CC BY
112
УДК: 618.146-006.6-033.2:615.277.3
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КЛЕТОК КРОВИ ПОД ВЛИЯНИЕМ ЦИТОСТАТИКОВ У БОЛЬНЫХ С РЕЦИДИВАМИ И МЕТАСТАЗАМИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ (IN VITRO)
Г.А. Неродо, Н.Е. Левченко, Е.А. Гуськова, Н.К. Гуськова
ФГУ «РНИОИ Росздрава», Ростов-на-Дону
Проведено изучение влияния химиопрепаратов на структурно-функциональные характеристики клеток крови в условиях in vitro. Исследованы объем, электрическая проводимость и величина лазер-индуцированного светорассеяния популяций лейкоцитов (нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов) на гематологическом анализаторе LH-500 (Beckman Coulter) с использованием VCS-технологии. Выявлены значительные изменения VCS-показателей лейкоцитов периферической крови больных с рецидивами и метастазами рака шейки матки, характеризующиеся увеличением объема клеток, снижением проводимости и интенсивности светорассеяния, что может свидетельствовать о дестабилизации клеточных мембран и процессов внутриклеточного метаболизма. При проведении больным аутогемохимиоиммунотерапии (АГХИТ) от курса к курсу интенсивность изменений структурно-функциональных свойств нейтрофилов и лимфоцитов снижается, что свидетельствует о снижении гематологической токсичности химиотерапии на аутокрови, сочетанной с иммуностимулирующей терапией, а также о возможности использования VCS-показателей лейкоцитов для оценки эффективности АГХИТ и степени выраженности гематологической токсичности.
Ключевые слова: аутогемохимиоиммунотерапия, VCS-показатели, объем, электрическая проводимость, светорассеяние.
STRUCTURAL CHANGES OF BLOOD CELLS UNDER THE INFLUENCE OF CYTOSTATICS IN PATIENTS WITH RECURRENCES AND METASTASES OF CERVICAL CANCER (IN VITRO)
G.A. Nerodo, N.E. Levchenko, E.A. Guskova, N.K. Guskova Cancer Research Institute Rostov-on-Don
The influence of chemotherapeutic agents on structural-functional characteristics of blood cells in vitro has been studied. Such parameters as volume, electric conduction and quantity of laser-induced light-scatter of leukocyte populations (neutrophils, lymphocytes, monocytes, eosinophils) have been studied on hematologic analyzer LH-500 (Beckman Coulter) using VCS-technology. Significant changes of VCS-parameters of leukocytes of peripheral blood of patients with recurrences and metastases of cervical cancer have been revealed: increase of cell volume, reduction of conduction and intensity of light-scatter that may indicate to destabilization of cellular membranes and processes of intracellular metabolism. When patients received autohemochemoimmunotherapy (AHCIT) the intensity of changes of structural-functional properties of neutrophils and lymphocytes decreased with every course, which was indicative of reduction of toxicity of chemotherapy on autoblood combined with immunostimulating therapy and of the possibility to apply VCS-parameters of leukocytes for estimation of AHCIT efficacy and the degree of hematologic toxicity.
Key words: autohemochemoimmunotherapy, VCS-parameters, volume, electric conduction, light-scatter.
В последнее десятилетие объектом детального и разностороннего изучения среди онкоги-некологической патологии является рак шейки матки (РШМ). Наряду с ростом числа больных настораживает факт омоложения данного контингента пациенток и увеличение частоты запущенных форм заболевания. Несмотря на совершенствование методов диагностики и лечения, каждая вторая больная при распространенной форме РШМ погибает в течение первых 2 лет после установления диагноза [1]. Подавляющее большинство больных указанной
категории подлежит проведению лекарственной цитостатической терапии. Однако известно, что противоопухолевая химиотерапия вызывает ряд побочных реакций, связанных с токсическим действием цитостатических препаратов на активно обновляющиеся клеточные системы организма [2, 3, 4, 7]. Практически все противоопухолевые препараты обладают значительной гепато- и гематологической токсичностью [5, 6, 8]. Такая особенность противоопухолевой терапии диктует необходимость поиска новых режимов химиотерапии в сочетании с
методами иммунологического сопровождения, что требует, в свою очередь, проведения исследований по изучению влияния комбинаций химиопрепаратов как на саму опухоль, так и на нормальные ткани. Немаловажное значение имеет изучение влияния химиопрепаратов на клетки крови, прежде всего, для выяснения механизма терапевтического действия используемых препаратов, а также для уточнения патогенеза формирования токсических реакций, поиска критериев эффективности лечения и для своевременной разработки мер профилактики развития побочных реакций.
