CC BY
23
УДК 611.018.63
СТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ ТКАНЕЙ СЕРДЦА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И КОРРЕКЦИЯ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИМИ ПРЕПАРАТАМИ
Л.Г.Прошина, Л.В.Коваленко*, Л.М.Шевцова, Н.П.Федорова, О.С.Быкова, М.В.Григорьева
STRUCTURAL REORGANIZATION OF THE HEART TISSUES IN EXPERIMENTAL PATHOLOGY
AND CORRECTION BY DRUGS
L.G.Proshina, L.V.Kovalenko, L.M.Shevtsova, N.P.Fedorova, O.S.Bykova, M.V.Grigor'eva
Институт медицинского образования НовГУ, [email protected] *Сургутский государственный университет
В представленной работе определяли перекисное окисление липидов (ПОЛ) в плазме крови и тканях миокарда по содержанию первичных и вторичных продуктов с использованием световой микроскопии. Объектом изучения служили: миокард и кровь крыс линии Wistar. В процессе работы были определены компоненты межклеточного матрикса миокарда. Отмечено его увеличение преимущественно за счет коллагена III типа. Исследование продемонстрировало зависимость развития соединительной ткани (в частности коллагеновых волокон) миокарда от активности ММП (матричная металлопротеиназа). В предложенной экспериментальной модели аллоксанового диабета отмечено снижение содержания ММП-1 и повышение уровней TIMP-1 (тканевой ингибитор металлопротеиназ-1 —ТИМП-1) в 1,9 раз. Диабет приводил к снижению отношения ММП-1/ТИМП-1 и сопровождался повышением ПОЛ, которое, очевидно, являлось одним из патогенетических звеньев, запускающих защитно-компенсаторные реакции тканей миокарда. Снижение ПОЛ и деструктивных изменений кардиомиоцитов на фоне
введения мексикора позволяют рассматривать использованныи лекарственный препарат в качестве цитопротектора и антиоксиданта.
Ключевые слова: миокард, I тип коллагена, III тип коллагена, матриксные металлопротеиназы, тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ, экспериментальный диабет, мексикор
We investigated lipid peroxidation in the blood plasma and myocardial tissues by the content of primary and secondary products using light microscopy. The objects of study were the myocardium and blood of Wistar rats. In the course of work we identified extracellular matrix components in the myocardium. Extracellular matrix mostly increases due to increasing the type III collagen content. The study demonstrated the dependence of growth of the myocardial connective tissue (especially collagen fibers) on MMP (matrix metalloproteinase) activity. Experimental alloxan diabetes revealed the decreased content of MMP-1 and increase in TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1) 1.9 times higher. Diabetes led to lowering of MMP-1/TIMP-1 rate and was accompanied by increase in lipid peroxidation, which obviously was one of the pathogenetic mechanisms that trigger protective-compensatory reactions of myocardial tissues. Decrease in the lipid peroxidation and destructive changes of cardiomyocytes on the background of introduction of Mexicor allow us to consider the drug as a cytoprotector and antioxidant.
Keywords: myocardium, collagen type I, collagen type III, matrix metallproteinases, tissue inhibitor of matrix metallproteinases, experimental diabetes mellitus, Mexicor
Развитие патологии сердечнососудистой системы при сахарном диабете (СД) в 3-4 раза выше по сравнению с лицами без СД [1]. Интеграция данных патологий значительно отягощает течение каждой из них. Несмотря на существенные результаты, достигнутые в области фундаментальной медицины, остаются открытыми вопросы, связанные с расшифровкой клеточных и молекулярных механизмов повреждения миокарда, развивающихся на фоне сахарного диабета. Изучение морфофункциональных особенностей кардиомиоцитов в динамике развития патологии является особенно важным как для понимания процессов клеточного ремоделирования миокарда и сердца в целом, так и для оптимизации способов коррекции возникающих деструктивных изменений в тканях сердца. Все это делает особо актуальным изучение объема структурно-функциональной реорганизации сердца при диабете и является основанием для выполнения данного вида исследования.
Цель работы: изучить реорганизацию межклеточного матрикса миокарда и его клеточных структур при экспериментальном диабете и на фоне введения мексикора.
