CC BY
136
УДК 576.8:576.852.2
Г. Я. Дараселия, М. И. Фомина
СТИМУЛЯЦИЯ РОСТА И КАРОТИНОГЕНЕЗА RHODOCOCCUS SPEClUM ШТАММ 44
Каротиноиды представляют собой наиболее многочисленную и широко распространенную группу природных пигментов. Выделено и изучено около 600 каротиноидов [1]. Помимо растений, каротиноиды образуют фототрофные бактерии, а также ряд хемотрофных бактерий, например псевдомонады, актиномицеты, нокардио- и коринеподобные бактерии. Кроме того, каротиноиды содержатся в организме животных - морских и пресноводных беспозвоночных, насекомых, птиц и млекопитающих, но не образуются ими, а поступают с пищей и служат источником витамина А, могут участвовать в ионном обмене, перекисном окислении липидов и способствовать адаптации к гипоксии.
У микроорганизмов обнаружены арилкаротиноиды, фенольные каротиноиды с тройной связью между атомами углерода в цепи. Они могут быть связаны с сахарным остатком, жирными кислотами, липидами, белками. Каротиноиды выполняют различные функции в живой клетке. У фотосинтезирующих бактерий каротиноиды способны поглощать лучистую энергию в синей области спектра и передавать ее на хлорофилл [2, 3]. У нефотосинтезирующих бактерий каротиноиды защищают мембраны от фотодинамического уничтожения [4]. Защита имеет место в менахиновом центре [5], и активными компонентами являются каротиноиды, связанные с фосфолипидами [6]. Имеются данные о способности каротиноидов предохранять бактерии от вредного действия озона и перекиси водорода [7]. Каротиноиды участвуют в процессе дыхания у гетеротрофных микроорганизмов. Предполагается, что соединения, содержащие двойные связи, могут быть потенциальными оксигеназами. Они также принимают активное участие в цитодифференцировке грибов, т. е. структур, связанных с процессами бесполой и половой репродукции [8]. Каротиноиды совместно с миоглобином образуют систему внутриклеточного депонирования кислорода [9, 10].
Каротиноиды - биоантиокислители, выступают как средство, эффективно тормозящее развитие свободнорадикального окисления (СРО), а свободнорадикальная патология (СРП) является в настоящее время одним из основных факторов, нарушающих жизненно важные функции организма человека [1], особенно функции его репродуктивных органов. Наиболее важное лечебное действие каротиноидов связано с их А-витаминной активностью. Они являются эффективным средством при лечении последствий гипо- и А-авитоминоза.
Многостороннее биологическое действие каротиноидов обусловливает их эффективное использование для профилактики и лечения заболеваний, непосредственно не связанных с недостатком витамина А в организме. В литературе нередко отмечалось ингибирующее влияние витамина А на развитие злокачественных опухолей [11]. Антиопухолевое действие ретинола открывает возможность использования для этой цели не только витамина А, но и других тер-пеноидных соединений, которые в организме превращаются в этот витамин [8]. Кроме чистых препаратов каротина, успешное испытание прошли комплексные соединения с белком. Комплекс Р-каротина с казеином, названный каротеином, значительно лучше усваивался и превращался в витамин А, чем пигмент в масляном растворе. Испытания, проведенные в клинике, показали, что применение каротеина в сочетании с обычным лечением и диетотерапией ускоряет снятие болевого синдрома и смягчение диспепсических явлений. Препарат оказался эффективным также при острых кишечных заболеваниях у детей раннего возраста [12].
