CC BY
0
Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2025. Т. 25, вып. 1. С. 118-123 Izvestiya of Saratov University. Chemistry. Biology. Ecology, 2025, vol. 25, iss. 1, pp. 118-123
https://ichbe.sgu.ru https://doi.org/10.18500/1816-9775-2025-25-1-118-123, EDN: YTPZRA
Научная статья УДК 574.5:579.64(470)
Субстратный спектр аборигенных углеводородокисляющих бактерий, выделенных из почв с различным уровнем антропогенного воздействия
Д. М. Голубев1 н, Д. Д. Нестеркина1, А. К. Тарасюк1, О. С. Глинская1, Е. В. Плешакова1, Е. В. Глинская12, О. В. Нечаева3
Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского, Россия, 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83
2Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю. А., Россия, 410054, г. Саратов, ул. Политехническая, д. 77 Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова, 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4
Голубев Дмитрий Михайлович, студент, инженер кафедры микробиологии и физиологии растений, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-9471-6066
Нестеркина Дарья Дмитриевна, студент кафедры микробиологии и физиологии растений, [email protected], https://orcid. org/0009-0006-5953-3647
Тарасюк Анна Константиновна, студент, инженер кафедры микробиологии и физиологии растений, [email protected], https://orcid. org/0009-0000-6664-3218
Глинская Ольга Сергеевна, студент, [email protected], https://orcid.org/0009-0009-5531-2937
Плешакова Екатерина Владимировна, доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биофизики, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-3836-0258
Глинская Елена Владимировна, кандидат биологических наук, 1доцент кафедры микробиологии и физиологии растений, 2доцент кафедры экологии и техносферной безопасности, [email protected], https://orcid.org/0000-0002-1675-5438 Нечаева Ольга Викторовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-3331-1051
Аннотация. Исследован субстратный спектр углеводородокисляющих бактерий, выделенных из почв Саратовской области: почв г. Балаково (хроническое антропогенное загрязнение) и почв сельскохозяйственного назначения с. Новокривовка (однократное углеводородное загрязнение). Установлено, что микроорганизмы, выделенные из урбопочв г. Балаково, находящихся в условиях постоянного антропогенного воздействия, обладали более широким субстратным спектром. Выявлено, что наибольшее количество углеводородных субстратов, включая сырую нефть и индивидуальные углеводороды, были способны разлагать 4 микроорганизма, выделенные из урбопочв г. Балаково: Acinetobacter lwoffii R44, Bacillus circulans E75, B. horikoshii P22, Ochrobactrum gallinifaecis I59 и один -Paenibacilluspolymyxa S31, выделенный из почвы с. Новокривовка. 100 % штаммов бактерий, выделенных из почв с. Новокривовка, использовали сырую нефть в качестве единственного источника углерода и 75% микроорганизмов, выделенных из почв г. Балако-во. Число бактерий, способных использовать для роста ароматические углеводороды, было в 2-3 раза выше среди изолятов почв г. Балаково. Аборигенные углеводородокисляющие бактерии с широким субстратным спектром могут быть использованы для конструирования биопрепарата, направленного на проведение восстановительных мероприятий контаминированных почвенных экосистем. Ключевые слова: почвы, техногенное загрязнение, углеводородокисляющие бактерии, субстратный спектр
Для цитирования: Голубев Д. М., Нестеркина Д. Д., Тарасюк А. К., Глинская О. С., Плешакова Е. В., Глинская Е. В., Нечаева О. В. Субстратный спектр аборигенных углеводородокисляющих бактерий, выделенных из почв с различным уровнем антропогенного воздействия // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2025. Т. 25, вып. 1. С. 118-123. https:// doi.org/10.18500/1816-9775-2025-25-1-118-123, EDN: YTPZRA
Статья опубликована на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International (CC-BY 4.0) Article
The substrate spectrum of native hydrocarbon-oxidizing bacteria isolated from soils with different levels of anthropogenic impact
D. M. Golubev1 :, D. D. Nesterkina1, A. K. Tarasyuk1, O. S. Glinskaya1, E. V. Pleshakova1, E. V. Glinskaya12, O. V. Nechaeva3
1Saratov State University, 83 Astrakhanskaya St., Saratov 410012, Russia
