Стратегии редактирования паралогичных генов с помощью CRiSPR/Cas9 Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

СТРАТЕГИИ редактирования ПАРАЛОГИЧНых ГЕНОВ С помощью CRISPR/Cas9

А.А. Немудрый 123, Т.Б. Маланханова 1 23'4, А.А. Малахова 1 23, С.П. Медведев123, С.М. Закиян12 3

1 ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН», Новосибирск, Россия

2 ФГБНУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН», Новосибирск, Россия

3 ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения РФ, Новосибирск, Россия

4 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия

Strategies to edit paralogous genes with CRISPR/Cas9

A.A. Nemudryi1223, T.B. Malankhanova 1234, A.A. Malakhova 1223, S.P. Medvedev123, S.M. Zakian 123

1 Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia

2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia

3 State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Novosibirsk, Russia

4 National Research University Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia

Данная работа посвящена разработке стратегий применения системы CRiSPR/Cas9 для увеличения специфичности и точности этого метода на модельной системе, состоящей из целевого гена и гена-паралога, для которого существует риск внесения нецелевых двунитевых разрывов. Нами были использованы эмбриональные фибробласты крыс линии ВгаШеЬого, геном которых содержит гомозиготную мутацию в гене гормона аргинин-вазопрессина (целевой ген). При внесении модификаций в ген аргинин-ва-зопрессина потенциальной мишенью нецелевого действия CRiSPR/Cas9 в рамках предложенной нами модельной системы является ген гормона окситоцина — паралог целевого гена с практически идентичной последовательностью ДНК. Для предотвращения нецелевого эффекта в гене гормона окситоцина был разработан ряд стратегий использования CRiSPR/Cas9, которые затем были применены на эмбриональных фибробластах крыс линии ВгаШеЬого. Показано, что при использовании всех разработанных стратегий с помощью системы CRiSPR/Cas9 удалось внести двуните-вые разрывы в ген аргинин-вазопрессина без нецелевых эффектов в гене окситоцина. С помощью рестрикционного анализа показано, что при использовании одноцепочечных олигонуклеотидов в качестве донорных молекул для гомологичной рекомбинации происходит внесение модификаций в целевой участок гена гормона аргинин-вазопрессина крыс линии ВгаШеЬого.

Наконец, если рассматривать крыс данной линии в качестве модели наследственных заболеваний моногенной природы, то разработанные в работе стратегии могут быть использованы при исправлении мутаций, вызывающих болезни человека, и как следствие, при терапии наследственных заболеваний человека с помощью современных методов редактирования геномов.

Ключевые слова: геномная инженерия, CRiSPR/Cas9, исправление мутаций, крысы ВгаШеЬого.

The purpose of this study is to develop the strategies of CRiSPR/Cas9 application to improve fidelity and specificity of this platform. Here we use a model system, which includes target gene and a paralogue — potential aim for off-target double-strand break induction. The study was carried on using Brattleboro rats embryonic fibroblasts which are homozygous for a mutation in arginine-vasopressin gene (target). The potential off-target gene is oxytocin gene: its DNA sequence is almost identical to that of arginine-vasopressin gene. To prevent off-target effect we designed several strategies, which were further used on Brattleboro rats embryonic fibroblasts. Here we show, that these strategies allowed us to generate double-strand breaks in arginine-vasopressin gene without any off-target effects in oxytocin gene. The endonuclease restriction assay shows that we have modified arginine-vasopressin gene while using both CRiSPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides as a donor for homologous recombination.

At last, if we consider Brattleboro rats as a model of monogenic disease the strategies designed could be translated in human therapeutic genome editing studies.

Keywords: genome engineering, CRiSPR/Cas9, mutation correction, Brattleboro rats.

