CC BY
35
15. Ulbrandt N. D., Ji H., Patel N. K. et al. Isolation and characterization of monoclonal antibodies which neutralize human metapneumovirus in vitro and in vivo // J. Virol. - 2006. - Vol. 80. - P. 7799-7806.
16. Van den Hoogen B. G., de Jong J. C., Groen J. et al. A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease // Nat. Med. - 2001. - Vol. 7. - P. 719-724.
17. Viazov S., Ratjen F., Scheidhauer R. et al. High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41, N 7. - P. 3043-3045.
18. Wilkesmann A., Schildgen O., Eis-Hubinger A. M. et al. Human metapneumovirus infections cause similar symptoms and clinical
severity as respiratory syncytial virus infections // Eur. J. Pediatr. -2006. - Vol. 165, N 7. - P. 467-475.
19. Wyde P. R., Chetty E. H., Jewell A. M. et al. Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by Ribavirin and immune serum globulin in vitro // Antiviral Res. - 2003. - Vol. 60. - P. 51-59.
20. Wyde P. R., Moylett E. H., Chetty E. H. et al. Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMSO3 in tissue culture assays // Antiviral Res. - 2004. -Vol. 63. - P. 51-59.
Поступила 30.09.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.371:578.832.1].015.46
А. Н. Найхин, Т. В. Чиркова, Г. Д. Петухова, Д. А. Кореньков, С. А. Донина, Л. Г. Руденко
Стимуляция гомо- и гетерологичной Т-клеточной иммунологической памяти у волонтеров, привитых живой реассортантной гриппозной вакциной типа A(H5N2)
НИИ экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург
Работа посвящена изучению способности живой реассортантной гриппозной вакцины (ЖГВ) типа A(H5N2) стимулировать у людей Т-клеточный иммунный ответ, опосредованный вирусспецифическими CD4+- и С08+-клетками иммунологической памяти. Эти данные сопоставлены с количественными характеристиками гуморального иммунного ответа. Показано, что двукратная интраназальная иммунизация жгВ A(H5N2) «наивных» в отношении контактов с возбудителем птичьего гриппа людей индуцирует у них продукцию циркулирующих вирусспецифических CD8+^ CD4+-клеток памяти, специфических как к вакцинному штамму, так и к актуальному вирусу гриппа A(H1N1). Получены данные, свидетельствующие о том, что часть взрослых людей не являются абсолютно неиммунными в отношении птичьего вируса гриппа A(H5N2), поскольку в довакцинальном периоде у них обнаруживают перекрестно реагирующие Т-клетки иммунологической памяти, специфические к этому возбудителю. Количество (в %) этих клеток значительно варьирует внутри группы. Количественные показатели поствакцинального накопления CD4+- и CD8+-клеток памяти находились в обратной зависимости от их предвакцинального уровня.
Ключевые слова: живая гриппозная вакцина, птичий грипп, иммунологическая память
Stimulation of homo- and heterologic T-cell immunological memory in volunteers inoculated with live influenza A (H5N2) reassortant vaccine
A. N. Naikhin, T. V. Chirkova, G. D. Petukhova, D. A. Korenkov, S. A. Donina, L. G. Rudenko
Research Institute of Experimental Medicine, North-Western Branch, Russian Academy of Medical Sciences,
Saint Petersburg
The study deals with the ability of live attenuated reassortant influenza vaccine (LAiV) A (H5N2) to stimulate a CD4+ and CD8+ immunological memory T cell-mediated immune response in volunteers. These data were compared with the quantitative characteristics of a humoral immune response. A two-dose regimen of intranasal vaccination of avian influenza naive people with A (H5N2) LAiV induced the production of circulating CD4+ and CD8+ memory cells specific to both A (H5N2) and seasonal A (H1N1) influenza strains. Some of the volunteers were not absolutely A (H5N2) influenza virus naive since they had been found to have this virus-specific cross-reactive immunological memory T-cells in the prevaccination period. The content (%) of these cells varied significantly within the group. The quantitative values of postvaccination CD4+ and CD8+ memory cell accumulation were inversely related to their prevaccination level.
Key words: live influenza vaccine, avian influenza, immunological memory
Потенциальным источником появления пандемических вирусов гриппа А в человеческой популяции являются циркулирующие среди диких и домашних птиц вирусы этого подтипа. В 1997—2005 гг. во время многочисленных вспышек гриппа A(H5N1) среди птиц зарегистрировано несколько сотен людей, инфицированных этим возбудителем [20]. У большей части из них наблюдались тяжелые клинические проявления с частыми летальными исходами. Хотя прямых доказа-
тельств передачи птичьих вирусов гриппа от человека к человеку не получено, по рекомендации ВОЗ разработаны разные типы вакцин для защиты людей от этих вирусов [7]. Проведены клинические испытания нескольких вариантов инактивированных (ИГВ) [7] и живых (ЖГВ) [6, 14] гриппозных вакцин типа A(H5N1). Все они индуцировали у волонтеров накопление циркулирующих и/или локальных антител.
