CC BY
34
Том 152, кн. 2
Естественные науки
2010
УДК 577.218+577.29
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНА МЕТАЛЛОЭНДОПЕПТИДАЗЫ BACILLUS INTERMEDIUS
А.Р. Сабирова, М.Р. Шарипова Аннотация
Секвенирован фрагмент геномной ДНК Bacillus intermedius размером в 5896 п.о., содержащий 6 открытых рамок считывания, одна из которых соответствует гену ме-таллопротеиназы (mprBi). Ген mprBi клонирован на плазмиде pSA1, и его нуклеотидная последовательность установлена (AN EU 678894.2). Открытая рамка считывания содержит 810 п.н. Регуляторная и структурная области гена mprBi имеют 98%-ную гомологию с геном секретируемой протеиназы Bacillis pumilus. В структурной области гена mprBi идентифицирован специфический продленный мотив активного сайта, сформированный 12 аминокислотами, и Met-поворот, которые характерны для представителей клана метцинкинов. Экспрессия гена происходит на 30-й час в стационарной фазе роста бацилл. Результаты анализа показали, что соответствующий выделенному гену белок MprBi является первым идентифицированным представителем металлоэндопепти-даз клана метцинкинов у бацилл.
Ключевые слова: металлопротеиназа, Bacillus intermedius, секвенирование, мет-цинкины, экспрессия гена.
Введение
Бактерии рода Bacillus в постэкспоненциальную фазу роста продуцируют в среду различные внеклеточные протеиназы. В базе данных международного ГенБанка (www.ncbi.nlm.nih.gov) содержится информация о генах протеиназ различных организмов, в том числе B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis. Эта информация позволяет провести сравнительный анализ генов соответствующих белков.
Бациллы выделяют в культуральную жидкость комплекс протеиназ, соотношение компонентов которого определяется условиями обитания и развития продуцентов [1]. Направленное образование определенных групп протеиназ обеспечивает координацию метаболической активности и позволяет бактериям целесообразно использовать питательные вещества. Секретируемые протеазы бацилл могут быть разделены на две группы: сериновые и металлопротеиназы. Они отличаются рядом свойств. Ингибиторами сериновых протеиназ являются PMSF и DFP, металлопротеиназ - ЭДТА и о-фенантролин. Бациллярные протеиназы активны в области pH около 8. Белки разных групп отличаются по стабильности, специфичности и кинетическим характеристикам, что обеспечивает более глубокий гидролиз комплекса субстратов. Соотношение различных групп в комплексе секретируемых протеиназ является видовой характеристикой и обуславливается средой обитания микроорганизмов.
В пуле внеклеточных протеиназ Bacillus intermedius доминирующим ферментом является субтилизиноподобная сериновая протеиназа [2]. На ее долю приходится около 90% от внеклеточной протеолитической активности по расщеплению казеина. Доля сериновой глутамилэндопептидазы достигает 10% от общего пула секретируемых протеиназ B. intermedius. Гены обоих ферментов клонированы и секвенированы (AY754946.1, Y15136.1), соответствующие им белки выделены и детально изучены [3-5]. Вместе с тем в библиотеке хромосомной ДНК B. intermedius идентифицирован клон, обладающий внеклеточной протеолитической активностью. В отличие от двух первых белков активность этого фермента подавляется ингибиторами для металлопротеиназ - ЭДТА и о-фенантролином [6].
Целью исследования являлось секвенирование фрагмента ДНК B. intermedius, содержащего ген металлопротеиназы, геноинформационный анализ изолированной нуклеотидной последовательности и субклонирование соответствующего гена.
1. Материалы и методы
1.1. Штаммы бактерий, векторы и среды. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе, приведены в табл. 1. Клетки B. intermedius и B. subtilis выращивали на среде Лурия - Бертони при 37 °С. Для трансформации и получения компетентных клеток использовали среды, описанные ранее [7]. Для отбора клонов, способных секретировать протеиназу, использовали селективную среду, содержащую 30% обезжиренного молока и 2% агара. Антибиотик эритромицин добавляли в среду культивирования в конечной концентрации 10 мкг/мл. Прирост биомассы измеряли нефелометрически на фотоэлек-трокалориметре КФК-2 при 590 нм в кювете толщиной 1 см.