Целью настоящего исследования явилось изучение в условиях in vitro структурных изменений лейкоцитов у больных с рецидивами и метастазами РШМ.
Материал и методы
Объектом исследования служили образцы крови 19 больных с рецидивами и метастазами рака шейки матки, ранее не подвергавшихся химиотерапии. Средний возраст больных составил 49 лет с возрастным интервалом 39-60 лет. Контрольную группу составили 50 здоровых женщин-доноров аналогичной возрастной группы.
Забор крови осуществляли утром натощак. Аутогемохимиоиммунотерапию (АГХИТ) проводили в день забора аутокрови. Кровь в объеме 150-200 мл смешивали с химиопрепаратами с последующей инкубацией в течение 40 мин при температуре 370С. Использована комбинация химиопрепаратов: цисплатин+циклофосфан в дозах, соответствующих терапевтической. Исследования проводили до и после инкубации аутокрови с химиопрепаратами в начале каждого курса.
Изучение количественного и качественного состава периферической крови осуществляли на гематологическом анализаторе LH-500 (Beckman Coulter) с использованием VCS-технологии. Изучена структура популяций лейкоцитов: нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозино-филов по объему -V (Volume) составляющих их клеток, электрической проводимости - C (Conductivity) и величине лазер-индуцированного светорассеяния - S (Light Scatter).
По всем индивидуальным пробам крови для определения степени вариабельности всех измене-
ний в каждой популяции лейкоцитов для каждого исследуемого параметра вычислялось стандартное отклонение - SD (Standard Deviation).
Полученные результаты отражены в таблице и на диаграмме распределения лейкоцитов, где на оси X показана величина светорассеяния, на оси Y - значения объема.
Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Statistica, версия 6. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о существенных различиях VCS-параметров лейкоцитов периферической крови у больных с рецидивами и метастазами РШМ и у доноров.
Для больных характерно статистически достоверное увеличение объема нейтрофилов (р=0,0000), снижение показателей проводимости (р=0,0436) и, в большей степени, светорассеяния (р=0,0001), в сравнении с данными контрольной группы (таблица). При этом значительно увеличены значения стандартного отклонения (SD) для каждого из изучаемых показателей, что свидетельствует о гетерогенности нейтрофилов и о присутствии в популяции молодых клеточных форм, т.е. о «левом сдвиге». Общеизвестно, что снижение проводимости непосредственно связано с повышением сопротивления. Полагаем, что повышение сопротивления гранулоцитов при увеличении их объема обусловлено увеличением плотности внутренней среды клеток вследствие усиления гранулярности цитоплазмы и/или нарушения проницаемости клеточных мембран (как внешних, так и внутренних), то есть их дестабилизации. Известно также, что величина светорассеяния зависит от размеров клеток, их формы, характера клеточной поверхности, состояния внешней клеточной мембраны, то есть от величины светопоглощения. Так, клетки сферической формы имеют хорошее светорассеяние. Слабая интенсивность светорассеяния нейтрофилов крови на фоне увеличения их объема может быть следствием изменения формы и архитектоники клеточной поверхности, нарушения проницаемости клеточной мембраны, а также увеличения светопоглощения, которое, в