Разработана ЖГВ типа A(H5N2) на основе реас-
Контактная информация:
Петухова Галина Дмитриевна, канд. биол. наук, науч. сотр.; e-mail: gala.iem@gmail.com
38
сортации непатогенного для людей птичьего вируса гриппа А/Утка/Потсдам/1402-6/68 (H5N2) и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [5, 17]. Эта вакцина содержит ген гемагглютинина от первого штамма, а все остальные гены от донора аттенуации. Исследования вакцины на животных и в клинических испытаниях на добровольцах показали ее безвредность и достаточную иммуногенность в отношении стимуляции циркулирующих и локальных антител не только к вакцинному штамму A(H5N2), но и к вирусу гриппа A(H5N1). При этом уровень защиты иммунизированных вирусом A(H5N2) мышей от летальной дозы вируса A(H5N1) составил 80—100%.
Целью настоящей работы явилось изучение способности ЖГВ типа A(H5N2) стимулировать у людей Т-клеточный иммунный ответ, опосредованный вирусспецифическими CD4- и СD8-лимфоцитами иммунологической памяти. Эти данные сопоставлены с количественными характеристиками гуморального иммунного ответа.
Материалы и методы
Волонтеры и вакцинация. В исследовании принимали участие 19 здоровых молодых волонтеров 18—22 лет, не имеющих противопоказаний к вакцинации ЖГВ. Волонтеры были разделены на две группы: 10 человек, двукратно вакцинированных ЖГВ А/17/ Утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в дозе 7,0 lgEID50/0,5 мл с интервалом 21 день; 9 человек, получавших препарат плацебо по такой же схеме. Образцы венозной крови, носовых секретов и слюны отбирали до вакцинации (Д0), через 21 день после первой вакцинации (Д21), через 21 день после второй вакцинации (Д42) и через 42 дня после второй вакцинации (Д63).
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и реакция микронейтрализации (РМН). Обе реакции воспроизводили по стандартным методикам [11, 16]. В качестве антигена использовали вакцинный штамм А/17/ Утка/Потсдам/86/92 (H5N2). Достоверным приростом антител считали повышение их титра в 4 раза и более.
Иммуноферментный анализ (ИФА). IgG-антитела в сыворотке крови и локальные IgA-антитела в секретах верхних дыхательных путей и слюне выявляли с помощью ИФА по методике, описанной в работе [2]. На планшеты сорбировали 16 АЕ вируса А/17/Утка/ Потсдам/86/92 (H5N2), очищенного ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы (30—60%). За титр антител принимали наибольшее разведение исследуемого материала, при котором оптическая плотность (ОП) лунки с образцом превышала среднюю ОП 6 контрольных лунок в 2 раза и более.
Внутриклеточное окрашивание цитокинов проводили по методу, описанному в работе [9]. Монону-клеары периферической крови выделяли стандартным способом [4], криоконсервировали и хранили в жидком азоте до момента анализа. Размороженные клетки каждого образца делили на две части, одну из которых инкубировали с 1,5 MOI очищенного вируса А/17/Утка/Потсдам/86/92(H5N2) или А/17/Соломоно-вы острова/06/9 (H1N1), а вторую - с таким же объемом RPMI-1640 (негативный контроль). Анализ выполняли на проточном цитофлюориметре Coulter EPICS Altra («Beckman Coulter», США). Процент специфических к вирусам гриппа A(H5N2) и (H1N1) 1КЫ-у+-лимфоцитов определяли для следующих субпопуляций клеток: CD4+ Т-клетки (ИФН-y+CD3+CD8") и CD8+ Т-клетки (ИФН-у+ CD3+CD8+). За достоверные увеличения уровней клеток принимали результаты, превышающие среднее значение по группе плацебо на 3 стандартных отклонения и более.
Статистический анализ результатов проводили с использованием критерия Вилкоксона, t-теста и коэффициента корреляции Спирмена. Достоверными считали результаты прир < 0,05.
Результаты
В табл. 1 представлены данные об индукции у волонтеров поствакцинального клеточного иммунного ответа.
Обращает на себя внимание тот факт, что в довакцинальный период (Д0) у волонтеров определялись CD8+^ CD4+-клетки памяти, специфические не только к циркулирующему среди людей вирусу гриппа A(H1N1), но и к птичьему вирусу A(H5N2). Перед введением ЖГВ фоновые индивидуальные уровни изученных субпопуляций лимфоцитов значительно колебались.