Табл. 1
Бактериальные штаммы и плазмиды
Штамм или плазмида Характеристика Источник информации
B. intermedius 3-19 Штамм дикого типа, 81га Коллекция КГУ
B. subtilis BG 20-36 Протеазодефицитный штамм Е. Феррари (E. Ferrari), Genencor Int. Inc. USA
Pcb22 Экспрессионный вектор, ЕШ9035, Ар*, Еш* А.В. Сорокин
Pcm4 С фрагментом ДНК В. ШвгшвЛш 3-19 в 6 т.п.н. на плазмиде рСВ22 С.В. Костров, ИМГ РАН
Psa1 С геном шргВ1 в 1.1 кб с плазмиды рСМ4 А.Р. Сабирова, в настоящей работе
1.2. ДНК секвенирование. Фрагмент геномной ДНК размером в 5896 п.о. на плазмиде pCM4 амплифицировали с помощью синтетических олигонуклеотидов (pCB rev - ATAGCTTTATAGAGTAGGTC, pCB dir - CCACTATCGACTACGCG). Условия проведения ПЦР-реакции: 1 цикл (94 °С - 1 мин ); 30 циклов (94 °С -30 с; 43 °С - 30 с; 72 °С - 6 мин); 1 цикл (72 °С - 10 мин ). Результаты ПЦР-реакции оценивали электрофоретически в 1%-ном агарозном геле. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента клонированной ДНК B. intermedius
проводили методом терминации цепи, используя в качестве матрицы амплифи-кат вставки с плазмиды pCM4 (http://www.genome-centre.narod.ru/).
Анализ секвенированного фрагмента проводили при помощи NCBI BLAST сервера и он-лайн программы поиска открытых рамок считывания (ORF Finder) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) [8]. Промоторную область гена анализировали с помощью программы BPROM (http://linux1.softberry.com/berry.phtml). Сигнальный пептид в конвертированных аминокислотных последовательностях идентифицировали, используя сервер SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP).
1.3. Картирование ДНК и субклонирование гена. ПЦР-продукт фрагмента геномной ДНК B. intermedius анализировали на содержание сайтов рестрикции. Фрагмент ДНК размером 6 кб обрабатывали ферментами рестрикции в разных комбинациях: BgllI, Dral, HindII, NdeI, PvulI, SacI, Sali, XbaI. Последовательность гена mprBi амплифицировали, используя олигонуклеотиды:
• mprBiDir (TAACCTGGATCCAATCAAAGGAGGGATAGG), соответствующий началу регуляторной области гена протеазы с сайтом для распознавания рестриктазой BamHI (подчеркнуто),
• mprBiRev (CATAAAGGATCCCAAGCACATAGGTGTTTG), соответствующий концу кодирующей области гена протеазы с сайтом для распознавания рестриктазой BamHI (подчеркнуто).
Обработанный рестриктазой продукт амплификации очищали, используя набор GeneJET PCR Purification Kit (Fermentas), и клонировали в плазмиду pCB22, предварительно обработанную BglII рестриктазой. Корректное встраивание гена mprBi подтверждали амплификацией этого гена при помощи фланкирующих праймеров mprBiDir - mprBiRev. Достоверность фрагмента ДНК после субклонирования определяли повторным секвенированием. Полученная рекомбинантная плазмида получила название pSA1. Для изучения экспрессии гена металлопротеиназы плазмидой pSA1 трансформировали протеазодефи-цитный штамм B. subtilis BG 20-36.
1.4. Определение протеолитической активности и ингибиторный анализ. Протеолитическую активность определяли в культуральной жидкости ре-кобминантного штамма B. subtilis BG 20-36 (pSA1) по расщеплению азоказеина [9]. Измерение поглощения проводили на спектрофотометре (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкг субстрата за 1 мин.
Для выяснения действия ингибиторов на активность металлопротеиназы пробу выдерживали в присутствии реагента в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего определяли остаточную активность по гидролизу азоказеина. Ингибиторы добавляли к супернатанту в конечной концентрации 5 мМ. Остаточную активность выражали в процентах. За 100% принимали активность фермента в отсутствие ингибиторов в реакционной смеси. В работе использовали специфический ингибитор сериновых протеиназ PMSF, ингибиторы металло-протеиназ ЭДТА и 1,10-фенантролин, а также белковый ингибитор трипсина.
1.5. Статистическая обработка данных. Для описания признаков фермента использовали построения 95%-ных доверительных интервалов для средних.