Введение

Система CRiSPR/Cas9 — перспективный инструмент современной геномной инженерии, одним из направлений применения которого является исправление мутаций, вызывающих наследственные заболевания, как in vitro, так и in vivo [1—4]. В данной работе нами был использован вариант этой системы, который состоит из двух элементов, кодируемых одним плазмидным вектором: sgRNA и Cas9 [3]. Молекула sgRNA представляет собой РНК, содержащую последовательность спейсера, которая по принципу комплементарности связывается с про-тоспейсером (целевым сайтом в геноме). Комплекс

e-mail: zakian@bionet.nsc.ru

sgRNA и эндонуклеазы Cas9 связывается с целевым протоспейсером в геноме и направленно вносит дву-нитевой разрыв. Обязательным условием является присутствие с З'-конца протоспейсера мотива, прилежащего к протоспейсеру (protospacer adjacent motif, PAM).

Одной из проблем метода CRiSPR/Cas9 является относительно высокая вероятность нецелевых эффектов, которые необходимо минимизировать при использовании CRiSPR/Cas9 для терапии наследственных заболеваний человека [5]. Вдобавок, в некоторых случаях может потребоваться специфично внести модификации в одну копию гена, не

затронув других, например, при гетерозигонтой мутации [6]. Также существует проблема при внесении модификаций в гены, для которых в геноме присутствуют последовательности с высоким уровнем гомологии, например, в семействах генов. С такой проблемой столкнулся коллектив исследователей из Китая в работе по внесению модификаций в ген HBB человека, кодирующий субъединицу гемоглобина — р-глобин (мутации в этом гене приводят к развитию р-талассемии). Ген HBB входит в кластер Р-глобиновых генов и имеет высокую гомологию с геном HBD, который также входит в этот кластер. Благодаря тщательному выбору сайтов для действия CRiSPR/Cas9 в этой работе удалось избежать внесения нецелевых двунитевых разрывов в ген HBD и специфично модифицировать ген HBB [7]. В другой работе подобная проблема возникла при модификации гена CRR5 человека, нокаут которого предотвращает заражение клеток человека ВИЧ (CCR5 — коре-цептор ВИЧ). При этом существует риск нецелевого внесения двунитевых разрывов в близкий гомолог CCR5 — ген CCR2. В данном случае нецелевого эффекта удалось избежать благодаря выбору прото-спейсера CRiSPR/Cas9 на участке негомологичном между двумя генами [8].

Еще одна область применения системы CRiSPR/ Cas9, для которой характерны значительно повышенные требования к специфичности и точности вносимых модификаций — редактирование геномов соматических клеток in vivo для терапии заболеваний человека, имеющих генетическую основу, или для изучения функций и взаимодействий генов in vivo. В отличие от описанных выше работ в этом направлении нет возможности провести анализ и отбор клеток, в которых не было внесено нецелевых двунитевых разрывов, что обуславливает потребность в усовершенствовании методов внесения модификаций [4].

Эти примеры демонстрируют, что несмотря на значительные успехи в области редактирования геномов, одной из основных потребностей данного направления является усовершенствование методических подходов и разработка стратегий использования этих подходов для увеличения точности и специфичности действия CRiSPR/Cas9. В данной работе была использована лабораторная линия крыс Brattleboro для моделирования ситуации, когда необходимо направленно внести модификации:

1) в одну копию гена, не затронув другую копию ;

2) в целевой ген, не затронув близкие гомологи или паралоги.

Геном крыс данной линии во втором экзоне гена гормона аргинин-вазопрессина содержит гомозиготную мутацию di/di (diabetes insipidus), которая приводит к развитию наследственного несахарного диабета [9]. В данном случае применение системы CRiSPR/Cas9 может быть затруднено высоким уровнем гомологии между генами аргинин-вазо-прессина и гормона окситоцина. Гены гормонов окситоцина и аргинин-вазопрессина образовались в результате дупликации исходного гена, при этом последовательности этих пептидных гормонов отличаются всего на два аминокислотных остатка [10]. Оба гена состоят из трех экзонов, причем последовательность ДНК, кодирующая сам гормон, находится в первом экзоне. Второй экзон этих генов кодирует центральную часть белка-переносчика нейрофизина ii, которая у двух генов практически

полностью совпадает. Целью данной работы являет-сясоздание системы для исправления мутации в гене аргинин-вазопрессина крыс линии Brattleboro, которая бы не затрагивала ген гормона окситоцина.