Материалы и методы
Экспериментальное исследование выполнено на 180 крысах-самцах Wistar массой 150-250 г, полученных из питомника «Рапполово» РАМН (Ленинградская обл.) Животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказа МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Морфологическое исследование проведено с использованием светооптического бинокулярного микроскопа Axioscope A1 (Carl Zeiss, Германия).
Для анализа морфологических, иммуногисто-химических и цитохимических особенностей кардио-миоцитов были сформированы три группы животных: 1 — интактные, содержащиеся в обычных условиях вивария; 2 — с экспериментальным аллоксановым
диабетом (ЭД); 3 — животные с ЭД, получавшие лекарственный препарат мексикор (60 мг/кг 1 раз в день, в/м). Экспериментальная модель аллоксанового диабета была сформирована в соответствии с моделью, ранее описанной нами [2], путем подборки дозы аллок-сана (фирма «Lachema», Чехия) 20 мг/100 г до получения клинико-морфологической картины развития диабета: глюкозурии, гипергликемии, полидипсии, полифагии и полиурии. Введение аллоксана проводилось внутрибрюшинно на фоне 24-часового голодания. Состояние углеводного обмена контролировалось путем определения содержания глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом, иммунореактивного инсулина (ИРИ) в плазме крови. Оценивался глюкозоин-сулиновый индекс (ГИИ) как отношение концентрации глюкозы в ммоль/л к концентрации ИРИ в мкЕд/мл.
Контрольная группа животных содержалась на обычном рационе вивария при свободном доступе к воде. Содержание, питание, уход и выведение их из эксперимента проводили в соответствии с требованиями «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977г. № 755), а также в соответствии с Европейской конвенцией о защите животных, используемых в экспериментальных целях (директива 86/609 ЕЕС). Учитывались процент летальности животных, изменение массы тела, объем выпитой воды, содержание глюкозы в крови, концентрация глюкозы и кетоновых тел в моче. Нарушения гомеостаза, связанные с дисбалансом углеводного и белкового обменов определялись по изменениям биохимических показателей крови и мочи, а именно по содержанию в ней кетоновых тел, белка и глюкозы. Функциональная морфология миокарда, сосуды мик-роциркуляторного русла сердца и поджелудочной железы были исследованы на гистологических срезах, приготовленных по стандартной методике с использованием световой микроскопии. Окраска экспериментальных препаратов проводилась железным гематоксилином Вейгерта, гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, альдегид-фуксином. Изучено содержание клеточных элементов тканей сердца и поджелудочной железы, проведен морфометрический анализ.
Для оценки содержания коллагена и выявления их типов выполнялось иммуногистохимическое (ИГХ)
исследование парафиновых срезов миокарда толщиной 5 мкм, применялся иммунопероксидазный метод с использованием аффинно-очищенных кроличьих поли-клональных первичных антител к антигенам коллагена I и коллагена Ш типов (фирма «Sigma», США), вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (фирма «Boehringer Manheim», Германия). Оценка результатов проводилась в 10 произвольно выбранных полях зрения при увеличении х400 отдельно по зонам: интерстициальной (различались эндомизиальный и пе-римизиальный коллаген) и периваскулярной.
Для изучения фибропластистических процессов в межклеточном пространстве, характера и выраженности паренхиматозно-стромальных нарушений, патогенетической роли интерстициального фиброза при ремодели-ровании миокарда определяли уровень матриксных ме-таллопротеиназ ММП-1, ММП-3, ММП-9, и тканевого ингибитора ММП-1 — ТИМП-1 в тканях миокарда и плазме крови. Для исследования в плазме использовали кровь, взятую из хвостовой вены, которую центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 мин. Плазму отбирали в пластиковые пробирки и хранили в замороженном виде при температуре -20°С до проведения анализа. Использовали метод количественного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Принцип метода ИФА основан на количественном определении исследуемого биологического агента в сыворотке крови с помощью его послойного связывания со специфичными
антителами [3]. Определение концентраций ММП-1, ММП-3 и ММП-9 проводили с использованием оригинальных наборов для иммуноферментного анализа фирмы «TBS» (Великобритания). Для оценки состояния ПОЛ в плазме крови и тканях сердца определяли содержание ДК (диеновых конъюгатов) и МДА (малонового диальдегида). Ферменты антиоксидантной системы (АОС) изучали по активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ).