Р-Каротин и другие каротиноиды находят применение в медицинской практике и как средство для лечения отдельных кожных заболеваний. Каротин уменьшает зуд и воспаление в очагах поражения и способствует заживлению и ликвидации патологического процесса. Раствор каротина в соевом масле с успехом применяется для лечения трофических язв голени [13]. Вероятно, целительное влияние масла облепихи при лечении ожогов обусловлено высокой концентрацией в нем каротина - до 10 мг [12]. Одним из свойств витамина А является его антистрессовое воздействие на организм человека. Были проведены исследования на больных хроническими нагноительными процессами в легких, подвергнутых операции йодэндотрахеальным
эфирным наркозом. Установлено, что внутримышечное введение суточной дозы витамина А за 30 минут до операции повышает защитные реакции организма в ответ на сильный стрессовый раздражитель. Это позволяет, по мнению исследователей, рекомендовать включение витамина А в комплекс предоперационной подготовки [14]. Не исключено, что как антистрессовое средство можно использовать и каротиноиды, полученные из пигментных родококков.
В опытах in vitro показана антибактериальная активность каротиноидных пигментов против грамположительных (Staphylococcus aureus 209, Staphylococcus albus дифтероид, Вас. Sub-tilis и Вас. Mycoides) и грамотрицательных (Bac. coli), споровых и неспоровых микроорганизмов, палочек и кокков. Изучали влияние пигментов на дизентерийные, тифозные и паратифозные бактерии, на возбудителей раневой инфекции - стафилококки, синегнойную палочку и протей. Все пигменты оказывали слабое антибактериальное действие на грамотрицательную микрофлору, несколько более сильное - на грамположительную (1:1000-1:16000). Для подавления кокковых форм требуются меньшие концентрации пигментов, чем для подавления споровых палочек [5].
Исследования, проведенные в последние десятилетия, открыли новые источники продуцентов каротиноидов - нокардио- и коринеподобные микроорганизмы, определенные представители которых (родококки) активно синтезируют эти вещества [16-23]. Среди них большой интерес вызывают собственно каротиноиды, такие как а-, в- и у-каротины, провитамин А, а также кислородсодержащие зеакаротин и ликопин как антиоксидантные и противоопухолевые агенты. В связи с этим огромный интерес вызывают у биотехнологов процессы стимуляции и регуляции синтеза этих веществ еще и потому, что они являются одновременно ценным природным красителем, придающим розовую и красную окраски пищевым изделиям [1].
В современной биотехнологии при получении вторичных метаболитов эффективным приемом является воздействие на этот процесс специальными соединениями, получившими название химических биорегуляторов [24]. В качестве примера можно назвать такие соединения, как в-ионон, триспоровые кислоты и витамин А, использование которых позволяет в 10-15 раз увеличить выход в-каротина у мукорового гриба Blakeslea trispora [25].
Химический синтез зеакаротина и ликопина менее экономичен и технологически более сложен, чем микробиологический, поэтому, используя такие биорегуляторы, как производные триалкиламмонийхлорида (СИТА, циклоцел) и некоторые производные пиридина, удалось увеличить выход ликопина в результате ингибирования каротинобразования у растений, грибов и бактерий [26]. Аналогичные исследования проводили и со сверхсинтетиком в-каротина муко-ровым грибом Blakeslea trispora, который используется для получения этого каротиноида в заводских условиях [27, 28].
Действие таких физико-химических факторов, как свет, температура, аэрация, источники углерода, азота, соотношение углерода и азота [8, 29] имеют большое значение для образования каротиноидов. Кроме того, в присутствии некоторых химических соединений биосинтез каротиноидов может происходить без участия света. Такими соединениями для Fusacium aguaeductum и Nerassa являются пара-хлормеркурбензоат и перекись водорода [7], для Mycobacterium mari-num - антимицин А [6, 30, 31]. Установлено, что стимуляторами синтеза ликопина у Blakeslea trispora являются производные пиридина, среди которых наиболее эффективен 6-метил-2-аминопиридин. Результаты опытов с циклогексимидином и актиномицином D показывают, что этот стимулятор ликопинобразования действует как репрессор гена, регулирующего синтез специфических ферментов /a/ denovo. Действие 6-метил-2-аминопиридина на состав каротинои-дов Blakeslea trispora позволяет предположить, что он ингибирует циклазы и некоторые дегидрогеназы и является стимулятором синтеза каротиноидных пигментов и их предшественников. Антиоксидант стимулирует синтез ликопина, оказывая аддитивное действие на фоне внесения производного пиридина. Выдвигается предположение о биологической функции ликопина у Blakeslea trispora [32].