Материал и методы

Конструирование векторов для экспрессии системы CRISPR/Cas9

Плазмидные векторы pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene plasmid #42230) и pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) (Addgene Plasmid #42335) были приобретены в депозитарии Addgene. Последовательности спейсеров были клонированы в соответствующие векторы как описано ранее [3].

CR-7_F 5'-CACCGCAGAAGCCTTGCGGAAGCG-3' CR-7_R 5'-AAACCGCTTCCGCAAGGCTTCTGC-3' CR-8_F 5'-CACCGCAGCGGCCTCGCTTCCGCA-3' CR-8_R 5'-AAACTGCGGAAGCGAGGCCGCTGC-3' CR-N_F 5'-CACCGCGATGGTGCGCACAAAGCC CR-N_R 5'-AAACGGCTTTGTGCGCACCATCGC-3' Пары олигонуклеотидов фосфорилировали с использованием T4 Polynucleotide Kinase (New England Biolabs, M0201S). Затем проводили отжиг пары олигонуклеотидов при понижении температуры с 95°С до 25°С со скоростью 0,3°С/с, после чего двухцепочечные олигонуклеотиды клонировали в соответствующий плазмидный вектор, гидролизован-ный с помощью эндонуклеазы рестрикции Bbsl (New England Biolabs, R0539S). В результате было получено пять плазмидных векторов: pX330_CR-7, pX330_ CR-8, pX330_CR-N, pX335_CR-7 и pX335_CR-8.

Получение эмбриональных фибробластов крыс

Эмбриональные фибробласты получали из кожи 19-дневных эмбрионов крыс. Кожу механически измельчали и помещали в 0,25% трипсин (Thermo Fisher Scientific, США) на 10 мин. при 37°С. Клетки осаждали при 1000 об./мин, супернатант убирали. После промывки в фосфатном буфере (PBS) опять осаждали, затем полученный осадок ресуспендиро-вали в культуральной среде и помещали в культу-ральную посуду.

Культивирование эмбриональных фибробластов крыс

Клетки культивировали при 37°С, 5% С02 в среде DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, 1 мМ L-глутамина, 50 ед./мл пенициллина, 50 ед./мл стрептомицина (Life Technologies, США). Клетки пересевали, используя TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific, США).

Электропорация

Электропорацию эмбриональных фибробластов крысы (106 клеток на образец) проводили с помощью набора Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit (Lonza, VPL-1004) по протоколу производителя, используя программу Q-025. Для анализа активности CRiSPR/Cas9 использовали следующие комбинации плазмидных векторов:

1) 5 мкг pX330_CR-7;

2) 5 мкг pX330_CR-8;

3) 5 мкг pX330_CR-N;

4) 5 мкг pX335_CR-7 + 5 мкг pX335_CR-8. Для проведения экспериментов по гомологичной

рекомбинации с донорными олигонуклеотидами использовали следующие комбинации:

1) 5 мкг pX330_CR-7 + 0,3 нмоль DonorF

2) 5 мкг pX330_CR-7 + 0,3 нмоль DonorR

3) 5 мкг pX335_CR-7 + 5 мкг pX335_CR-8 + 0,3 нмоль DonorF

4) 5 мкг pX335_CR-7 + 5 мкг pX335_CR-8 + 0,3 нмоль DonorR.

Для контроля электропорации использовали 2 мкг плазмидного вектора pmaxGFP (Lonza). После электропорации каждый образец высевали отдельно в одну лунку 6-луночного планшета (Thermo Fisher Scientific, США) в культуральную среду. Через 2 сут. выделяли геномную ДНК для дальнейшего анализа. DonorF

5'TACCTGCCCTCGCCCTGCCAGTCTGGCCAGAAGCCT TGCGGAAGCGGAGGCCGCTGCGCTGCCGCGGGCATCTGC TGCAGCGATGGTGCGC3' DonorR

5'CGCACCATCGCTGCAGCAGATGCCCGCGGCAGCGC AGCGGCCTCCGCTTCCGCAAGGCTTCTGGCCAGACTGGC AGGGCGAGGGCAGGTA3'

Определение эффективности трансфекции

Эффективность трансфекции определяли через 2 сут. в контрольных образцах с помощью проточной цитофлуориметрии, используя BD FACS Canto ii (BD Biosciences, США).

