-елементи), ретроелементи без довгих кшцевих noBTopiB, коротю еле-менти, розсiянi по геному ядра (SINE's), довгi елементи, розЫяш по геному ядра (LINE's) та псевдогени [15, 76, 40]. Ц розшяш по геному повторюванi одинищ можуть бути мовчазними або активно експресуватися.
Табл. 1. Шльк'шть хромосом та po3Mipu геному у л'шових деревних nopid [10].
Видова назва Дипловдний набiр хромосом (2n) DNA (pg/1C)
Abies alba Mill. 24 16.6
Cunninghamia lanceolata Hook. 22 13.6
Cupressus sempervirens L. 22 11.6
Eucalyptus grandis 22 0.6
Ginkgo biloba L. 24 10.0
Larix laricina K. Koch. 24 9.5
Larix decidua Mill. 24 9.9
Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng. 22 6.5
Picea abies (L.) Karsten 24 14.8
Picea glauca Voss 24 20.2
Picea mariana B.S.P. 24 15.8
Pinus contorta Deugl. Ex Loud 24 18.9
Pinus elliottii Engelm 24 23.3
Pinus gerardiana Wall. 24 28.7
Pinus lambertiana Dougl. 24 29.6
Pinus pinaster Ait. 24 24.4
Pinus radiata Don. 24 22.0
Pinus rigida Mill. 24 20.8
Pinus resinosa Ait. 24 23.4
Pinus strobus L. 24 25.7
Pinus sylvestris L. 24 27.8
Pinus taeda L. 24 21.7
Pinus wallichiana A.B. Jacks 24 24.6
Populus deltoides Marsh. 38 0.5
Pseudotsuga menziesii Franco 26 19.1
Найновiшi методи вивчення структури, функцш та еволюци геному базуються на генетичних ДНК-маркерах, як вщкрили нову еру в молекуляр-нiй генетицi рослин та люових деревних порiд зокрема. Розрiзняють маркери дiлянок структурних генiв, що кодують амiнокислотнi послiдовностi, маркери некодуючих дiлянок генiв та маркери рiзних послiдовностей ДНК, вщно-шення яких до структурних генiв, як правило, невщоме.
Загальна характеристика генетичног тформаци хлоропласт1в. У багатьох видiв рослин добре вивчена та охарактеризована структура геному хлороплас^в. Вш представлений двонитковою кiльцевою молекулою ДНК, яка в межах виду залишаеться достатньо консервативною [25, 52]. Розмiри тако! ДНК сягають вiд 120 до 217 тпн., переважно 150 тпн. Геном хлороплас-тiв рослин, зокрема деревних люових порiд, включае певну кшьюсть генiв (але далеко не вЫх), необхiдних для функцiонування хлороплас^в i шдтри-мання !х структури: чотири гени, що кодують рРНК (16S, 23S, 4.5S, 5S), близько тридцяти генiв, що кодують тРНК, гени фггосистем, rbcL-ген (кодуе
велику субодиницю рибулозо-1,5-бiсфосфаткарбоксилази/оксигенази) i бiльш шж 50 гешв, якi кодують бшки. Рiзниця у po3Mipax reHOMiB хлороплас^в пов'язана з наявнiстю пари великих (10-28 тпн) швертованих noBTopiB, що розмежовуються малою (SSC) та великою (LSC) однокопшними дiлянками ДНК [32, 38, 52, 66, 74]. Значну кшьюсть мутацш щентифшовано в так зва-них "гарячих точках", часто локалiзованих поблизу SftC-райошв. Наприклад, у Pseudotsuga menziensii таю точки вщкрш! у гiпeрварiабeльних дiлянках повторюваних послщовностей геному хлоропластiв, переважно як результат частково1 дуплтаци гeнiв тРНК. Мутацп в "гарячих точках" - це основна вщ-мiннiсть консервативних послщовностей ДНК хлоропластiв серед видiв роду Pinus та eudie Larix decidua, Larix leptolepis, Picea glauca, Pseudotsuga menziensii, Sequoia sempervirens, Calocedrus deccurens, Cryptomeria japonica. На ос-новi послщовностей ДНК хлороплас^в, особливо rbcL-гешв, дослщжуються фiлогeнeтичнi зв'язки деревних видiв, зокрема у родин Betulaceae, Salicaceae, Pinaceae, Cupresaceae, Taxodiaceae [10].