Однако, несмотря на значительные успехи, достигнутые при подборе и использовании соответствующих химических биорегуляторов, позволивших увеличить выход физиологически активных веществ, стоимость этих стимуляторов выше, и их производство технологически более сложно. Это в определенной степени тормозит дальнейшие биотехнологические разработки и их внедрение в масштабах промышленного производства. Иоэтому целью настоящего исследования были: 1) поиск новых стимуляторов каротиногенеза микробного происхождения; 2) разработка способа их внесения в инкубационную среду и выяснение закономерностей роста и развития продуцента Rhodococcus specium штамм 44.
В ходе исследований для стимуляции каротиногенеза Rhodococcus specium штамм 44 мы использовали комплексный кислотный гидролизат бактериального происхождения исследуемого штамма.
Стимулятор вносили непосредственно в среду перед стерилизацией (табл. 1), а также спустя 24 и 48 часов.
Таблица 1
Влияние кислотного гидролиза на рост и каротиногенез Rhodococcus specium штамм 44
Количество стимулятора, мл/л Сухая биомасса Каротиноиды
г/л %, к контролю мкг/г %, к контролю мкг/л %, к контролю
^троль 12 100 З 400 100 64 S00 100
0,10 12,в 106,6 6 144 11З,7 7S 64З 121,З
0,15 14,0 116,6 6 650 12З,1 9З 100 14З,6
0,20 16,0 1ЗЗ,З 7 7S0 144,0 124 4S0 192,0
0,25 15,5 129,1 7 760 14З,7 120 2S0 1S5,6
0,З0 15,0 125,0 6 S09 126,0 10З 6З5 159,9
Однако внесение стимулятора на 24 часа культивирования не оказывало никакого действия, а внесение через 4S часов культивирования - угнетало рост и биосинтез каротиноидов.
^к видно из табл. 1, внесение стимулятора перед стерилизацией среды культивирования увеличивает и прирост биомассы, и количество каротиноидов. Биомасса увеличивается по сравнению с контролем на ЗЗ %, а количество каротиноидов - на 92 %. Установлено, что наиболее благоприятное действие на рост и каротиногенез Rhodococcus specium штамм 44 оказало внесение
0,2 мл стимулятора.
В другой серии опытов выяснили влияние культуральной жидкости исходной культуры на рост и биосинтез каротиноидов. Указанную жидкость вносили непосредственно в среду перед стерилизацией в различных концентрациях (табл. 2).
Таблица 2
Влияние культуральной жидкости на рост и каротиногенез Rhodococcus specium штамм 44
Количество культуральной жидкости, мл/л Сухая биомасса Каротиноиды
г/л %, к контролю мкг/г %, к контролю мкг/л %, к контролю
^троль 12 100 З З00 100 6З 600 100
1 11,0 91,6 з S00 109,4 76 560 120,З
2 15,5 129,1 6 700 126,4 10З S50 16З,2
4 14,0 116,6 6 250 117,9 S7 500 1З7,5
6 14,0 116,6 6 000 11З,2 S4 000 1З2,0
Как видно из табл. 2, добавление в среду культуральной жидкости в указанных количествах, за исключением 1 мл/л, увеличивало количество биомассы до 16-29 %, а количество каро-тиноидов - до 20-63 %. Наиболее благоприятным для роста и каротиногенеза культуры оказалось внесение 2 мл/л культуральной жидкости.