Выделение геномной ДНК

Геномную ДНК выделяли с помощью набора QiAamp DNA Mini Kit (QiAGEN) согласно протоколу производителя.

Анализ активности системы CRISPR/Cas9 в целевых сайтах

Анализ с помощью эндонуклеазы i фага T7 проводили, как описано ранее [11]. Содержащий про-тоспейсер участок геномной ДНК, выделенной из образцов после электропорации, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотид-ных праймеров:

Avp6f GACCCCCTTCATACTACTCACCCT Avp6r GTTAGATTTCCACTCTCGCCCTT 0xt4f CATCCCCTCACACTTGCC 0xt4r GCCCCCTCCTGCTCAC

Продукт ПЦР денатурировали при 95°С, затем снижали темепературу до 25°С со скоростью 0,3°С/с. Образовавшиеся гетеродуплексы подвергали гидролизу с помощью эндонуклеазы i фага T7 (T7 Endonuclease i, New England Biolabs, M0302S). Результаты анализа визуализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле.

Выявление потенциальных нецелевых сайтов действия CRISPR/Cas9

Потенциальные нецелевые сайты выявляли с помощью программного обеспечения CasOT (http:// eendb.zfgenetics.org/casot/) [12]. Для анализа использовали аннотированную последовательность генома крысы Rattus norvegicus Rnor_5.0.75 (Ensembl).

Рестрикционный анализ

Целевой участок геномной ДНК, выделенной из образцов после электропорации конструкций CRiSPR/Cas9 и донорных олигонуклеотидов, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием оли-гонуклеотидных праймеров (Avp6f и Avp6r). Продукт ПЦР подвергали гидролизу с помощью эндонуклеазы рестрикции BcgI (New England Biolabs, R0545S). Результаты анализа визуализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле.

Результаты

Выбор протоспейсеров CRISPR/Cas9

Мутация, вызывающая у крыс линии Brattleboro гипоталамический несахарный диабет — делеция гуанина во втором экзоне гена аргинин-вазопрессина (Avp) — может быть исправлена путем замены му-тантной последовательности генома на последовательность ДНК дикого типа с помощью гомологичной рекомбинации. В качестве донорной молекулы для гомологичной рекомбинации могут быть использованы одноцепочечные олигонуклеотиды. Ранее было показано, что для эффективного прохождения гомологичной рекомбинации с одноцепочечными олигонуклеотидами оптимальный размер донорной молекулы — 90 нуклеотидов [13]. При этом для увеличения эффективности гомологичной рекомбинации двунитевые разрывы, вносимые системой CRiSPR/Cas9, должны возникать в пределах участка гомологии между донорной молекулой и целевым участком генома. Соответственно, для увеличения частоты гомологичной рекомбинации во втором экзоне гена Avp крыс линии Brattleboro на участке вблизи мутации (в пределах 100 нуклеотидов) были выявлены потенциальные протоспейсеры (содержащие с З'-конца PAM - NGG) CRiSPR/Cas9. Чтобы избежать возникновения нецелевых эффектов в гене гормона окситоцина (Oxt) были разработаны три стратегии выбора сайтов действия CRiSPR/Cas9, использующие различия между двумя генами (Avp и Oxt):

1) использование самой мутации в качестве отличия между генами;

2) выбор протоспейсера на негомологичном участке — в интроне гена Avp;

3) Использование двух никаз Cas9 для внесения двунитевого разрыва, (рис. 1А, Б, В).