Загальна характеристика генетичног тформаци мтохондрт. Геноми мггохондрш вищих рослин складаються з юльцевих та лшшних молекул ДНК рiзних розмiрiв (200 тпн - 2400 тпн.) [55, 64, 65]. Великий розмiр геному м^охондрш зумовлений наявшстю iнтронiв та повторюваних послщов-ностей (великих та малих диспергованих повторiв, що служать центрами го-мологiчноï рeкомбiнацiï) [53, 54, 55], бшьшими розмiрами гeнiв, дуплшащ-ями гешв, бiльшою кiлькiстю гeнiв, процесами рекомбшаци геному мгтохон-дрiй з геномами хлороплас^в або ядра [53, 54]. Гени мггохондрш кодують бшки, задгянг до процесгв транскрипцiï, трансляцiï, реплгкаци та рекомбшаци свого геному, а також бшки окисного фосфорилювання (atp-гени) та продук-ти, якг забезпечують цитоплазматичну стерильшсть у особин чоловгчо1' статг (cms-гени) [44, 63].
мДНК еволющонуе набагато швидше, шж ядерна, а мутаци у нгй вгд-буваються майже у десять разгв частгше. В результат виникае широкий внут-ргшньовидовий полгморфгзм, i гстотнг змгни виявляються навгть в межах кгль-кох поколгнь. Завдяки високгй швидкостг мутування полгморфгзм центргв рестрикци стае дуже зручним параметром при популяцшно-генетичних дос-лгдженнях рослин [24, 69].
Методи видшення сумарно'1 ДНК деревних рослин
Основоположними методами в чисельних молекулярно-бюлопчних шдходах, що використовуються при вивченнг рослинних органгзмгв i якг виз-начають усшх дослiджeнь, е методи видiлeння сумарно!" ДНК. Всг вони включають чотири основш мeтодичнi етапи: вгд6гр та збeрiгання рослинно1' фгто-маси; руйнування рослинного матeрiалу з подальшим вивiльнeнням вмюту клгган; видалення уЫх компонeнтiв кштинних eкстрактiв за винятком ДНК; концентрування отриманих прeпаратiв ДНК [11, 60].
Етап eîdôopy рослинног фтомаси та ïï зберкання. Етап вщбору рослинно1' фгтомаси е надзвичайно важливим, осюльки впливае на легюсть та eфeктивнiсть видiлeння, а також концентращю та чистоту водного розчину
видшено! сумарно! ДНК. Залежно вiд подальшо! експериментально! мети на цьому етапi необхщно враховувати: вiк рослин, тип рослинно! тканини, яку використовуватимуть у робот^ специфiчнi умови 11 росту (штенсившсть та спектр свiтла, тривалiсть свгглового дня, кiлькiсть поживних речовин та во-логи) [11, 70]. Вш, тип тканини та умови росту рослини впливають на 11 фгго-масу та накопичення таких вторинних метаболтв як полiсахариди, полiфе-ноли, флавоно!ди. Цi метаболiти за сво!ми хiмiчними властивостями часто подiбнi до нукле!нових кислот, тому !х важко усунути з препара^в ДНК. Вторинш метаболiти та хiмiчнi реагенти (сол^ феноли), що залишаються в результат процедури видiлення сумарно! ДНК, спричиняють непередбачува-нi результати подальших експерименлв: пригнiчують ферментативнi реакци (обернену транскрипщю, ПЛР, реакци рестрикцiйного аналiзу), призводять до неточного мшроспектрофотометричного аналiзу, до змши електрофоре-тично! рухливостi молекул ДНК, до помилок дозування, пов'язаних iз шдви-щеною в,язкiстю препара^в ДНК, до деградаци нукле!нових кислот [70].
Етап вщбору рослинно! фiтомаси найчастiше базуеться на виборi моло-дих, здорових рослин, яю часто, перед безпосереднiм використанням в експе-риментах, помiщають на один або два дш у темноту. Така процедура дозволяе запоб^и накопиченню високого рiвня вторинних метаболiтiв у тканинах рослин. Для правильного вщбору рослинно! тканини необхiдно враховувати 11 вiк, пло!дшсть, кiлькiсть вакуолей, властивост клiтинних стiнок (наприклад юль-кiсть лiгнiну), рiвень генетично! експресй. Переважно обирають молодi тканини, яю складаються з велико! юлькосп дрiбних клiтин i якi, вщповщно, мю-тять бiльшу кiлькiсть молекул нукле!нових кислот, а !хт клггинш стiнки лег-ше руйнуються. Крiм цього, вiдповiдний об'ем молодо! тканини мютить мен-ше вторинних рослинних метаболтв порiвняно зi старими тканинами.