2. Результаты и их обсуждение
В культуральной жидкости рекомбинантного штамма, несущего плазмиду с фрагментом ДНК B. intermedius размером 6 кб, обнаружена протеолитическая активность по гидролизу азоказеина. Уровень активности фермента понижался на 70-80% в присутствии ингибиторов металлопротеиназ (ЭДТА и о-фенантро-лин) в конечной концентрации 5 мМ. Напротив, 30-минутная инкубация со специфическими ингибиторами сериновых протеиназ (PMSF и ингибитор трипсина) практически не влияла на активность фермента в культуральной жидкости изолированного клона (табл. 2). Отсутствие протеолитической активности на синтетических олигопептидных субстратах Z-Glu-Na (для глутамилэндопеп-тидазы) и Z-Ala-Ala-Leu-pNA (для субтилизина), а также данные по влиянию специфических ингибиторов на протеолитическую активность штамма B. subtilis pCM4 позволили заключить, что фрагмент хромосомной ДНК B. intermedius содержит ген, кодирующий металлопротеиназу. Плазмида, содержащая фрагмент размером 6 кб хромосомной ДНК с геном металлопротеиназы получила название pCM4.
Табл. 2
Активность внеклеточного фермента в присутствии специфических ингибиторов*
Ингибиторы, 5 мМ Остаточная активность, %
PMSF 87 ± 3
ЭДТА 20 ± 3
о-фенантролин 17 ± 3
Ингибитор трипсина 92 ± 3
*За 100% принимали протеолитическую активность в отсутствие ингибитора.
Провели определение нуклеотидной последовательности изолированного фрагмента геномной ДНК размером в 5896 п.н. Поиск открытых рамок считывания (ОРС) секвенированного фрагмента ДНК показал наличие 6 ОРС (рис. 1).
Рис. 1. Схематическое расположение открытых рамок считывания, идентифицированных в 6 кб фрагменте секвенированной геномной ДНК B. interшedius
Первая ОРС на клонированном фрагменте ДНК (433 а.к.о.) кодирует полипептид YwfO, который относится к суперсемейству фосфогидролаз. Соответствующий гену белок является металзависимой фосфогидролазой и содержит два сайта связывания с ионами Мg+, 2и-связывающий сайт и консервативный мотив НБ в активном центре. Вторая ОРС (165 а.к.о.) соответствует гену ум/Л и вместе с пятой рамкой считывания (172 а.к.о.) генаум>кО кодирует гипотетические белки, которые не имеют гомологии к известным генам. Во фрагменте геномной ДНК также идентифицирована ОРС pшbBi гена, кодирующая мембраносвязанную
металлопротеиназу из 220 а.к.о. Аминокислотная последовательность этого гена имеет 96%-ную гомологию с аминокислотной последовательностью гена ywhC B. pumilus SAFR-032, кодирующего мембраносвязанную металлопротеиназу семейства М50. Белки этого семейства локализованы в мембране и предназначены для осуществления транспорта через мембрану посредством сопряженной экспрессии продуктов генов, локализованных в других клеточных компартмен-тах. Эти белки являются гомологами S2P семейства белков [10]. Это эукарио-тические белки, принимающие участие в регуляции метаболизма жиров и сте-ролов, так же как и в регуляции ответа на солевой стресс в эндоплазматическом ретикулуме. Прокариотические гомологи S2P белков, по-видимому, выполняют ключевую роль в регуляции стрессовых ответов, клеточном делении и диф-ференцировке [11]. Поиск сигнального пептида в аминокислотной последовательности pmbBi гена показал отсутствие потенциального сайта отщепления сигнального пептида. По-видимому, данный белок является интегральным мембранным белком и не секретируется в культуральную жидкость или на внешнюю поверхность мембраны. Следующая рамка считывания гена ywhE кодирует пенициллинсвязывающий белок, который состоит из трансгликози-лазного и транспептидазного доменов на N- и C-концах соответственно. Это бифункциональный белок, трансгликозилазный домен которого катализирует полимеризацию муреин-гликановых цепей. Присутствие серина в активном центре является типичным для представителей данного семейства.