В рамках первой стратегии было выбрано два протоспейсера для действия комплекса sgRNA + ну-клеаза Cas9: CR-7 и CR-8 (табл.1). В мутантной последовательности гена Avp крыс линии Brattleboro PAM AGG непосредственно прилежит с З'-конца к протоспейсеру CR-7, а в последовательности дикого типа в гене Oxt между протоспейсером и PAM находится один нуклеотид (G), в результате чего спейсер сдвигается на один нуклеотид относительно протоспейсера. В случае протоспейсера CR-8 в гене Oxt первые 10 нуклеотидов с З'-конца спейсера совпадают с последовательностью протоспейсера, а затем происходит сдвиг на один нуклеотид. По литературным данным наиболее «важными» для узнавания протоспейсера системой CRiSPR/Cas9 являются 8-10 нуклеотидов на З'-конце, при этом эта система с определенной частотой способна вносить нецелевые двунитевые разрывы в сайты, отличающиеся от целевого протоспейсера заменами на 5'-конце [5]. Исходя из этих соображений, мы предполагаем

теоретическую возможность внесения двунитево-го разрыва в последовательность гена ОхЬ С1^Р1Т/ Cas9 со спейсером С1Г-8.

В рамках второй стратегии был использован тот факт, что делеция у крыс ВгаШеЬого произошла близко к стыку экзон-интрон (37 нуклеотидов). Выбран протоспейсер С1Т-1Ч большая часть которого и РАМ находится в интроне гена Avp (табл.1). Так как только кодирующие части генов Avp и ОхЬ гомологичны, то в локусе гена ОхЬ протоспейсера СН-Ы нет. Для внесения двунитевых разрывов в сайты С1Н-7, С1Н-8 и СН-Ы были сконструированы плазмидные векторы, кодирующие соответствующую sgRNА и нуклеазу Cas9 - рХ330_СН-7, рХ330_СН-8, рХ330_СН-Ы.

Наконец, в третьей стратегии для снижения потенциальных нецелевых эффектов был реализован подход с использованием двух никаз - му-татных нуклеаз Cas9n(□10А), которые вносят разрыв только в одну цепь ДНК. Два одноцепочечных разрыва на расстоянии до 100 нуклеотидов друг от друга приводят к двухцепочечному разрыву. Использование двух никаз уменьшает риск случайных нецелевых эффектов [14]. Поэтому для снижения вероятности возникновения нецелевых эффектов, в том числе и в гене ОхЬ, были сконструированы парные векторы, кодирующие sgRNА и никазы Cas9n(□10А) - рХ335_СН-7 и рХ335_ СН-8 (табл.1).

Экзон 1

Экзон 2

Экзон 3

-ж

sgRNA

CR-8

Cas9

Экзон 2 Экзон 2

-3' Si

sgRNA

✓ г n CR-8

"т"

Экзон 2 Интрон

3' 5' 3. —5' 31........................L...'"^^

В

Экзон 2

5. Ген Avp

sgRNA

R-7

fiS-ь» G

.3' 15'

3*"

.3' 15'

.3' ■ 5'

sgRNA _

T"1-".....'"">'"■ ■.................5' Ген Oxt

sgRNA CR-N

Cas9

Г

Д

" III Tube Tube .001

Ji РЗ Populat «Events »Parent %Tolai

1U ■ All Eve 22.929 rrtt 1000

в ■ P1 11.163 487 48 7

п 0 584 5.2 25

А

Cas9>

* S» ^

O- Qi <b

CT Cj А ЮООп.н.

«a' Gr

& & # ¿V / JZIM £ $ $ ££ <f

cf

ш^Ш Шшш

500п.н.

cf

О £

/

В * ^

P2 8 " JЛ),

8 -95% Avp Oxt

Рис. 1. Разработка стратегий для направленного внесения двунитевых разрывов в ген гормона аргинин-вазопрессина в эмбриональных фибробластах крыс линии Brattleboro:

А—В — схема расположения сайтов для действия системы CRiSPR/Cas9 (зеленым изображена кодирующая часть гена, серым — интронная часть гена; красным — single-guide РНК (sgRNA), узнающий соответствующий протоспейсер; желтым — последовательности мотивов, прилежащих к протоспейсеру (PAM)); Г — оценка эффективности электропорации; Д — результаты анализа с помощью эндонуклеазы i фага Т7.