Результаты исследования
В течение первой недели после введения аллок-сана у крыс нарастало потребление воды, усиливался диурез. Уровень глюкозы в крови увеличивался до 23,40±0,18 ммоль/л, что в 5,4 раза выше значений контрольных крыс (4,29±0,44 ммоль/л). Глюкозо-инсулиновый индекс (ГИИ) составлял 8,17±0,61 и был значительно выше контрольных цифр (0,27±0,01). ИРИ на 21-е сутки эксперимента в 6,8 раз превышал значения контрольной группы. Максимальный уровень летальности во всех экспериментальных группах с диабетом был отмечен на 3-5 сутки. В целом летальность на протяжении эксперимента достигала от 31% до 38%. Потеря массы животных после введения аллоксана составляла от 2,3±0,3% (на 10 сутки) до 8,9±0,6% (на 21 сутки). Экспериментальный аллоксановый диабет вызвал резкие сдвиги биохимических показателей крови и мочи. Так, на 3 и 21-е сутки исследования наблюдалась мак-
Контроль
ЭД
кмц
KB
а)
КМЦ
I Мин-макс □ 25%-75% ° Медиана
ЭД+мексикор
в)
кмц
KB б)
I Мин-макс О 25%-75% □ Медиана
I Мин-макс □ 25%-75% □ Медиана
Рис.1. Объемная плотность в % кардиомиоцитов (КМЦ), капилляров (кап), коллагеновых волокон (КВ) и межклеточный матрикс (М) в миокарде крыс линии Wistar: а) в контрольной группе животных; б) в условиях экспериментального диабета; в) в условиях экспериментального диабета на фоне введения мексикора
симальная концентрация глюкозы в плазме крови (33,3 ммоль/л), глюкозы в моче (112 ммоль/л); на 3-7-е и 21-е сутки выявлялись кетоновые тела, содержание которых в моче достигало 16,0 ммоль/л.
Морфологическое исследование поджелудочной железы крыс, которым вводили аллоксан, выявило, что центрально расположенные клетки островка Лангерганса претерпевают деструктивные изменения. Реакция на р-клетки с альдегид-фуксином практически отсутствовала. На препаратах, окрашенных гематоксилином-эозином, обнаруживается гиперхромия ядер и деформация инсулоцитов, снижается плотность капилляров панкреатического островка, изменяется микроциркуляторное русло.
На гистологических препаратах миокарда животных с ЭД манифестировала гетерогенность кардио-миоцитов. Часть клеток были гипертрофированы, другая — претерпевала деструктивные изменения, присущая миоцитам поперечная исчерченность на светоопти-ческом уровне не просматривалась, имели место явления миоцитолизиса. Наблюдалась значительная вакуолизация саркоплазмы, мышечные клетки окрашивались эозином неравномерно. Ядра миоцитов диабетических крыс приобретали неправильную форму, располагались как в центре кардиомиоцитов, так и на периферии. При анализе гистологических препаратов выявлялись участки миокарда с истонченными и извитыми функциональными мышечными волокнами, обнаруживались деструктивные изменения и явления выраженного межмышечного отека. Содержание капилляров в миокарде диабетических крыс уменьшилось в 1,8 раз. Возрастало, по сравнению с контрольной группой животных в 3,1 раза, количество коллагеновых волокон (рис. 1).
Введение мексикора оказало позитивное влияние на состояние тканей миокарда. Кардиомиоциты формировали более структурированные сократительные «волокна», отсутствовала (по сравнению с ЭД) их извитость. Практически не встречались, за редким исключением, деструктивно измененные клетки с явлениями миоцитолизиса. Введение мексикора при ЭД способствовало увеличению абсолютного (в 0,6 раза) содержания кардиомиоцитов. Динамика паренхиматозно-стромальных отношений (КМЦ / М) продемонстрировала снижение паренхиматозно-стромального индекса (ПСИ) в 2 раза при ЭД и увеличение данного показателя в 1,3 раза при ЭД на фоне введения мексикора по сравнению с диабетической группой животных.