Таблица
Влияние полихимиотерапии на структурно-функциональные показатели лейкоцитов: нейтрофилов (NE), лимфоцитов (LY), моноцитов (MO), эозинофилов (EO) (in vitro)
Группы, исследуемые показатели NE LY MO EO
MEAN SD MEAN SD MEAN SD MEAN SD
Контроль n=50 V 142+0,790 18,82+0,360 85,0+0,398 14,99+0,369 165,3+1,685 18,2+0,856 163,6+1,266 19,82+0,456
C 140,2+0,463 6,19+0,164 110,9+0,540 11,63+0,349 118,9+0,856 4,68+0,117 143,0+1,569 6,69+0,127
S 142,5+0,591 6,23+0,106 64,05+0,456 10,96+0,752 85,8+0,908 9,65+ 0,328 198,3+1,6 3,58+0,11
До инкубации с химио-препаратами n=19 V 164,0+2,90 р=0,0000 28,67+2,40 р=0,00065 94,16+1,10 р=0,0000 18,38+1,03 р=0,0094 188,3+3,05 р=0,0000 27,25+2,40 р=0,0010 169,8+1,70 р=0,0050 26,03+3,91 р=0,0128
C 138,16+0,80 р=0,0436 10,41+0,98 р=0,0003 119,0+3,01 р=0,0101 17,26+1,47 р=0,0117 114,1+2,22 р=0,0103 12,72+1,46 р=0,0000 255,0+3,16 р=0,0031 13,17+2,77 р=0,0181
S 118,0+4,40 р=0,0001 12,89+0,80 р=0,0000 69,05+2,25 р=0,0288 16,55+0,56 р=0,0001 82,16+1,49 р=0,0271 10,92+0,482 р=0,0424 238,16+2,15 р=0,0430 9,52+0,63 р=0,0000
После инкубации с хими-опрепара-тами n=19 V 146,0+3,00 р=0,0323 р1=0,0043 20,64+0,77 р1=0,0099 81,5+0,76 р=0,0024 р1=0,0000 16,7+0,66 р=0,0318 р=0,0269 170,5+2,44 р1=0,0010 22,08+1,744 р=0,0287 167,1+1,37 р=0,0111 р1=0,0001 20,26+1,08 р1=0,0310
C 151,87+4,13 р=0,0015 р1=0,0026 8,23+0,63 р=0,0040 р1=0,0243 125,16+1,24 р=0,0000 р1=0,0315 12,9+1,33 р=0,0031 127,3+2,56 р=0,0056 р1=0,0218 8,72+1,192 р=0,0020 177,0+1,34 р=0,0000 11,8+1,27 р=0,0005
S 133,0+2,21 р=0,0006 р1=0,0401 10,27+0,71 р=0,0232 р1=0,0000 77,83+2,25 р=0,0000 р1=0,0197 14,1+0,711 р=0,0043 р1=0,0383 93,16+2,05 р=0,0015 10,05+0,458 200,3+2,02 р1=0,0183 9,19+0,46 р=0,0000
Примечания: р - достоверность различий относительно контроля; p1 - достоверность различий между сопоставляемыми группами; V (volumе) - объем, C (conductivity) - проводимость, S (scatter) - светорассеяние; MEAN - среднее значение изучаемого показателя; SD - (Standard Deviation) - стандартное отклонение, характеризует степень вариабельности всех изменений исследуемого параметра.
свою очередь, зависит от плотности внутренней среды клетки, обусловленной наличием токсо-генной зернистости или других дистрофических изменений в клетке - процессов, отражающих высокую степень опухолевой интоксикации.
Подтверждение тому - отмеченные в гемограммах, практически у каждой больной, ускорение СОЭ, составившее в среднем по группе 37,0±0,31мм/ч, а также нейтрофилез (3,08±0,46*109/л) и выраженная лимфопения (0,98±0,21х109/л).
Лимфоциты (таблица) характеризовались, аналогично нейтрофилам, достоверным увеличением объема клеток (р=0,0000), что в сочета-
нии с повышенным значением SD (р=0,0094) указывает на присутствие в популяции незрелых клеточных форм. Показатели проводимости и светорассеяния значительно повышены в отличие от таковых у нейтрофилов и лиц контрольной группы, что подтверждает присутствие молодых клеточных форм. Соответственно, повышены средние значения показателя SD проводимости и светорассеяния.
Характер изменений VCS-параметров моноцитов и эозинофилов носит направленность, описанную для нейтрофилов.