Avp — ген гормона аргинин-вазопрессина, Oxt — ген гормона окситоцина. Стрелками обозначены продукты гидролиза, наличие которых свидетельствует о внесении в целевой ген двунитевых разрывов

Таблица 1. Последовательности целевых сайтов в гене Avp крыс линии ВгаШеЬого

Название Последовательность протоспейсера PAM*

CR-7 CCAGAAGCCTTGCGGAAGCG -AGG

CR-8 GCAGCGGCCTCGCTTCCGCA -AGG

CR-N GCGATGGTGCGCACAAAGCC -AGG

* — мотив, прилежащий к протоспейсеру (PAM).

Анализ способности системы CRISPR/Cas9 вносить двунитевые разрывы в целевом сайте

Для определения способности элементов системы CRiSPR/Cas9 вносить двунитевые разрывы в целевом сайте гена Avp проводили трансфекцию сконструированных плазмидных векторов в эмбриональные фибробласты крыс линии Brattleboro с помощью электропорации. Эффективность трансфекции составила ~95% (рис. 1Г). Через двое суток анализировали продукты ПЦР с помощью эндонукле-азы i фага Т7. Мы обнаружили, что двунитевые разрывы происходят во всех целевых протоспейсерах, причем при использовании двух никаз также детектируются следы двунитевых разрывов (рис. 1Д). При этом следов двунитевых разрывов на участке второго экзона гена Oxt обнаружено не было, следовательно, все разработанные стратегии позволяют избежать нецелевого эффекта в паралогичном гене.

Биоинформатический анализ нецелевых эффектов

Для определения потенциальных сайтов нецелевого действия системы CRiSPR/Cas9 в геноме (кроме гена Oxt) был проведен анализ с помощью программного обеспечения CasOT для каждого из

Таблица 2. Топ-5 нецелевых сайтов CRISPR/Cas9 Спейсер

CR-7 ctgagccg_CTTGCGGAAGCG

aCAGgAGC_CTTGCGcAAGCG GgAccAGC_CTTGgGGAAGCG aCAGtgGC_CTTGtGGAAGCG GaAGAAat_CTTGCaGAAGCG Общее число потенциальных нецелевых сайтов CR-8 GCtGCacC_CTCGCTTCCGCA

Gatcacaa_CTCGCTTCCGCA GgAGgaGC_CTgGCTTCCGCA GaAcCttC_CTCcCTTCCGCA cCgGCtaC_CTCtCTTCCGCA Общее число потенциальных нецелевых сайтов CR-N GtagTGGT_GCGCACAAAGCC

GCcccGGa_GCGCACAAAGCC aCtggGag_GCGCACAAAGCC GacccGcc_GCGCACAAAGCC cacccccT_GCGCACAAAGCC Общее число потенциальных нецелевых сайтов

выбранных спейсеров. Вероятность внесения двунитевых разрывов в нецелевом сайте, отличающегося от целевого однонуклеотидными заменами, зависит от количества и характера распределения этих замен [5]. Выявленные нецелевые сайты были ранжированы, после чего определяли:

1) общее число потенциальных нецелевых сайтов;

2) количество замен в сайте, для которого наиболее вероятно внесение нецелевого двунитевого разрыва (первый в рейтинге) (табл. 2).

Программное обеспечение присваивает на основании числа и характера отличий от целевого сайта потенциальным нецелевым сайтам ранг, представляющий собой двузначное число, где первая цифра — число замен в пределах первых 8 нуклеотидов от 3' конца (наиболее важный для узнавания участок), вторая цифра — число замен на 5'-конце сайта. Соответственно, чем больше ранг, тем больше замен в нецелевом сайте и тем меньше вероятность внесения нецелевого двунитевого разрыва [12]. И наоборот, чем меньше ранг, тем меньше различия между целевым и нецелевым сайтом и тем больше вероятность нецелевого эффекта. На основании данного анализа для дальнейшего использования был выбран спейсер CR-7, поскольку наиболее вероятный нецелевой сайт связывания этого спейсера содержит наибольшее число за-

-TGG 8 A08

-CGG 3 A12

-CGG 4 A13

-AGG 4 A13

-TGG 4 A13

3624

-GGG 3 A03

-CGG 7 A07

-GGG 4 A13

-TGG 5 A14

-GGG 5 A14

3934

-CGG 3 A03

-TGG 4 A04

-TGG 6 A06

-AGG 6 A06

-TGG 7 A07

6795

Последовательность нецелевого PAM** Число Ранг*

протоспейсера в геноме* замен

* — строчными буквами обозначены замены относительно целевого сайта, знаком «_» отделена наиболее чувствительная к заменам область.