2Yuri Gagarin State Technical University of Saratov, 77 Politekhnicheskaya St., Saratov 410054, Russia
3National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V. I. Kulakov, 4 Akademika Oparina St., Moscow 117997, Russia
© Голубев Д. М., Нестеркина Д. Д., Тарасюк А. К., Глинская О. С., Плешакова Е. В., Глинская Е. В., Нечаева О. В., 2025
Dmitry M. Golubev, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-9471-6066 Darya D. Nesterkina, [email protected], https://orcid.org/0009-0006-5953-3647 Anna K. Tarasyuk, [email protected], https://orcid.org/0009-0000-6664-3218 Olga S. Glinskaya, [email protected], https://orcid.org/0009-0009-5531-2937 Yekaterina V. Pleshakova, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-3836-0258 Elena V. Glinskaya, [email protected], https://orcid.org/0000-0002-1675-5438 Olga V. Nechaeva, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-3331-1051
Abstract. The substrate spectrum of hydrocarbon-oxidizing bacteria isolated from the soils of the Saratov region was studied: the soils of Balakovo (chronic anthropogenic pollution) and agricultural soils of Novokrivovka village (single hydrocarbon pollution). It was found that the microorganisms isolated from the urban soils of Balakovo, being under constant anthropogenic influence, had a wider substrate spectrum. It was revealed that 4 microorganisms isolated from the urban soils of Balakovo: Acinetobacter lwoffii R44, Bacillus circulans E75, B. horikoshii P22, Ochrobactrum gal-linifaecis I59, and also Paenibacillus polymyxa S31, isolated from the soil of Novokrivovka village, were capable of decomposing the largest amount of hydrocarbon substrates, including crude oil and individual hydrocarbons. 100% of bacterial strains isolated from the soils of Novokrivovka village and 75% of microorganisms isolated from the soils of Balakovo used crude oil as the only carbon source. The number of bacteria capable of using aromatic hydrocarbons for growth was 2-3 times higher among isolates from the soils of Balakovo. Native hydrocarbon-oxidizing bacteria with a wide substrate spectrum can be used to design a biological product aimed at carrying out restoration activities of contaminated soil ecosystems. Keywords: soils, man-made pollution, hydrocarbon-oxidizing bacteria, substrate spectrum
For citation: Golubev D. M., Nesterkina D. D., Tarasyuk A. K., Glinskaya O. S. Pleshakova E. V., Glinskaya E. V., Nechaeva O. V. The substrate spectrum of native hydrocarbon-oxidizing bacteria isolated from soils with different levels of anthropogenic impact. Izvestiya of Saratov University. Chemistry. Biology. Ecology,2025, vol. 25, iss. 1, pp. 118-123 (in Russian). https://doi.org/10.18500/1816-9775-2025-25-1-118-123, EDN: YTPZRA This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC-BY 4.0)
Введение
Загрязнение окружающей среды представляет собой одно из основных последствий технического прогресса. Строительство и эксплуатация нефтеперерабатывающих скважин, а также транспортировка и переработка углеводородного сырья напрямую связаны с разливами нефти и нефтепродуктов. В связи с малой растворимостью, неполярностью и ги-дрофобностью компонентов нефти возникают затруднения при использовании физических методов очистки территорий [1]. Технологии химической рекультивации, несмотря на очистительную эффективность, могут оказывать вторичное загрязняющее воздействие на почву, нарушая ее структуру и состав применяемыми реагентами [2].
Наиболее эффективным способом для устранения углеводородных загрязнений почв является биоремедиация - восстановление территорий с использованием живых организмов для уменьшения неблагоприятного воздействия поллютантов [3]. При разработке метода по проведению очистительных мероприятий нефтезагрязненных почв необходимо учитывать эффективность используемых штаммов углеводородокисляющих бактерий, в частности, разнообразие подвергаемых деградации субстратов.
Цель исследования - сравнительное изучение субстратного спектра аборигенных почвен-
ных бактерий, выделенных из почв Саратовской области с различным уровнем и характером антропогенного воздействия.
Материалы и методы
Работа проводилась на базе кафедры микробиологии и физиологии растений Саратовского национального исследовательского государственного университета имени Н. Г. Чернышевского.