Особый интерес представляют данные, полученные после инкубации крови больных с
химиопрепаратами. Так, общее количество лейкоцитов составило 3,1±0,49х 109/л, что на 25,1% меньше, чем до инкубации (4,14±0,43*109/л). То есть потери были менее значительными, чем ожидалось. Для всех клеточных линий отмечена одна общая тенденция - достоверное статистически значимое снижение объема клеток, увеличение электрической проводимости и интенсивности светорассеяния. Данное движение клеточных популяций позволяет судить о положительной или отрицательной динамике VCS-параметров. Учитывая снижение после инкубации с химиопрепаратами общего количества лейкоцитов и абсолютного содержания в единице объема крови каждой клеточной популяции, можно предположить, что большая часть погибших клеток представлена преимущественно молодыми формами, что объясняет, в определенной степени, снижение значений объема клеток. Увеличение проводимости и светорассеяния, в свою очередь, свидетельствует о дестабилизации клеточных мембран, нарушениях клеточного метаболизма.
Исходя из полученных данных, наибольшую устойчивость к воздействию цитостатиков продемонстрировали моноциты и лимфоциты, численность которых после инкубации снизилась незначительно: на 0 % и 10% соответственно, наименьшую - эозинофилы и нейтрофилы. Количество эозинофилов после инкубации снизилось в среднем на 28,6 %, нейтрофилов -на 21,3 %.
Примечательно, что у больных, перенесших 2-3 курса АГХИТ, при обнаружении положительного эффекта на лечение наблюдается снижение интенсивности деформируемости клеток, проявляющееся в уменьшении потери численности клеток, снижении интенсивности изменений VCS-параметров. По-видимому, это свидетельствует о подавлении чувствительности клеток крови к воздействию химиопрепаратов в процессе АГХИТ, что приводит к минимизации токсического эффекта использу-
емой комбинации цитостатиков на аутокрови, то есть развивается сенсибилизация клеток крови и, как следствие, происходит снижение гематологической токсичности АГХИТ. Подтверждение тому - данные клинических наблюдений, свидетельствующие об отсутствии выраженных токсических реакций у больных в процессе АГХИТ и, в особенности, на поздних этапах лечения.
Таким образом, положительная динамика изменений VCS-показателей, свидетельствующая о снижении гематологической токсичности с каждым последующим курсом, может быть связана с включением в схему АГХТ иммунно-стимулирующей терапии.
Полученные результаты демонстрируют информативность VCS-показателей лейкоцитов и возможность их использования в качестве критериев эффективности АГХИТ. При этом наиболее перспективными в качестве прогностических показателей нам представляются V, S и SD V нейтрофилов, а также V и SD V лимфоцитов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бородин И.Ю., Красильников С.Э., Юкляева Н.В., ОбуховаЛ.А. Структурные изменения в регионарных лимфатических узлах при раке шейки матки в условиях системного введения цитостатиков // Сибирский онкологический журнал. 2004. № 4 (12). С. 63-65.
2. Лаврова В.С., Чердынцева Н.В., Васильев Н.В. и др. Нейтрофилы и злокачественный рост. Томск, 1992.
3. Соляник Г.И., Кулик Г.И. Противоопухолевая терапия. Вспомогательная информация // Медикаментозное лечение онкологических больных. Киев: Геопринт. 1999. C. 273-339.
4. Хричкова Т.Ю., ГольдбергВ.Е., ЖдановВ.В. и др. Механизмы гематологической токсичности цисплатина и кселоды в условиях комбинированной терапии больных диссеминированным раком желудка // Бюллетень СО РАМН. 2005. №4 (118). С. 64-68.
5. Breidenbach M., Rein D.T., Schondorf T. et al. Hematological side affect profiles of individuslized chemotherapyregimen for recurrent ovarian cancer // Anticancer drugs. 2003. Vol. 14, № 5. P. 341-346.
6. Cersosimo R.J. Hepatotoxity associated with cisplatin chemotherapy // Ann. Pharmacother. 1993. Vol. 27, №4. P. 437-441.
7 Kintzel P.E. Anticancer drug-induced kidney disorders // Drug Saf. 2001. Vol. 24. P. 19-38.
8. Markman M., Webster K., Zanotti K. et al. Phase 2 trial of prolonged administration of topotecan in platinum / taxsanerefractory ovarian, foliopian tube, and primary peritoneal cancer // Gynecol. Oncol. 2004. Vol. 95, № 1. P. 109-113.
Поступила 13.04.07