Третья по расположению ОРС (рис. 1) соответствовала гену металлопро-теиназы mprBi и имела 99% гомологии с аминокислотной последовательностью гена протеиназы B. pumilus SAFR-032. Этот белок, как и его аналоги, не был изолирован и охарактеризован у бацилл ранее. Установлено, что он имеет высокую степень гомологии к конвертированным аминокислотным последовательностям секретируемых металлопротеиназ клана М12. Поиск сигнального пептида в программе SignalP показал наличие потенциального сайта (ASA) отщепления сигнального пептида. Наличие сигнального пептида в структуре генного продукта свидетельствует о внеклеточной локализации зрелого белка B. intermedius, секре-тируемого бактериями в среду культивирования к месту его функционирования. Сравнительный анализ ОРС гена mprBi с ОРС гена pmbBi показал отсутствие какой-либо гомологии структурной части генов. В результате анализа конвертированных аминокислотных последовательностей генов mprBi и pmbBi было выявлено наличие разных структурных доменов, характеризующих эти протеиназы как белки, представляющие различные суперсемейства (рис. 2). Более того, активные центры MprBi (рис. 2, а) и PmbBi (рис. 2, б) располагаются на С- и N-концах соответственно. Различие в структурной организации генов, принадлежность к различным суперсемействам металлопротеиназ свидетельствуют о том, что продукты этих генов представляют собой ферменты различной локализации и, по-видимому, выполняют различные физиологические функции в клетках бацилл.
Нуклеотидная последовательность фрагмента геномной ДНК Bacillus intermedius размером 6 кб, установленная в результате проведенного исследования, депонирована нами в международную базу данных GenBank под номером EU678894.
а) Sí щ 1| ж щ PH
active, ¿it i
Superfanilies [ Мс superfami ] у )
Рис. 2. Структурные домены, идентифицированные в программе BLAST NCBI в открытых рамках считывания генов секретируемой металлопротеиназы mprBi (а) и мем-браносвязанной металлопротеиназы pmbBi (б) Bacillus intermedins
Ген металлопротеиназы, в том числе его регуляторную область, амплифи-цировали и субклонировали в вектор экспрессии pCB22, в результате чего получили рекомбинантную плазмиду pSA1. Нуклеотидная последовательность гена металлопротеиназы mprBi и соответствующая ей аминокислотная последовательность представлены на рис. 3.
Поиск гомологии гена mprBi к генам известных протеиназ в базе данных NCBI показал 99%-ную гомологию с геном, кодирующим гипотетический белок BPUM 3392 Bacillus pumilus SAFR-032 (YP_001488604.1). Обнаружена также 98%-ная гомология с геном репролизина семейства цинкзависимых металло-протеиназ Bacillus pumilus ATCC 7061 (ZP_03055196.1) и 69%-ная гомология с геном гипотетического белка BL03917 Bacillus licheniformis ATCC 14580 (YP_081058.1). Выравнивание последовательностей этих генов показало, что цинксвязывающие сайты в активном центре данных протеиназ идентичны. Отметим, что нами не обнаружено гомологии секвенированной металлопротеиназы MprBi к наиболее распространенному бактериальному ферменту - термолизину B. thermoproteolyticus (X76986.1). Анализ структуры активного центра, размер открытой рамки считывания у различных представителей металлопротеиназ показали низкую степень схожести металлопротеиназ B. intermedius с термоли-зинподобной протеиназой B. thermoproteolyticus (табл. 3).
Секвенирование гена металлопротеиназы B. intermedius показало, что ОРС гена состоит из 810 п.о., что соответствует 270 а.к.о. (рис. 3). Предположительный сайт Шайна - Дальгарно (SD) располагается в 7 нуклеотидах слева от предполагаемой точки инициации трансляции (ATG). Регуляторные области, -10 (GAATATA) и -35 (TAGAAG) боксы, расположены на расстоянии 61 и 31 п.н. от стартового кодона соответственно. При помощи программы SignalP в структуре ОРС идентифицирован потенциальный сайт отщепления (ASA) сигнального пептида размером в 29 а.к.о.
В структурной области гена mprBi идентифицирован консервативный мотив активного центра из 5 аминокислот HEXXH, включающий два гистидина в качестве цинковых лигандов, присутствие которого указывает на принадлежность продукта секвенированного нами гена к цинкзависимым металлоэндопептидазам
3 01 TTTTTGTTTTTGTAAGACCCAGACCAAAAGCGCTATTTTCCGATGAAATG 3 51 TGTGCTGAAATATCCGAAAAATTAGTGAATATGACGTATTTCGACTTTTT
-35
401 TTTTGTGTATCCAATTCCCTGTTTTTGACTGAATAGAAGGAAAATGGTGA
-10
+1
RBS
M
451 ATTTTCAGTGAATATATAACCTTGTGAAAATCAAAGGAGGGATAGGAATG K K R S V F L S F L L V G S L L P 502 AAAAAGCGTTCAGTCTTTTTGTCATTTTTATTGGTAGGTAGTTTGTTACCG
G V S S A S A P V
.А.