Объектом исследования являлись угле-водородокисляющие микроорганизмы, выделенные из следующих почв Саратовской области: 1) почв земельных участков сельскохозяйственного назначения на северо-западе от с. Новокривовка (Советский район) (Н), территория которых была загрязнена водо-нефтяной эмульсией в результате утечки из нефтепровода «НСП-22 Головные сооружения» компании ОАО «Саратовнефтегаз». Среднее содержание нефтепродуктов в почвах составляло 3129 ± 64 мг/кг; 2) городских почв г. Ба-лаково (Балаковский район), промышленного центра Саратовской области (Б). Среднее содержание нефтепродуктов в почвах составляло 615 ±12 мг/кг.
Идентификацию изолятов проводили по определителю бактерий Берджи путем анализа фенотипических признаков [4], а также с использованием метода MALDI-ToF масс-спектрометрии на приборе MALDI масс-
спектрометре серии microflex (Bruker Daltonics GmbH, Германия). В качестве матрицы использовали а-циано-4-гидроксикоричную кислоту (Bruker Daltonics GmbH, Германия). При идентификации применяли стандартную библиотеку спектров Biotyper компании Bruker Daltonics GmbH.
Для изучения субстратного спектра угле-водородокисляющих бактерий использовали следующие субстраты: предельные углеводороды - гексан, гептан, декан, ароматические углеводороды - толуол, фенол, а также сырую нефть Соколовогорского нефтяного месторождения (Волго-Уральский нефтяной бассейн, Саратов, Россия). Способность бактерий к деструкции исследуемых субстратов определяли с помощью метода лунок. Субстрат вносили в лунку диаметром 8 мм в центре агаризованной минеральной среды М9 в чашке Петри. Во-
круг лунки с субстратом осуществляли посев культур штрихом. Культивирование бактерий проводили одновременно и на поверхности твердого субстрата, и в парах углеводородов, за счет их равномерной диффузии и частичного испарения. Учет результатов осуществляли в течение 7 дней инкубации в термостате при 28° C. О деструкции углеводородов судили по интенсивности роста тест-культур [5].
Результаты и их обсуждение
По результатам экспериментов выявлено, что микроорганизмы Acinetobacter lwoffii R44 (Б), Bacillus circulans E75 (Б), B. horikoshii P22 (Б), Ochrobactrum gallinifaecis I59 (Б), Paenibacillus polymyxa S31 (Н) были способны разлагать все используемые углеводородные субстраты (рис. 1).
Acinetobacter hvoffii R44 (Б) Bacillus circulans E75 (Б) В. circulans D1S (H) B. horikoshii P22 (Б) B. lentimorbhis J64 (Б) B. licheniformis MSS (Hi В. muralt Vi 6 (H) B. pnmilus S35 (Б) B. pumilus L27 (H) Citrobacterß-enndii K29 (H) Mammalücoccus lentus TIS (Б) Ochrobactrum gallinifaecis 159 (Б) Paenibacillus glucanolyticus Fl 5 (Hi P. polymyxa S31 (H) Paenighitamicibacter psychrophenolicus W48 (Б)
M Сырая нефть ■ Гексан ■ Гептан Я Декан ■ Толуол Фенол
Рис. 1. Спектр углеводородов, разлагаемых углеводородокисляющими микроорганизмами, штаммы: Б - из почв
г. Балаково; Н - из почв с. Новокривовка (цвет онлайн) Fig. 1. The spectrum of oxidized hydrocarbons by hydrocarbon-oxidizing microorganisms, strains: Б - from the city of
Balakovo; Н - from the village of Novokrivovka (color online)
Штаммы бактерий были изолированы из почв г. Балаково, в черте и пригородах которого расположены крупные предприятия энергетической, химической, металлургической отрасли, а также других профилей (транспортной, строительной, пищевой, легкой и пр.). Один из микроорганизмов с широким субстратным
спектром - PaembacШuspolymyxa Б31 (Н) - был выделен из почвы с. Новокривовка, загрязненной водонефтяной эмульсией вследствие прорыва нефтепровода.
Изоляты почв г. Балаково, как правило, обладали более широким субстратным спектром (рис. 2).
с. Новокривовка / Novokrivovka village
г. Балаково / Balakovo city
--Количество используемых субстратов /
The amount of substrates used
Рис. 2. Количество углеводородных субстратов для роста бактерий, выделенных из почв с однократным
(с. Новокривовка) и хроническим (г. Балаково) загрязнением Fig. 2. The amount of hydrocarbon substrates for growth of bacteria isolated from soils with single (Novokrivovka village)
and chronic (Balakovo city) contamination
75% бактерий, выделенных из урбопочв г. Балаково, были способны к деструкции пяти и более углеводородных источников, лишь B. pumilus S35 использовал менее трех. Микроорганизмы, изолированные из почв с. Новокривовка, разлагали меньшее количество углеводородов: лишь 33 % были способны использовать пять и более субстратов, а Paenibacillus glucanolyticus F15 - только сырую нефть.