Рослинна фггомаса рiдко використовуеться вщразу пiсля вiдбору, тому розроблеш простi та ефективнi методи !! зберiгання, якi забезпечують щ-люшсть нукле!нових кислот. Неправильне зберiгання рослинних зразюв призводить до деградацi! молекул ДНК. Розрiзняють тимчасовi та довготри-валi методи зберiгання рослинних зразюв. До тимчасових методiв належать збершання при температурi +4 °С, в герметично закритих емностях з метою запобшання депдратаци. Тривалiсть такого збершання залежить вiд робочого матерiалу: листковi пластинки i видозмiненi листковi пластинки (голки) -один день, бруньки та зразки великого розмiру (гшки, кореш) - юлька днiв. Серед довготривалих методiв зберiгання розрiзняють:
• заморожування, коли ц1л1 або розтерт! зразки зберггаються при температур -80 °С;
• висушування, з використанням сил1кагел1в, депдратор1в харчових продукив, люфшзатор1в [19, 70]. Тривалшть виготовлення таких зразшв повинна скла-дати менше, н1ж 24 год з наступним збер1ганням в герметичних умовах, в темнот^ при шмнатнш температура
• збер1гання розтертих зразшв у буферах л1зису, яю розроблеш ввдповвдними комерцшними ф1рмами.
Етап руйнування рослинного матерЬалу з подальшим вивтьненням вмЬсту клтин. Етап руйнування рослинного матерiалу проводять з метою подальшого вивiльнення рщкого вмiсту клiтин [60]. Недостатне руйнування
зpазкiв веде дс непсвнсгс вивiльнення i вщпсвщнс нижчс1" кoнцентpацiï мс-лекул ДНК y вoднoмy poзчинi. Рoзpiзняють два ocнoвниx пiдxoди да pyйнy-вання: фiзичнi, кoли клiтини pocлинниx зpазкiв pyйнyютьcя тpивалoю меxа-тчнйю дieю та бioxiмiчнi, кoли лiзиc клiтин здiйcнюeтьcя з викopиcтанням xiмiчниx pеагентiв, якi poзщеплюють клiтиннi етшки i мембpани клiтин та opганел. Bикopиcтання бioxiмiчниx метoдiв для pocлинниx opганiзмiв e малo-ефективним, чаетше заcтocoвyють фiзичнi метoди. Д0 фiзичниx метoдiв на-лежить poзтиpання pocлиннoгo матеpiалy з викopиcтанням cтyпки та товкача, гoмoгенiзатopа абo млинка.
Найбшьш пoшиpений метoд pyйнyвання пoлягаe в poзтиpаннi зpазкiв pocлиннoгo матеpiалy за пpиcyтнocтi piдкoгo азoтy з викopиcтанням cтyпки та тoвкача. Таким метoдoм мoжна poзтеpти як великy, так i малу кiлькicть pocлиннoï ф^гома^. Малий oб'eм фiтoмаcи чаcтo poзтиpають, викopиcтoвy-ючи мoдифiкoване oбладнання. Moдифiкацiя залежить вiд типу pocлиннoï тканини i базyeтьcя на pyйнyваннi з викopиcтанням cклянoгo бpycка, плаети-кoвoгo тoвкачика абo деpев'янoï палички та мiкpoцентpифyжнoï пpoбipки oб'eмoм 1,5-2 мл. Залежш вiд надxoдження pocлиннoгo зpазка такi мoдифiка-ци пpизвoдять дo зниження кoнцентpацiï ДНК в oтpиманиx пpепаpатаx на 2080 %. Boднoчаc такi пiдxoди дoзвoляють уникнути пеpеxpеcнoгo забpyднення зpазкiв у cеpiйниx дocлiдаx.
Гoмoгенiзатopи - це отещальш poзpoбленi вiдпoвiдними фipмами ^и-лади для pyйнyвання м'якиx cвiжиx тканин в ^жутшеи бyфеpy лiзиcy. ïx дiя базyeтьcя на oбеpтаннi poтopа з дуже великoю швидкicтю, шр cпpичиняe pyйнy-вання тканин шмб^ванням тypбyлентнoï та меxанiчнoï ди. Таю гoмoгенiзатo-pи не викopиcтoвyютьcя для pyйнyвання твеpдиx тканин (гiлки, кopенi).
Млинки - це пpилади для pyйнyвання м'якиx та твеpдиx тканин poc-линнoгo opганiзмy за дoпoмoгoю вoльфpамoвoкаpбiдниx, cталевиx абo отля-нж кyльoк. Тканини pyйнyютьcя у пpиcyтнocтi бyфеpy лiзиcy, якщo зpазoк cвiжий, абo у пpиcyтнocтi piдкoгo азoтy, якщo матеpiал замopoжений. Опти-мальш паpаметpи pyйнyвання визначаютьcя емпipичнo i залежать вiд poзмi-py, типу кyльoк, швидкocтi ïx oбеpтання та мoделi млинка, тpивалocтi pyйнy-вання i кiлькocтi виxiднoгo матеpiалy. Деяю млинки дoзвoляють poзтеpти дo 200 зpазкiв пpoтягoм 2-4 xвилини.