** — мотив, прилежащий к протоспейсеру (PAM).

*** — описание в тексте статьи.

мен (семь однонуклеотидных замен против трех нейшей работы была отобрана стратегия с исполь-для С1Т-8 и СП-1\1). Также на основании биоинфор- зованием двух никаз рХ335_С1Т-7 + рХ335_С1Т-8 матического анализа нецелевых сайтов для даль- (табл. 3).

Таблица 3. Топ-5 нецелевых сайтов при использовании двух никаз для внесения двунитевого разрыва

pX335_CR-7

pX335_CR-8

Последовательность сайта в геноме*

PAM*

Ранг*

Последовательность сайта в геноме*

PAM*

Ранг*

Расстояние

между сайтами, п.н.

tCctgctC_ CcTGCGGAAGCG

AGG A16 GCtGCacC_

CTCGCTTCCGCA

GGG

A03

cCAGtctC_ CTCGCTTCCaCA

AGG A14 aCAGtgGC_

CTTGtGGAAGCG

AGG

A13

aCgtacaC_ CTCGtTTCCGCA

AGG A16 GgAaggaC_

CTTGCGGAAaCG

AGG

A15

tCcactGC_ CTTcCGGAAGCG

AGG A15 GgcctccC_

CTCGCTTCCGgA

AGG

A16

taAcaGcC_ CTgGCTTCCGCA

AGG A15 agcGcctC_

CTTGCGGAAGCc

AGG

A16

Общее число потенциальных нецелевых сайтов

7558

* — строчными буквами обозначены замены относительно целевого сайта, знаком «_» отделена наиболее чувствительная к заменам область.

** — мотив, прилежащий к протоспейсеру (PAM)

*** — описание в тексте статьи.

Выбор последовательностей донорных олигонуклеотидов для гомологичной рекомбинации

Показано, что для эффективного прохождения гомологичной рекомбинации с одноцепочечными олигонуклеотидами оптимальным размером донор-ной молекулы является 90 нуклеотидов. При этом целевые замены происходят с наибольшей частотой, если однонуклеотидные замены, которые будут внесены в целевой сайт генома, располагаются в центре донорной молекулы [13]. Используя данные критерии, для проведения гомологичной рекомбинации для исправления мутации были выбраны донорные олигонуклеотиды длиной 90 нуклеотидов в прямой (DonorF) и обратной ориентации (DonorR), представляющие собой участок последовательности второго экзона гена Avp дикого типа (рис. 2А).

Рестрикционный анализ

В результате делеции гуанина во втором экзоне гена Avp крыс линии Brattleboro возникает сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BcgI (рис. 2Б). В данной работе мы использовали этот факт, чтобы отличить мутантную последовательность от последовательности дикого типа. С помощью элек-тропорации в эмбриональные фибробласты крыс линии Brattleboro доставляли плазмидные векторы pX330_CR-7 или pX335_CR-7+ pX335_CR-8 одновременно с донорными олигонуклеотидами. Через двое суток выделяли геномную ДНК и проводили рестрикционный анализ продуктов ПЦР после

амплификации участка второго экзона гена Avp, используя эндонуклеазу рестрикции Bcgl. В результате этого анализа мы обнаружили, что продукт ПЦР, полученный при использовании в качестве матрицы геномной ДНК опытных образцов, гидролизуется не полностью (рис. 2В). По-видимому, в опытных образцах пропадает сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BcgI, что возможно является результатом прохождения гомологичной рекомбинации и замены мутантной последовательности второго экзона гена Avp на последовательность дикого типа.