Было выяснено, что 75% почвенных изо-лятов г. Балаково были способны к окислению
сырой нефти (таблица). 62,5% бактерий могли усваивать нециклические углеводороды, 75% - проявляли ферментативную активность по отношению к циклическим углеводородам. Все микроорганизмы, выделенные из почв с. Новокривовка, были способны к использованию сырой нефти в качестве единственного источника углерода; 57% штаммов бактерий могли превращать нециклические углеводороды, 14,3% изолятов проявляли окислительные свойства по отношению к циклическим углеводородам.
Количество штаммов углеводородокисляющих бактерий, способных к окислению углеводородов, % Table. Number of strains of hydrocarbon-oxidizing bacteria capable of oxidizing hydrocarbons, %
Место выделения штаммов / The place of strain isolation Углеводородный субстрат / Hydrocarbon substrate
Гексан / Hexane Гептан / Heptane Декан / Decane Толуол / Toluene Фенол / Phenol Сырая нефть / Crude oil
г. Балаково / Balakovo city 75 62,5 100 87,5 87,5 75
с. Новокривовка / Novokrivovka village 71,5 85,7 71,5 28,6 42,9 100
Полученные результаты свидетельствуют о большей приспособленности к деградации углеводородов бактерий урбопочв г. Балаково, что связано с их высокой адаптацией к условиям хронического загрязнения промышленного города. Штаммы с. Новокривовка были выделены из природных почв, не подвергавшихся
систематическому воздействию поллютантов, из-за чего они оказались менее восприимчивы к углеводородным субстратам.
В нашем исследовании бактерии рода Bacillus оказались способны к деградации широкого спектра изученных субстратов. Проводившиеся A. Das с соавторами геномные иссле-
дования показали, что многие виды этого рода обладают генами, кодирующими ферменты, которые участвуют в расщеплении углеводородов, а также синтезируют поверхностно-активные вещества, способствующие этому процессу [6]. В исследованиях Т. Ю. Коршуновой с соавторами была отмечена способность рода Ochrobactrum к утилизации разнообразных органических веществ, этому соответствуют и полученные нами данные о способности к деградации различных углеводородных субстратов микроорганизмом Ochrobactrum gallinifaecis I59, выделенным из урбопочв г. Балаково [7]. Бактериальный штамм Acinetobacter lwoffii R44, выделенный из почв г. Балаково, подтверждает высокую способность к биореме-диации, демонстрирующуюся в исследованиях других авторов [8].
Единственный почвенный изолят с. Но-вокривовка, способный к разложению всех исследуемых субстратов, относится к роду Paenibacillus. Известно, что представители этого рода являются перспективными биоре-медиантами: они могут разлагать сырую нефть, дизельное топливо, битум, дисульфидные масла, а также полициклические ароматические углеводороды, нафталин, фенантрен и пирен [9].
Заключение
Рекультивация загрязненных углеводородами почв направлена на снижение рисков для окружающей среды на объекте и за его пределами, а микробные сообщества способствуют облегчению ремедиации. Полученные данные будут полезны при разработке комплексного подхода для проведения восстановительных мероприятий антропогенно нарушенных почв, в том числе в Саратовской области. Микроорганизмы, способные разлагать наибольшее количество субстратов, являются перспективными агентами для биоремедиации.
Список литературы
1. Созина И. Д., Данилов А. С. Микробиологическая ремедиация нефтезагрязненных почв // Записки Горного института. 2023. Т. 260. С. 297-312. http:// dx.doi.org/10.31897/PMI.2023.8
2. Lv Y., Bao J., Zhu L. A comprehensive review of recent and perspective technologies and challenges for the
remediation of oil-contaminated sites // Energy Reports.
2022. Vol. 8. P. 7976-7988. https://doi.org/10.1016/j. egyr.2022.06.034
3. Menshakova M. Y., Moskvin K. K., Khodjaliev S. A. Study of the dynamics of oil destruction with the use of bacterial biological preparations in the conditions of the far North // BIO Web of Conferences. 2023. Vol. 63. P. 05011. https://doi.org/10.1051/bioconf/ 20236305011
4. Определитель бактерий Берджи : в 2 т. Т. 2 / под ред. Дж. Хоулт. М. : Мир, 1997. 368 с.