Еmап вuдалeння усЫ кoмпoнeнmiв клimuннux eксmpакmiв за вuняm-ком ДНК. Оcнoвними кoмпoнентами poзтеpтoгo pocлиннoгo матеpiалy e зpyйнoванi клiтиннi cтiнки, мембpани та piдкий вмicт клiтини. Д0 такта зpаз-кiв дoдають бyфеp екcтpагyвання й ycyвають залишки клiтинниx cтiнoк та мембpан шляxoм центpифyгyвання. ^и цьoмy в клiтинниx екcтpактаx зали-шаютьcя в ocнoвнoмy бiлки, РНК, ДНК та вyглевoди. Для ycyнення з такoгo екcтpактy ycix ^м^не^ив, за виняткoм ДНК, викopиcтoвyють двi пpинци-пoвo piзнi метoдики: ioнooбмiннy xpoматoгpафiю на cмoлаx; oбpoбкy клггин-ниx екcтpактiв xiмiчними та бioxiмiчними pеагентами [45, 46, 60].
Bикopиcтання ioнooбмiннoï xpoматoгpафiï базyeтьcя на ^инциш електpocтатичниx взаeмoдiй. Hегативнo заpядженi мoлекyли ДНК зв'язують-cя з пoзитивнo заpядженими пoвеpxнями ioнooбмiнниx xpoматoгpафiчниx
смол (рис. 1). Цього можна досягти двома способами: додаванням смоли без-посередньо до кштинних екстракпв (рис. 1а); додаванням кштинних екстрак-тiв до смоли, упаковано! в хроматографiчнiй колонщ (рис. 1б). Нуклеiновi кислоти зв'язуються iз смолою i залишаються у колонщ, а сторонш компо-ненти, що несуть позитивний або нейтральний заряд, проходять через колонку. Однак необхщно зауважити, що додавання розчишв з високою концен-тращею солей дестабшзуе електростатичну взаемодда молекул нукле!нових кислот та iонообмiнноi смоли.
Розрiзняють ряд методiв видiлення сумарно! ДНК шляхом обробки клiтинних екстрагав хiмiчними та бiохiмiчними реагентами: СТАВ-метод [26, 45, 60, 67, 68]; метод Делапорта [11, 22]; метод Рауза [11]; центрифугу-вання в градiентi хлористого цезда [11], !х модифiкацii та методи з викорис-танням комерцiйних наборiв реагентiв.
СТАВ-метод видшення сумарно! ДНК з рослинних органiзмiв ба-зуеться на використанш детергенту бромiду цетилтриметиламонiю (ЦТМБ), який утворюе нерозчиннi комплекси з нукле!новими кислотами (рис. 2). Такi комплекси осаджують центрифугуванням, при цьому в бюретщ екстрагуван-ня залишаються бшки, вуглеводи та iншi стороннi компоненти. Осад ресус-пендують в 1М ИаС1, що спричиняе дисоцiацiю комплекЫв нукле!нова кислота - ЦТМБ. Далi нуклеiновi кислоти осаджують етанолом, а РНК усувають
Рис. 2. Видшення сумарно'1 ДНКрослин СТАВ-методом
Метод Делапорта видшення сумарно! ДНК з рослинних органiзмiв ба-зуеться на проведенш таких операцiй: розтираннi рослинних тканин у буферi лiзису, що мiстить детергент додецилсульфат натрiю; фшьтруванш лiзату; осадженнi стороннiх компонентiв екстракту (бiлкiв, вуглеводiв та iн.) розчина-ми з високою концентрацiею солей; обробщ рибонуклеазою водних розчинiв ДНК з наступним переосадженням спиртом [11, 22]. Концентращя та чистота препарапв ДНК, видшених таким методом, е рiзною залежно вiд виду рослин.
Метод Рауза полягае у мехашчному руйнуванш рослинних зразкiв з наступною iнкубацiею у буферi екстрагування, при температурi +90°С протя-гом 20 хв. [68]. Такий лiзат використовують безпосередньо у подальших дос-лщженнях. Препарати сумарно! ДНК рослин, отримаш за методом Рауза, часто непридатш для використання у чутливих реакщях. Вони мiстять стороннi компоненти, що пригшчують ряд ферментативних реакцш та часто призво-дять до деградацй ДНК. У зв'язку з цим даний метод в експериментальнш робот використовуеться рiдко.