S А G Н G Н Б
553 GGAGTAAGTTCAGCTTCAGCACCAGTCGCGAGTGCTGGTCATGGGCATGAT
Н G Н А Р F Е Т Н I S Е G L Р К А 604 CATGGTCATGCGCCGTTCGAAACACATATTAGTGAGGGGTTGCCAAAGGCA
N Б F К Б L Т К А Р Р I Е R Б V К 65 5 AACGATTTTAAAGATTTGACGAAAGCACCTCCAATTGAACGAGATGTGAAA
Т К V L Б Е S G К О V G S R Т F К 7 0 6 ACAAAGGTATTAGATGAGTCTGGTAAGCAAGTAGGCTCTAGAACCTTTAAG
А N Т G Б S I S Т К А S Т G S О К 7 57 GCGAATACAGGAGATTCTATTTCAACAAAGGCAAGCACAGGCAGTCAAAAA
V Т V У А V А Б А О У R А К У S Б 80 8 GTAACGGTTTATGCTGTAGCAGATGCGCAGTATCGTGCGAAATATAGTGAC
W О Т R I V S I I Е О А Б V Т F N 85 9 TGGCAGACGCGGATTGTCAGCATCATTGAGCAAGCGGACGTGACCTTTAAC
R Б Н Б V Б F V V О А V G S W Т S 910 CGTGATCATGATGTGGACTTTGTCGTACAAGCCGTAGGATCTTGGACGTCT
S G S N А Е О I L S N L S R S F Б 961 TCAGGATCAAATGCAGAGCAAATTTTATCTAACCTTTCGCGCAGCTTTGAT
G R G У Б F V Т G F Т А N Р N F Б 1012 GGCAGAGGATACGATTTTGTCACTGGATTTACAGCAAATCCAAACTTTGAT
А G G I А У V У N S А Р S G S А F 10 63 GCGGGCGGAATCGCTTATGTATACAATAGTGCACCGAGCGGAAGTGCATTC
А V N L Б О G Т А N Т А К А А Т H 1114 GCCGTTAACCTTGATCAAGGAACAGCGAACACCGCAAAAGCGGCTACGCAT
E Y G H N F G L P H Р Р О G S G I 1165 GAATACGGTCATAACTTTGGCTTACCGCATGACCCTCAAGGCAGCGGCATT
V С L М N Y Б У S У Т V Б F F Б А 1216 GTCTGCTTAATGAACTATGATTATTCCTACACAGTCGATTTCTTTGATGCG А Н К N О V N R N К А W У R *
12 67 GCTCATAAAAATCAAGTGAACCGTAACAAAGCGTGGTACAGATAAAATAAG 1318 AGACAAAAGGACAAACACCTATGTGCTTGTCCTTTTTTATGCTTACAGGTC
13 69 GCTGATGCGTTTTCCTGCTACGGCATAGTGTTCTTTTTTCATTTCTTCAAT
Рис. 3. Нуклеотидная последовательность гена mprBi. Предположительные области -10, -35 и КБ8 обозначены серым цветом. Уникальный мотив активного центра НБххНххвххН/О и метиониновый изгиб подчеркнуты и выделены жирным. Звездочкой отмечен стоп-кодон. Предположительные терминаторы транскрипции подчеркнуты. Стрелкой указан предполагаемый сайт отщепления сигнального пептида
клана М12. Структура активного центра белка из 5 аминокислот является метал-лосвязывающим сайтом. В зависимости от расположения третьего цинкового лиганда металлоэндопептидазы подразделяют на глуцинкины (НБХХН+Б), аспцинкины (НБХХН+Б) и метцинкины (НБХХНХХОХХН/Б, Мй-поворот СЬМ№У) [12]. Последние характеризуются более протяженной консервативной структурой активного центра и следующей за ней консервативной структурой Мй-поворота (название дано по присутствию в этом фрагменте остатка метио-нина).