Содержание коллагеновых волокон на фоне терапии диабетических крыс мексикором уменьшилось в 1,6 раза. Обращают на себя внимание показатели ИГХ, интенсивность окрашивания коллагена III типа, как в контроле, так и при ЭД была более выраженной, чем у коллагена I типа. Показатели ИГХ у группы животных ЭД + мексикор были сопоставимы с контролем (рис.2).
контроль ЭД ЭД+мекснкор
_ коллаген1 типа коллаген III типа
Рис.2. Соотношение коллагена I и III типов в миокарде контрольных крыс, с ЭД и ЭД на фоне введения мексикора (ЭД+мексикор), выявленных методом иммунодиагностики
Результаты исследования показали, что в сыворотке крови при экспериментальном аллоксановом диабете (ЭД) наблюдались повышение уровней ТИМП-1, снижение уровней ММП-1, ММП-9 и показателя отношения ММП-1/ТИМП-1 (табл.1).
Снижение активности ММП-1, ММП-3 при экспериментальном диабете согласуется с увеличением объемной плотности коллагеновых волокон в данной экспериментальной группе. Содержание коллаге-новых волокон определило увеличение объема межклеточного матрикса. ЭД вызвал увеличение ТИМП-1 на 41,8 нг/мл. Соотношение ММП-1/ТИМП-1 в группе ЭД снизилось в 1,3 раза. Интерпретировать полученные результаты можно следующим образом: увеличение количественных параметров внеклеточного мат-рикса при ЭД обусловлено в основном ростом содер-
Таблица 1
Изменение содержания матриксных металлопротеиназ и их тканевого ингибитора-1 в сыворотке крови при экспериментальном аллоксановом диабете
Условия эксперимента ММП-1 (нг/мл) ММП-3 (нг/мл) ММП-9 (нг/мл) ТИМП-1 (нг/мл)
Контроль n = 50 4,96±0,5 34,41±1,2 454,4±28,3 177,3±12,1
ЭД n = 70 2,75±0,2* 29,65±1,3 376,9±22,6 219,1±14,2*
ЭД на фоне терапии мекси-кором (ЭД+мексикор) n = 60 3,81±0,3 31,21±1,6 392,5±21,4 181,3±17,1
Примечание: * прир < 0,05
Таблица 2
Содержание продуктов ПОЛ и ферментов АОС в тканях сердца у крыс линии Wistar в контроле, при ЭД и диабете на фоне терапии мексикором
Серия эксперимента (n = 180) ДК, мк.моль./г ткани МДА, нмоль/500 мг ткани СОД, ед.актив/ мг белка КАТ, ед. актив / мг белка
Контроль n = 50 0,87±0,05 0,695±0,041 1,71±0,14 0,233±0,015
ЭД n = 70 1,89±0,05* 1,536±0,032* 0,32±0,05* 0,068±0,005*
ЭД на фоне терапии мексикором (ЭД+мексикор) n = 60 1,01±0,03** 0,731±0,028** 1,03±0,05** 0,171±0,014**
Примечание: * p < 0,05, по сравнению с контролем; ** p < 0,05, по сравнению с ЭД.
жания коллагеновых волокон и снижения отношения ММП-1/ТИМП-1. Терапия диабетических крыс мексикором привела к увеличению ММП и уменьшению ТИМП-1, на этом фоне уменьшилось содержание межклеточного матрикса, преимущественно за счет снижения количества коллагеновых волокон. Состояние окислительно-восстанови-тельного гомеостаза в экспериментальных группах, определяемое продуктами ПОЛ и активностью ферментов АОС, было следующим. В контрольной группе животных содержание ДК в тканях миокарда составляло 0,87 ± 0,05 мк.моль/г ткани, МДА — 0,695 ± 0,041 нмоль/500 мг ткани. Активность СОД и КАТ равнялась 1,71 ± 0,14 ед.актив/ мг белка и 0,233 ± 0,015 ед.актив/ мг белка соответственно. В условиях ЭД в 2 раза повышалось содержание продуктов ПОЛ. Активность ферментов АОС при ЭД снижалась: СОД на 87% КАТ на 88% (табл.2).