Табл. 2. Порiвняльна характеристика методiв видшення сумарноИДНК
рослинних органiзмiв
Параметри Комер-цшт на-бори ре-агенив СТАВ-метод Метод Делапорта Метод Рауза Центрифугу-вання в гра-д1ени хлористого цезш
Зразки Рослинт кл1тини та тканини Рослинт кл1тини та тканини Св1ж1 рослинт тканини Рослинт кл1тини та тканини Рослинт тканини
Використання методу для велико! кшькост1 вид1в рослин так т т т так
Яшсть препарапв ДНК висока середня низька дуже низька висока
Осадження ета-нолом необов'яз-кове обов'язкове обов'язкове необов'яз-кове обов'язкове
Час отримання 24 зразшв ДНК менше одте! години 2-4 години, переосад-ження про-тягом ноч1 2-4 години, переосад-ження про-тягом ноч1 одна година 12 годин
Зручтсть методу висока середня низька висока низька
Методи зберь гання зразшв ДНК довготер-мшов1 довготермь нов1 тимчасов1 св1ж1 зразки довготермь нов1
Результати використання препарата ДНК у по-дальшш робот! ввдмшт середт низьш дуже _ низьш ввдмшт
Метод видшення сумарно! ДНК рослинних органiзмiв центрифугуван-ням у градiентi хлористого цезда базуеться на механiчному руйнуванш тканин, !х екстрагуваннi в буфер^ що мiстить детергент, обробщ екстракту про-
теазами, осадженш нукле!нових кислот iзопропанолом, центрифугуваннi водного розчину очищено! сумарно! ДНК у градаент! хлористого цезiю в присут-ностi бромистого етидiю [60]. Останнш етап тривае кiлька десятюв годин. Препарати ДНК, отриманi вказаним методом, е високоочищеними та високо-концентрованими.
Методи видiлення сумарно! ДНК з рослинних органiзмiв з викорис-танням комерцiйних наборiв реагенлв базуються на двох основних шдходах, наведених вище. Деякi набори реактивiв забезпечують видiлення сумарно! ДНК iз 192 зразкiв одночасно. Такi методи видшення е надзвичайно ефектив-ними, оскшьки дають змогу отримувати ДНК високо! чистоти та концентра-ци за невеликий промiжок часу. Однак, у зв'язку з дороговизною, !х доступ-нiсть е обмеженою.
Пщсумовуючи сказане вище необхiдно зазначити, що даний огляд розкривае суть методичних пiдходiв до видшення сумарно! ДНК з рослинних об'екпв. 1хш переваги та недолжи вiдображенi у табл. 2.
Лггература
1. Алтухов Ю.П., Крутовский К.В., Духарев В.А. и др. Биохимическая генетика популяций лесных древесных растений// кн. Лесная генетика, селекция и физиология древесных растений. Материалы Международного симпозиума. - М.: 1989. - С. 16-24.
2. Богданов Ю.Ф., Прозоров А.А. и др. Молекулярная организация генома растений// Организация генома. - М.: И-во "Наука" 1989. - С. 218.
3. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и его значение в диференцировке видов и еволюции геномов// М: И-во МГУ 1972. - С. 279.
4. Голубець М.А. Пшвка життя// Льв1в: Пол. 1997. - С. 186.
5. Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение// Физиология и Биохимия Культ. Растений 2002 т.34. № 4. - С. 279-295.
6. Криницкий Г.Т. Морфофизиологические основы селекции дреевсных растений// Киев Автореф. 1993. - С. 46
7. Роне В.М. Генетический анализ природних популяций// Отбор лесних древесных. - Рига: Зинатне 1978. - С. 271.
8. Слюсаренко А.Г. Первинна структура ДНК i положення оргашзм1в у систем!// М.: В-во МДУ 1972.С. 196.
9. Ahuja M.R. Genetic engineering in forest trees: State of the art and future perspectives. In: S.M. Jain and S.C. Minocha (Eds.)// Molecular Biology of Woody Plants 2000 Vol. 1 P. 31-49.
10. Ahuja M.R. Recent advances in molecular genetics of forest trees// Euphytica 2001.Vol. 121 P. 173-195.
11. Ausubel F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology// New York: John Wiley and Sons, 1пС. 1990. P. 4.3.1.
12. Baucher M., Monties B., van Montagu M., Boerjan W. Biosynthesis and genetic engineering of lignin// Crit Rev Plant Sci. 1998. Vol. 17. P. 125-197;
13. Baxevanis A.D. The molecular Biology Database Collection: 2002 update// Nucleic Acids Research. 2002. Vol. 30. P. 1-12.
14. Bennetzen J.L., Schrick K., Springer P.S. Brown W.E., San-Miguel P. Active maize genes are modified and flanked by diverse classes of modified highly repetitive DNA// Genome 1994. Vol. 37. P. 565-576.