Табл. 3
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов металлопротеиназ
№ Представители Гомология Гомология ре- Гомология Размер
металлопротеиназ активного центра, % гуляторной области гена, % структурной области гена, % ОРС, п.н.
mprBi - внекле-
1 точная металло-протеиназа B. intermedins 100 100 100 810
Zn-зависимая ме-
2 таллопротеиназа B. pumilus ATCC 7061 100 98 98 827
3 Астацин A. astacus (crayfish) 42 - 42 756
4 прг-термолизин B. thermoproteo-lyticus 25 0 45 1647
В последовательности аминокислот, конвертируемой из последовательности нуклеотидов (рис. 3) секвенированного нами гена тргЫ, идентифицировали последовательности, гомологичные продленному мотиву активного центра и структуре метионинового поворота.
Таким образом, результаты анализа структуры гена тргЫ позволяют отнести металлопептидазу к классу метцинкинов. Эти белки, как правило, являются секретируемыми ферментами, которые обнаружены как у животных, так и у микроорганизмов [13]. Тем не менее, до настоящего времени не описан ни один фермент семейства метцинкинов у бацилл. Итак, изолированный в работе клон продуцирует металлоэндопептидазу МгрБ1, которая является первым представителем семейства метцинкиновых белков у бацилл.
Изучали экспрессию гена тргЫ, клонированного на плазмиде р8Л1, в ре-комбинантном штамме В. тЫШъ по сравнению с соответствующим геном ре-комбинантного штамма В. тЫШъ, несущего плазмиду рСМ4. Уровень протео-литической активности в культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. тЫШз (р8Л1) с субклонированным геном металлопротеиназы и В. тЫШз (рСМ4) с геномной вставкой размером в 5896 п.о. существенно не отличался. В обоих случаях уровни протеолитической активности в присутствии и в отсутствие ингибитора сериновых протеиназ РМ8Б были одинаковыми. Полученные результаты позволили заключить, что при субклонировании гена в плазмиду р8Л1 сохранились все необходимые структурные и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии гена.
Исследование динамики роста и накопления протеолитической активности (рис. 4) металлопротеазы рекомбинантного штамма В. subtilis (р8Л1) показало, что активность фермента обнаруживается в культуральной жидкости на 20-й час роста, ее уровень достигает максимума на 30-34-й час роста, что соответствует стационарной фазе роста культуры.
OD, 560 Активность, уд. ед
Время, ч
Рис. 4. Динамика роста и накопления протеолитической активности. 1 - рост рекомби-нантного штамма B. subtilis BG 2036 (pCM4); 2 - рост рекомбинантного штамма
B. subtilis BG 2036 (pSA1); 3 - протеолитическая активность штамма B. subtilis BG 2036 (pSA1); 4 - протеолитическая активность штамма B. subtilis BG 2036 (pCM4)
Таким образом, фрагмент геномной ДНК B. intermedius был секвенирован, выявлено 6 открытых рамок считывания, кодирующих различные полипептиды. Анализ регуляторной области гена металлопротеиназы позволил выявить сайт Шайна-Дальгарно, -10 и -35 области, необходимые для инициации трансляции и транскрипции соответственно. Анализ структурной области гена после конвертирования в аминокислотную последовательность показал наличие сигнального пептида на 5'-конце, что характеризует данный фермент как секрети-руемый. Идентификация в структурной области гена mprBi продленного мотива активного центра HExxHxxGxxH/D и метионинового изгиба позволила отнести фермент к семейству метцинкинов. Фрагмент ДНК с геном mprBi был суб-клонирован под собственным промотором с получением плазмиды pSA1, при этом уровень экспрессии гена не снижался по сравнению с экспрессией в ре-комбинантном штамме B. subtilis BG 2036 (pCM4). Экспрессия гена происходит в стационарной фазе роста культуры. Пока не ясно, какой вклад вносит выявленный нами метцинкин в белковый круговорот у бацилл. В связи с чем представляет приоритетный научный интерес изучение регуляции экспрессии этого гена, что позволит приблизиться к пониманию его физиологической роли в жизнедеятельности этих бактерий.
Авторы выражают глубокую признательность и благодарность профессору
C. В. Кострову (ИМГ РАН, Москва) за предоставленную для работы плазмиду pCM4, старшему научному сотруднику И.В. Демидюку (ИМГ РАН, Москва) за помощь в подготовке образцов для секвенирования ДНК.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 09-04-99044 р-офи), федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013 гг. № П344, гранта АН РТ № 14-24/2010 (Г) и аналитической ведомственной целевой федеральной программы РНП 2.11.1005.