Обсуждение

В данной работе мы использовали систему CRiSPR/Cas9 для внесения направленных изменений в ген гормона аргинин-вазопрессина крыс линии Brattleboro. Целевой участок гена отличается всего на один нуклеотид от соответствующего участка гена гормона окситоцина — делецией гуанина во втором экзоне гена гормона аргинин-вазопрессина, которая приводит к развитию гипоталамического несахарного диабета у крыс этой линии.Тем не менее с помощью тщательного выбора сайтов для действия CRiSPR/Cas9 нам удалось обеспечить узнавание целевого гена и избежать нецелевых эффектов в гене окситоцина. Для этого нами в качестве отличия между паралогичными генами была использована сама мутация. Более того с использованием двух никаз не только не происходит внесения нецелевых двуни-тевых разрывов в паралогичном гене, но и снижена вероятность нецелевых эффектов в других сайтах в геноме.

А

Б

В

Рис. 2. Выбор донорных одоцепочечных олигонуклеотидов и результаты рестрикционного анализа: А — схема целевого участка гена аргинин-вазопрессина (Avp) (CR7, CR8 — протоспейсеры (красные линии), DonorF — донорный одноцепочечный олигонуклеотид в прямой ориентации, DonorR — донорный одноцепочечный олигонуклеотид в обратной ориентации);

Б — сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BcgI в гене Avp (желтым обозначены нуклеотиды, которые узнает BcgI, зеленым — участок, вырезаемый BcgI, звездочкой — делеция в гене Avp крыс Brattleboro, красным — соответствующие последовательности в гене Avp); В — результаты рестрикционного анализа.

+/+--образец дикого типа; +/di — гетерозиготный образец. Стрелками обозначены не гидролизованные

продукты в экспериментальных образцах. п.н. — пары нуклеотидов

Разработанные нами стратегии выбора спейсеров CRiSPR/Cas9 позволяют направленно вносить модификации в целевые мутантные копии генов, не затрагивая при этом копии дикого типа. Такой подход может быть использован при исправлении мутаций или, наоборот, внесении мутаций (для моделирования заболеваний in vitro) в геном гетерозигот по целевому гену, либо в случае, когда целевой ген входит в семейство генов с близкими последователь-

ностями. Также другой точкой приложения этих стратегий является направленный нокаут целевых генов, например, для изучений функций отдельных генов, входящих в кластеры генов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 16-34-00887 мол а.

литература

1. Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П. и др. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas — инструменты открытий. Acta Naturae 2014, 6(3): 20-42.

2. Ran F.A., Cong L., Yan W.X. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 2015; 520(7546): 186-91.

3. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339(6121): 819-23.

4. Cox D.B., Platt R.J., Zhang F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nat. Med. 2015; 21(2): 121-31.

5. Fu Y., Foden J.A., Khayter C. et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 2013; 31(9): 822-6.

6. Zhang M., D>Aniello C., Verkerk A.O. et al. Recessive cardiac phenotypes in induced pluripotent stem cell models of Jervell and Lange-Nielsen syndrome: disease mechanisms and pharmacological rescue. PNAS USA 2014; 111(50): E5383-92.

7. Liang P., Xu Y., Zhang X. et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell 2015; 6(5): 363-72.

8. Cho S.W., Kim S., Kim J.M. et al. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat. Biotechnol. 2013; 31(3): 230-2.

9. Schmale H. and Richter D. Single base deletion in the vasopressin gene is the cause of diabetes insipidus in Brattleboro rats. Nature 1984; 308(5961): 705-9.

10. Donaldson Z.R., Young L.J. Oxytocin, vasopressin, and the neurogenetics of sociality. Science 2008; 322(5903): 900-4.

11. Reyon D., Tsai S.Q., Khayter C. et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat. Biotechnol. 2012; 30(5): 460-5.

12. Xiao A., Cheng Z., Kong L. et al. CasOT: a genome-wide Cas9/ gRNA off-target searching tool. Bioinformatics 2014.

13. Yang L., Guell M., Byrne S. et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res 2013; 41(19): 9049-61.

14. Ran F.A., Hsu P.D., Lin C.Y. et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell 2013; 154(6): 1380-9.

Поступила: 14.03.2016