15. Bennetzen J.L. The contribution of retroelements to plant genome organization, function and evolution// Trends in Microbiol. 1996. Vol. 4. P. 347-353.
16. Bobola M.S., Eckert R.T., Stapelfeldt K., Smith D.S., Gueette D. Using nuclear and organelle DNA markers to discriminate among Picea rubens, Picea mariana and their hybrids// Can J For ReS. 1996. Vol. 26. P. 433-443.
HiiyK'QBiiii BiCHHK, 2003, BHn. 13.2
17. Bobola M.S., Smith D.E., Klien A.S. Five major nuclear ribosomal repeats represent a large and variable fraction of the genomic DNA of Picea rubens and Picea mariana// Mol Biol Evol. 1992. Vol. 9. P. 125-137.
18. Cervera M.T., Plomion C., Malpica C. Molecular markers and genome mapping in woody plants.// Molecular Biology of Woody Plants 2000a Vol. 1. P. 375-394.
19. Chase M.W., Hills H.H. Silica gel: an ideal material for field preservation of leaf samples for DNA studies// Taxon 1991. Vol. 40. P. 215.
20. Cullis C.A., Griessen G.P., Gorman S.W., Teasdale R.D. the 25S, 18S, and 5S ribosomal RNA genes from Pinus radiate// Molecular Genetics of Forest Trees 1988. P. 34-40.
21. Dean C., Schmidt R. Plant genome: A current molecular description.//Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1995. Vol. 46. P. 395-418.
22. Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. A plant DNA minipreparation: version II// Plant Mol Biol ReP. 1993. Vol. 1.P. 19.
23. Dhillon S.S. DNA in tree species// J.M. Bonga & D.J. Durzan (Eds.), Cell and Tissue Culture in Forestry 1987. Vol.1. P. 298-313.
24. Dong J., Wagner D.B. Taxonomic and population differentiation of mitochondrial diversity in Pinus banksiana and Pinus contorta// Theor Appl Genet. 1993. Vol. 86. P. 573-578.
25. Downie S.R., Palmer J.D. Use of chloroplast DNA rearragments in restructuring plant phylogeny// Molecular Systematics in Plants P. 14-35.
26. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue// Phytochemical Bulletin 1987. Vol. 19. P. 11.
27. Drewry A. The G-banded Karyotype of Pinus resinosa Ait.// Silvae Genet. 1988. Vol.37. P. 218-221.
28. Fladung M., Kumar S., Ahuja M.R. Genetic transformation of Populus genotypes with different chimeric gene constructs: transformation efficiency and molecular analysis// Transgenic Research 1997. Vol. 6. P. 111-121.
29. Flavell R. The structure and control expression of ribosomal RNA genes// Oxford Surv. Plant Mol Cell Biol 3. 1986. P. 251-274.
30. Gorman S.W., Teasdale R.D., Cullis C.A. Structure and organization of the 5S RNA genes (5S DNA) in Pinus radiata (Pinaceae). Plant Syst Evol. 1992. Vol.183. P. 223-234.
31. Grattapaglia D., Bradshaw H.D. Nuclear DNA amounts of commercially important Eucaliptus species and hybrids// Can. J For ReS. 1994. Vol.24. P. 1074-1078.
32. Hiratsuka J., Shimada H., Whittier R. et al. The complete sequence of the rice (Oriza sativa) chloroplast genome: intermolecular recombination between distinct tRNA genes accounts for a major plastid inversion during the evolution of cereals// Mol Gen Genet. 1989. Vol. 217. P. 185-194.
33. Khoshoo, T.N. Chromosome numbers in gymnosperms// Silvae Genet. 1961. Vol. 10. P. 1-9.
34. Khoshoo, T.N. Polyploidy in gymnosperm// Evolution 1959. Vol.13. P. 24-39.
35. Klopfestein N.B., McNabb H.S., Hart E.R. et al. Transformation of Populus hybrids to study and improve pest resistance// Silvae Genet. 1993 Vol. 42. P. 86-90.
36. Klug A. Les Prix Nobel// Stockholm, Sweden, Nobel Foundation. 1982. P. 93.
37. Kriebel H.B. DNA sequence components of the Pinus strobus nuclear genome// Can J For ReS. 1985. Vol.15. P. 1-4.
38. Kriebel H.B. Molecular structure of forest trees// Clonal forestry I. Genetics and Bi-otecnology P. 224-240.
39. Kornberg R.D., Klug A.// Sci Amer. 1981. Vol. 244(2). P. 52.
40. Kumar A., Bennetzen J.L. Plant retrotransposons// Annu Rev Genet. 1999. Vol. 33. P. 479-532.
41. Lapitan N.L.V. Organization and evolution of higher plant nuclear genomes// Genome 1992. Vol. 35. P. 171-181.
42. Liu Y.G., Mitsukawa N., Oosumi T., Whiller R.F. Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert Junctions by thermal asymmetric interlaced PCR// Plant J. 1995. Vol. 8. P. 457.