Summary
A.R. Sabirova, M.R. Sharipova. Structure Organisation of Metalloendopeptidase Gene
of Bacillus intermedins.
The 6 kb genome DNA fragment of Bacillus intermedins has been cloned. It contains 6 open reading frames, one of which corresponds to metalloprotease gene (mprBi). The mprBi gene has been cloned on pSA1 plasmid and its nucleotide sequence has been determined (EU 678894.2). The open reading frame consists of 810 bp. Regulatory and structure regions of mprBi gene have 98% homology with secreted protease gene of Bacillis pumilus. The specific prolonged motif of active site and Met-turn were identified in the structure of mprBi gene. The motif of active site consists of 12 aminoacid residues common for metzincin clan representatives. The expression of metalloprotease gene was shown to appear at 30th hour of bacilla growth. The data received strongly suggests that MprBi protein corresponding to isolated gene is the first identified member of metalloendopeptidases of metzincin clan within bacilli.
Key words: metalloproteinase, Bacillus intermedius, DNA sequence, metzincin, gene expression.
Сокращения
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат PMSF - phenylmethanesulfonyl fluoride DFP - diisopropylfluorophosphate
Литература
1. Каюмов А.Р., Шарипова М.Р. Механизмы регуляции синтеза бактериальных суб-тилаз // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2005. - Т. 147, кн. 2. - С. 8999.
2. Шарипова М.Р. Поздние стадии секреции белков у бацилл: Обзор // Биохимия. -2002. - Т. 67, Вып. 11. - С. 1461-1473.
3. Михайлова Е.О., Марданова А.М., Бабалан Н.П., Руденская Г.Н., Шарипова М.Р. Выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом B. subtilis AJ73 на разных фазах роста бацилл // Биохимия. - 2007. - Т. 72, Вып. 2. - С. 228-235.
4. Шамсутдинов Т.Р., Балабан Н.П., Марданова А.М., Данилова Ю.В., Руденская Г.Н., Шарипова М. Р. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом B. subtilis на разных фазах роста // Биоорган. химия. - 2008. - Т. 34, № 3. - С. 1-5.
5. Соколова Е.А., Шамсутдинов Т.Р., Балабан Н.П. Оптимизация выделения внеклеточных протеиназ Bacillus intermedius 3-19, секретируемых бактериями в поздней стационарной фазе роста // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2007. -Т. 149, кн. 2. - С. 114-125.
6. Балабан Н.П. Металлопротеиназы бацилл. Классификация, структурные особенности и термостабильность белков // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. -2007. - Т. 149, кн. 2. - С. 6-24.
7. Anagnostopoulos C., Spizizen J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis // J. Bacteriol. - 1961. - V. 81, No 5. - P. 741-746.
8. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. - 1997. - V. 25, No 17. - P. 3389-3402.
9. Demidyuk I.V., Kalashnikov A.E., Gromova T.Y., Gasanov E.V., Safina D.R., Zabolot-skaya M.V., Rudenskaya G.N., Kostrov S.V. Cloning, sequencing, expression, and characterization of protealysin, a novel neutral proteinase from Serratia proteamaculans representing a new group of thermolysin-like proteases with short N-terminal region of precursor // Protein Expr. Purif. - 2006. - V. 47, No 2. - P. 551-561.
10. Feng L., Yan H., Wu Z., Yan N., Wang Z., Jeffrey P.D., Shi Y. Structure of a site-2 protease family intramembrane metalloprotease // Science. - 2007. - V. 318, No 5856. -P. 1608-1612.
11. Makinoshima H., Glickman M.S. Site-2 proteases in prokaryotes: regulated intramembrane proteolysis expands to microbial pathogenesis // Microbes Infect. - 2006. - V. 8, No 7. - P. 1882-1888.
12. Jiang W., Bond J.S. Families of metalloendopeptidases and their relationships // FEBS Lett. - 1992. - V. 312, No 2-3. - P. 110-114.
13. Sterchi E.E., Stocker W., Bond J.S. Meprins, membrane-bound and secreted astacin met-alloproteinases // Mol. Aspects Med. - 2008. - V. 29, No 5. - P. 309-328.
Поступила в редакцию 08.04.10
Сабирова Альбина Рушановна - аспирант кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета. E-mail: [email protected]
Шарипова Маргарита Рашидовна - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета. E-mail: [email protected]