Анализ содержания ДК, МДА в кардиомиоцитах и плазме крови свидетельствует о смещении окислительно-восстановительного гомеостаза в сторону проок-сидантов, что может быть расценено как развитие ок-сидативного стресса, сопровождающего ЭД. Терапия диабетических крыс мексикором приводила к уменьшению количества токсических продуктов ПОЛ: содержание ДК уменьшилось в 1,8 раза, МДА в 2,1 раза по сравнению с диабетическими животными, что позволило рассматривать использованный препарат в качестве антиоксиданта. Таким образом, при ЭД выявлено увеличение внеклеточного матрикса преимущественно за счет волокнистых компонентов с преобладанием коллагена III типа. Повышение ТИМП-1 при ЭД свидетельствовало о снижении процессов расщепления внеклеточного коллагена, т.е. интенсивность утилизации экстра-целлюлярного коллагена при ЭД недостаточно уравновешивает его повышенный синтез, что ведет к развитию фиброза сердца. Отношение ММП-1/ТИМП-1 можно считать признаком, прогнозирующим состояние мио-кардиального фиброза, а также показателем, способным определять адаптивно-компенсаторные возможности тканей сердца. На модификацию функциональной активности и структурной организации миокарда, очевидно, оказывает определенное влияние окислительный стресс. Морфофункциональные изменения тканей сердца носят адаптивно-компенсаторный характер и вызваны реакцией их на экстремальные воздействия ЭД. Введение лекарственного препарата мексикора при ЭД уменьшало степень повреждения кардиомиоцитов,
снижало выраженность деструктивных изменений на клеточном уровне организации миокарда, а также уменьшало содержание продуктов ПОЛ, что в целом свидетельствует о его позитивном влиянии, обеспечивающем возможность обратного развития деструктивных повреждений, возникших в ходе развития экспериментального аллоксанового диабета.
Заключение
Экспериментальный аллоксановый диабет привел к снижению активности антиоксидантных ферменов (СОД, КАТ) и повышению содержания продуктов ПОЛ в миокарде. Смещение окислительно-восстановительного гомеостаза и накопление продуктов ПОЛ сопровождалось снижением объемной плотности кардиомицитов и увеличением объемной плотности межклеточного матрикса. Прирост объемной плотности межклеточного матрикса, очевидно, связан с повышением объемной плотности коллагеновых волокон, что коррелирует со снижением содержания ММП. Введение экспериментальным животным лекарственного препарата мексико-ра вызвало уменьшение содержания продуктов ПОЛ, коллагеновых волокон межклеточного матрикса, снижение степени выраженности деструктивных изменений кардиомиоцитов.
1. Nichols G.A., Hillier T.A., Erbey J.R., Brown J.B. Congestive heart failure in type 2 diabetes: prevalence, incidence, and risk factors // Diabetes Care. 2001. №24. Р.1614-1619.
2. Прошина Л.Г., Григорьева М.В., Федорова Н.П. и др. Сравнительный анализ структурных проявлений реакции тканей миокарда в условиях экспериментального диабета // Вестник НовГУ. Сер.: Мед. науки. 2012. №66. С.88- 90.
3. Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007. 822 с.
References
1. Nichols G.A., Hillier T.A., Erbey J.R., Brown J.B. Congestive heart failure in type 2 diabetes: prevalence, incidence, and risk factors. Diabetes Care, 2001, vol. 24, pp. 1614-1619.
2. Proshina L.G., Grigor'eva M.V., Fedorova N.P., Bykova O.S. et al. Sravnitel'nyi analiz strukturnykh proiavlenii reaktsii tkanei miokarda v usloviiakh eksperimental'nogo diabeta [Comparative analysis of structural manifestations of the myocardium tissue reactions to experimental diabetes]. Vest-nik NovGU. Ser. Meditsinskie nauki - Vestnik NovSU. Issue: Medical Sciences, 2012, no. 66, pp. 88- 90.
3. Kishkun A.A. Rukovodstvo po laboratornym metodam diag-nostiki [Guidelines for the laboratory diagnostic methods]. Moscow, "GEOTAR-Media" Publ. 2007. 822 p.