5. Руководство к практическим занятиям по микробиологии : практ. пособие / под ред. Н. С. Егорова. 2-е изд. М. : Изд-во Моск. ун-та, 1983. 251 с.
6. Das A., Das N., Rajkumari J., Pandey P., Pandey P. Exploring the bioremediation potential of Bacillus spp. for sustainable mitigation of hydrocarbon contaminants // Environmental Sustainability. 2024. P. 1-22. https://doi.org/10.1007/s42398-024-00309-9
7. Коршунова Т. Ю., Мухаматдьярова С. Р., Логинов О. Н. Новый штамм бактерии рода Ochrobactrum: свойства и филогенетическое положение // Известия Уфимского научного центра РАН. 2013. № 2. С. 90-94.
8. Al-Hadithi H. T., Al-Razzaq E. A., Fadhil G. F. Bio-remediation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Acinetobacter species isolated from ecological sources // Journal of Environmental Biology. 2017. Vol. 38, № 5. P. 785. http://doi.org/10.22438/jeb/38/57 MRN-422
9. Grady E. N., MacDonald J., LiuL, Richman A., Yuan Z.-H. Current knowledge and perspectives of Paenibacillus: A review // Microbial Cell Factories. 2016. Vol. 15. P. 1-18. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0603-7
References
1. Sozina I. D., Danilov A. S. Microbiological remediation of oil-contaminated soils. Journal of Mining Institute,
2023, vol. 260, pp. 297-312 (in Russian). http://dx.doi. org/10.31897/PMI.2023.8
2. Lv Y., Bao J., Zhu L. A comprehensive review of recent and perspective technologies and challenges for the remediation of oil-contaminated sites. Energy Reports, 2022, vol. 8, pp. 7976-7988. https://doi.org/10.1016/j. egyr.2022.06.034
3. Menshakova M. Y., Moskvin K. K., Khodjaliev S. A. Study of the dynamics of oil destruction with the use of bacterial biological preparations in the conditions of the Far North. BIO Web of Conferences, 2023, vol. 63, P. 05011. https://doi.org/10.1051/bioconf/ 20236305011
4. Opredelitel' bakteriy Berdzhi: v 2 t. T. 2. Pod red. Dzh. Khoult [Hoult J., ed. The determinant of Bergey bacteria: in 2 vols. Vol. 2]. Мoscow, Mir, 1997. 368 p. (in Russian).
5. Rukovodstvo k prakticheskim zanyatiyam po mikro-biologii: prakt. posobiye. Pod red. N. S. Egorova. 2-e izd. [Egorov N. S., ed. A guide to practical classes in microbiology. 2nd ed.]. Moscow, Moscow University Press, 1983. 251 p. (in Russian).
6. Das A., Das N., Rajkumari J., Pandey P., Pandey P. Exploring the bioremediation potential of Bacillus spp. for sustainable mitigation of hydrocarbon contaminants. Environmental Sustainability, 2024, pp. 1-22. https://doi.org/10.1007/s42398-024-00309-9
7. Korshunova T. Yu., Mukhamatdyarova S. R., Logi-nov O. N. New strain of the bacterium of the genus Ochrobactrum: Properties and phylogenetic situation.
Proceedings of the RAS Ufa Scientific Centre, 2013, no. 2, pp. 90-94 (in Russian).
8. Al-Hadithi H. T., Al-Razzaq E. A., Fadhil G. F. Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Acinetobacter species isolated from ecological sources. Journal of Environmental Biology, 2017, vol. 38, no. 5, pp. 785. http://doi.org/10.22438/ jeb/38/5/MRN-422
9. Grady E. N., Grady, E. N., MacDonald J., Liu L., Rich-man A., Yuan Z.-H. Current knowledge and perspectives of Paenibacillus: A review. Microbial Cell Factories, 2016, vol. 15, pp. 1-18. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0603-7
Поступила в редакцию 12.02.2025; одобрена после рецензирования 14.02.2025; принята к публикации 15.02.2025; опубликована 31.03.2025 The article was submitted 12.02.2025; approved after reviewing 14.02.2025; accepted for publication 15.02.2025; published 31.03.2025