В результате анализа данных по влиянию испытанных веществ на рост и каротиногенез Rhodococcus specium штамм 44, а также имеющихся данных о воздействии различных веществ на развитие и каротинообразование других продуцентов каротиноидов, оказалось, что действие большинства из них скорее специфично, чем универсально. Очевидно, что влияние биостимуляторов на рост и каротиногенез Rhodococcus specium штамм 44 зависит от особенностей обмена данного штамма, характера стимулирующего действия отдельных веществ и относится только к данному штамму.
17З
Иознание закономерностей роста, развития и каротиногенеза Rhodococcus specium штамм 44 на различных питательных средах, с применением разнообразных источников углерода, азота и стимуляторов, а также определение удельной скорости роста, экономического коэффициента, скорости синтеза каротиноидов и, наконец, фазы развития культуры являются необходимым этапом при решении проблем, которые сопровождают промышленное производство ценных препаратов для здравоохранения. Rhodococcus specium штамм 44 - один из немногих видов микроорганизмов, способных накапливать в большом количестве белки, витамины группы В и, особенно, каротиноиды (каротины и ксантофиллы). Иоэтому его можно отнести к наиболее перспективным видам для получения нового комплексного препарата, эффективного иммуностимулятора широкого спектра действия.
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Goodwin T. W. The biochemistry of the carotenoids. - London - New York, 1980. - P. 373.
2. КондратьеваЕ. Н. Фотосинтезирующие бактерии и бактериальный фотосинтез. - М.: МГУ, 1972. - 76 с.
3. Максимова И. В. Бактериальный фотосинтез в разных участках спектра // Проблемы фотосинтеза. Докл. на 2-й Всесоюз. конф. по фотосинтезу. - М., 1959. - С. 386-392.
4. DavidH. L. Carotenoid pigments of Mycobacterium Kansasii // Appl. Microbiol. - 1974. - Vol. 28, N 4. - P. 646-699.
5. Preblle J. The carotenoids of Corynebacterium fascians strain 2y // J. Gen. Microbiol. - 1968. - Vol. 52, N 1. - P. 15-25.
6. Batra P. P. Mechanisms of photoinduced carotenoids syntesis // J. Biol. Chem. - 1967. - Vol. 242. - P. 5630-5636.
7. Зобнина В. П. Физиологическая роль каротиноидов у Mycobacterium carotenum: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1974. - 28 с.
8. ФеофиловаЕ. П. Пигменты микроорганизмов. - М.: Наука, 1974. - 218 с.
9. Карнаухов И. Л. Функции каротиноидов в клетках животных. - М.: Наука, 1973. - 104 с.
10. Theimer R. R., Rau W. Untesuchungen uber die lichtabhangige Carotenoidsynthese. Extinction of the photoinduction by reducing Substances and Substitution of hydrogen peroxide for light. - Planta, 1970. -Vol. 92. - P. 129-137.
11. Леутский К. М. О механизмах действия витамина А // Обмен и функции витамина А и каротина в организме человека и животных, их практическое использование: Тез. докл. 2-й Всесоюз. конф., 15-18 сент. 1976 г., Черновцы. - Черновцы, 1976. - С. 91-96.
12. Гелескул Ю. Ф. Искусственные комплексы в-каротина с белками, их химические и биологические свойства: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Киев, 1966. - 18 с.
13. Шнаидман Л. О. Производство витаминов. - М.: Наука, 1950. - 323 с.
14. Характер метаболических процессов под влиянием витамина А у больных оперированных под наркозом / Э. И. Казимирко, В. К. Казимирко, Г. В. Степанова и др. // Обмен и функции витамина А
и каротина в организме человека и животных, их практическое использование: Тез. докл. 2-й Всесоюз. конф., 15-18 сент. 1976 г. - Черновцы, 1976. - С. 71.
15. Безбородов А. И., Добромыслов В. В. Антибактериальное действие некоторых каротиноидов микробного происхождения // Микробиология. - 1955. - 24, № 6. - С. 697-699.