43. Long E.O., David I.B. Repeated genes in eukaryotes// Annu Rev Plant Biochem. 1980. Vol. 49. P. 727-764.
44. Mackenzie S., Mcintosh L. Higher plant mitochondria// Plant Cell 1999. Vol. 11. P. 571-585.
1. ^icoBe Ta cag0B0-napK0Be rocnogapcTBO
19
45. Murrey M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA// Nucleic Acid ReS. 1980. Vol. 8. P. 4321.
46. Murray B.G. Nuclear DNA amounts in gymnosperms// Ann Bot 82 (Supplement A). 1998. P. 3-15.
47. Nagl W. Cdc2-kinase, cyclins and the switch from proliferation to polyploidization// Protopamsma 1995. Vol.188 P. 144-150.
48. O'Brien I.E.W., Smith D.R., Cardner R.C., Murray W.J. et al. Flow cytometric determination of genome size in Pinus// Plant Science 1996. Vol. 115. P. 91-99.
49. Ohri D., Khoshoo T.N. Genome size in gymnosperms// Plant syst Evol. 1986. Vol. 153. P.119-132.
50. Ouborg N.J., Piquot Y., Van Groenendael J.M. Population genetics, molecular markers and the study of dispersal in plants.// Journal of Ecology 1999. Vol. 87 P. 551-568.
51. Quijada A.A., Liston A., Delgado P., Vaques-Lobo A., Alvarez-Buylla E.R. Variation in the nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) region of Pinus rzedowskii revealed by PCR-RFLP.// Theor Appl Genet. 1998. Vol. 96. P. 539-544.
52. Palmer J.D. Chloroplast DNA evolution and biosystematics uses of chloroplast DNA variation// Am Naturalist 1987. Vol.130. P. 6-29.
53. Palmer J.D. Chloroplast and mitochondrial genome evolution in land plants// Plant Gene Research: Cell Organelles 1992. P. 99-133.
54. Palmer J.D., Soltis D., Soltis P. Large size and complex structure of mitochondrial DNA in two nonfloweing land plants// Curr Genet. 1992. Vol. 21. P. 125-129.
55. Palmer J.D., Adams K.L., Cho Y., Parcinson C.L., Qui Y.-L., Song K. Dynamic of plant mitochondrial genome: Mobile genes and introns and highly variable mutation rates.// Variation and Evolution in Plants and Microorganism. 2000. P. 35-57.
56. Pederick, L.A. Chromosome relationships between Pinus species// Silvae Genet. 1970. Vol.19. P. 171-179.
57. Pichot C., M. El Maataoui Flow cytomeric evidence for multiple ploidy levels in the endosperm of some gymnosperm species// Theor Appl Genet 1997. Vol.94 P. 865-870.
58. Rake A.W., Miksche J.P., Hall R.B. Hanson K.M. DNA reassociation kinetics for four conifers// Can J genet Cytol. 1980. Vol22. P. 69-79.
59. Raven P.H., Johnson G.B. Biology// WBC/McGraw-Hill 1990. P. 327.
60. Richards E., Reichardt M., Rogers S. Preparation of genomic DNA from plant tissue// Ausubel F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1994. P. 2.3.1.
61. Rogers S.O., Bendich A.J. Ribosomal RNA genes in plants: variability in copy number and in the intergenic spacer// Plant Mol Biol. 1987. Vol. 9. P. 509-520.
62. Saylor, L.C. Karyotype analysis of genus Pinus - subgenus Pinus// Silvae Genet. 1972. Vol. 21. P. 155-163.
63. Sederoff R.R. Molecular mechanism of mitochondrial-genome evolution in higher plants// Am Naturalist 1987. Vol.130. P. 30-45.
64. Sederoff R.R., Stomp A.-M., Gwynn B. et al. Application of recombinant DNA techniques to pines: A Molecular approach to genetic engineering in forestry// Cell and Tissue Culture in Forestry 1987. Vol. 1. P. 314-329.
65. Sederoff R.R. Tree genomes: What will we understand about them by the year 2020 and how might we use that knowledge// Forest Genetic and Sustainability 2000. P. 23-30.
66. Shinozaci K., Ohme M., Tanaka M. et al. The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome: its organization and expression// EMBO 1986. Vol. 5. P. 2043-2049.