16. Дараселия Г. Я. Изменчивость Mycobacterium phlei no пигментообразованию под действием различных мутагенов // Генетика. - 1971. - Т. 7, № 8. - С. 137-143.
17. Дараселия Г. Я. Влияние магнитофоров на рост и каротиногенез Mycobacterium phlei // Сообщения АН ГССР. - 1976. - Т. 82, № 1. - С. 201.
18. Дараселия Г. Я. Состав пигментов Mycobacterium rubrum // Микробиология. - 1979. - № 5. - С. 942-944.
19. Дараселия Г. Я., Бочоридзе Л. Д. Каротиноидные пигмент Mycobacterium brevicale // Микробиологический журнал. - 1979. - Т. 41, вып. 6. - С. 685-687.
20. Дараселия Г. Я. Изменчивость пигментообразования у Mycobacterium rubrum штамм 44 под действием химических мутагенов // Микробиология. - 1982. - № 6. - С. 965-972.
21. Дараселия Г. Я. Селекция Mycobacterium locticolum по синтезу каротиноидов // Изв. АН ГССР. Сер. биол. - 1982. - Т. 8, № 6. - С. 419-424.
22. Дараселия Г. Я. Состав пигментов Mycobacterium mucosum и Mycobacterium fimi // Микробиология. -1983. - № 1. - С. 156-158.
23. Дараселия Г. Я., Хачапуридзе Э. О., Гагелидзе Н. А., Амиранашвили Л. Л. Кинетика роста и развития Mycobacterium rubrum при периодическом культивировании // Микробиология. - 1989. - Т. 58, вып. 4. -С. 596-601.
24. Nelis H. J, De Leenher A. P. Appl. Bacteriol. - 1991. - Vol. 70, N 1. - P. 181.
25. Феофилова Е. П. Прикладная биохимия и микробиология. - 1994. - Т. 30, вып. 2. - С. 181.
26. Siefermann D. In: Lipids and Lipid Polimers in Hegher Plants. - London, 1977. - 208 p.
27. Феофилова Е. П., Пахлавуни И. К. Микробиология. - І972. - Т. 4І, вып. 2. - С. 260.
2S. Elahi M., Chichester C. O., Simpson K. // Phytochem. - І97З. - Vol. І2. - P. І6ЗЗ.
29. Возняковская Ю. М., Дараселия Г. Я. Мутанты Mycobacterium phlei с повышенным синтезом каротиноидов // Микробиология. - І972. - 4І, № 5. - С. SS6-S90.
30. Batra P. P., Rilling H. C. On the mechanisms of photoinduced carotenoid syntesis aspects of the photoinduced reaction // Arch. Biochem. - І964. - Vol. l07. - P. 4S5-492.
31. Rau W. Untersuchtenger uber Lichtabhangige Carotinoidsuiathse. II. Ersats der Lichtingduction durch Mercuribenzoat // Planfa. - І967. - Vol. 74. - P. 263-277.
32. Феофилова Е. П., Терешина В. M., Меморская А. С. Регуляция синтеза ликопина у мукорового гриба Blakeslea trispora производными пиридина // Микробиология. - І995. - Т. 64, № 6. - С. 734-740.
Статья поступила в редакцию 1S.02.200S
STIMULATION OF GROWTH CAROTENOGENESIS RHODOCOCCUS SPECIUM CULTURE 44
G. Ya. Daraseliya, M. I. Fomina
It was experimentally established, that the application of acid hydrolyzate in cultivation environment increases a biomass gain and the quantity of caroti-noids by 33 and 92 % accordingly; the addition of culture fluid increases the quantity of biomass by І6-29 %, the quantity of carotinoids by 20-63 %. It is proved, that the influence of biostimulant on the growth and carotenogenesis Rhodococcus specium culture 44 depends on the exchange features of the given culture, the character of stimulating action of separate substances and concerns only the given culture.
Key words: cultivation environment, biomass, carotinoids, biostimulant, carotenogenesis.