67. Sperisen et al. Comparison of two rapid DNA extraction protocols for gymnosperms for application in population genetic and phylogenetic studies// Forest Genetics, in press 2000.
68. Steiner J.J., Poklemba C.J., Fjellstorm R.G., Elliot L.F. A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses// Nucleic Acid ReS. 1995. Vol. 23. P. 2569.
69. Strauss S.H., Hong H.-P., Hipkins V.D. High levels of population differentiation for mitochondrial DNA haplotypes in Pinus radiata, muricata, and attenuata// Theor Appl Genet. 1993. Vol. 86. P. 605-611.
70. Systma K.K., Givnish T.J., Smith j.F., Hahn W.J. Collection and storage of plant samples for macromolecular comparisons// Methods Enzymology 1993. Vol. 234. P. 23.
71. Taberlet P., Gielly L., Pautou G., Bouvet J. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA// Plant Mol Biol. 1991. Vol. 17. P. 1150.
72. Wagner D.B. Nuclear, chloroplast, and mitochondrial DNA polymorphisms as biochemical markers in population genetic analyses of forest trees// New Forest 1992. Vol. 6. P. 373-390.
73. Wakamiya I., Newton R.J., Price J.S. Genome size and environmental factors in the genus Pinus// Am J Bot. 1993. Vol. 80. P. 1235-1241.
74. Wakasugi T., Tsudzuki J., Ito S., Nakashima K., Tsudzuki T., Sugiura M. Loss of all ndh genes as determined by sequencing the entire chloroplast genome of the black pine Pinus thunbergii// Proc Natl Acad Sci USA 1994. Vol. 91. P. 9794-9798.
75. Wenk A.R., Quinn M., Whetten R.W., Pullman G. and Sederoff R. High-frequency Agrobacterium- mediated transformation of Norway spruce (Picea abies) and loblolly pine (Pinus ta-eda)// Plant Mol Biol. 1999. Vol. 39. P. 407-416.
76. Wessler S.R., Bureau T.E., White S.E. LTR-transposons and MITEs: important players in the evolution of plant genomes// Curr Opinions Genet. 1995. Vol. 5. P. 814-821.
77. Wright J.W. Introduction to Forest Genetics// Academic Press 1976.
УДК 630*181.28 Доц. Ю.М. Дебринюк, канд. с.-г. наук - УкрДЛТУ
Р1СТ I ПРОДУКТИВШСТЬ PSEUDOTSUGA MENZIESII (MIRB.) FRANCO У Л1СОВИХ КУЛЬТУРАХ УКРАШСЬКОГО
РОЗТОЧЧЯ
Розглянуто аспекти росту та особливосп накопичення деревини в чистих i змь шаних насадженнях псевдотсуги Мензюа. Звернуто увагу на схеми i способи змшу-вання, розмщення посадкових мюць, сумюшсть зростання з шшими породами, перевагу створення чистих деревосташв, вибiр придатних для культивування провенieнцiй.
Doc. Yu.M. Debrinuk - USUFWT
Growth and productivity of Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco at forest
cultures of Ukrainian Roztochya
It is discussed the aspect of growth and wood mass accumulation peculiarities at pure and mixed stands of Douglas fir by age periods. It was analyzed such factors as even tree distribution of trees on plots; compatibility of mixed growth with other species; advantages of pure stands creation; selection of adapted provenancies for cultivation. At same time, it was studied such silvicultural aspects as schemes and methods of mixing, distribution of planting sites.
За винятком Populus trichocarpa, жодна шша деревна порода океашчно! зони хвойних лю1в Швшчно! Америки не мае такого розтягнутого та еколопчно дифереицiйоваиого природного ареалу, як Pseudotsuga menziesi [27].
Псевдотсуга або дуглаЫя, одна 1з найбшьш поширених хвойних порщ Канади i США [47], була описана двома вщомими шотландськими вченими -Арчибальдом Мензiесом (1754-1842) та Девщом Дугласом (1799-1834), iмена яких i вщображеш в новш i старш видовiй назвах породи - Pseudotsuga menziesii Mirb. Franco та P. douglasii Lindl. Трапляеться також ще назва-синошм породи - P. taxifolia Lamb. Birtton.
Як повщомляе H. Knuchel [38], природний ареал псевдотсуги Мензюа простягаеться в меридiальному напрямку вщ пiвночi Мексiки до Британсько! Колумбп, по тихоокеанському узбережжю доходить до Калiфорнii. 1з заходу на схщ простягаеться вiд о. Ванкувер до штату Альберта. На швденному схо-дi досягае захiдноi частини Техасу за винятком штату Невади.