После первой прививки (Д21) незначительно (в 1,2 раза) возрос только уровень (в %) специфических к вирусу A(H5N2) CD8+-клеток (р > 0,05). На 42-й день после вторичной вакцинации этот показатель увеличился для CD8+- и CD4+-клеток соответственно в 3,6 и
2.6 раза (р < 0,01). В этот же период значительно возрос и уровень этих клеток, специфических к гетерологичному вирусу гриппа A(H1N1) — соответственно в 2,5 и
1.7 раза (р < 0,05).
После первой прививки доля лиц с достоверным увеличением уровня специфических к вирусу гриппа A(H5N2) CD8+- и CD4+-клеток памяти составил соответственно 20 и 10%, через 21 день после повторной вакцинации - соответственно 40 и 30%, через 42 дня после повторной вакцинации - соответственно 60 и 60%. Такая же тенденция отмечена и по показателям клеточного иммунного ответа к гетерологичному вирусу гриппа A(H1N1), но показатели были ниже. Таким образом, повторная вакцинация вирусом гриппа A(H5N2) индуцировала у волонтеров накопление обоих типов Т-клеток памяти, специфических как к вводимому гомологичному вирусу (H5N1), так и к гетеротипическому вирусу подтипа А (H1N1).
Учитывая широкий разброс данных о концентрации Т-клеток памяти в периферической крови людей перед вакцинацией, проанализировали влияние исходных уровней специфических к вирусу A(H5N2) CD8+- и CD4+-лимфоцитов памяти на количественные показатели их накопления в поствакцинальный период. Во всех временных интервалах (Д21, Д42 и Д63) обнаружено существование обратной зависимости между исходными уровнями обоих типов клеток перед вакцинацией и кратностью их прироста после введения ЖГВ (r от -0,31 до -0,77), но статистически значимая величина коэффициента корреляции получена только в Д63 по отношению к Д0, а также в Д42 и Д63 по отношению к Д21. Таким образом, предвакцинальные уровни CD8+ и CD4+ Т-клеток влияли на их продукцию в ответ на введение ЖГВ типа A(H5N2).
В табл. 2 приведены сравнительные данные о частоте достоверных гуморальных и клеточных иммунных ответов на прививку ЖГВ типа А (H5N2) у лиц, у которых не отмечены достоверные конверсии антител в РТГА, т. е. в традиционном и единственном регламентированном в России методе оценки иммуногенности гриппозных вакцин. По кумулятивным показателям через 21 день после второй прививки (Д42) все эти лица ответили достоверным увеличением уровня тех или иных факторов противогриппозного иммунитета, фиксируемых в других тестах. При этом по данным исследования Т-клеток памяти доля таких лиц составила 80% (4 человека из 5). Таким образом, по отношению к результатам РТГА использование других методов определения антител, а также сведения об индукции
39
Таблица 1
Индукция ЖГВ типа A (H5N2) вирусспецифических CD8+ и CD4+ Т-клеток памяти у волонтеров
Фенотип клеток Группа, получавшая Число лиц в группе Дни (Д) обследования* Кратность прироста клеток по отношению к довакцинальному уровню Число поствакцинальных достоверных конверсий клеток**
гомологичный штамм A (H5N2) гетерологичный штамм А (H1N1)
среднее арифметиче- ское диапазон среднее арифметиче- ское диапазон гомологичный штамм (H5N1) гетерологичный штамм (H1N1)
Д21/Д0 1,24 0,38—2,22 1,13 0,26—2,46 2 (20%) 1 (10%)
ЖГВ 10 Д42/Д0 1,77 0,41—3,89 1,35 0,38—3,81 4 (40%) 3 (30%)
Д63/Д0 3,56 0,30—12,09 2,49 0,09—8,51 6 (60%) 5 (50%)
CD8+
Д21/Д0 1,05 0,77—1,37 1,01 0,67—1,53 0 0
Плацебо 9 Д42/Д0 1,12 0,83—1,59 1,04 0,43—2,00 0 0
Д63/Д0 1,05 0,64—1,39 1,12 0,24—3,12 0 0
Д21/Д0 1,04 0,70—1,65 1,15 0,17—4,25 1 (10%) 1 (10%)
ЖГВ 10 Д42/Д0 1,51 0,86—2,70 1,59 0,25—5,80 3 (30%) 2 (20%)
Д63/Д0 2,60 0,84—6,35 1,71 0,08—3,75 6 (60%) 4 (40%)
CD4+ Д21/Д0 1,06 0,40—1,53 0,98 0,36—2,10 0 0
Плацебо 9 Д42/Д0 1,07 0,66—1,44 0,90 0,44—1,53 0 0
Д63/Д0 1,03 0,64—1,52 0,76 0,18—1,24 0 0
Примечание.* - — здесь и в табл. 2: Д0 — до вакцинации; Д21 — через 21 день после первой вакцинации; Д42 — через 21 день после
второй вакцинации; Д63 — через 42 дня после второй вакцинации; ** ния в группе плацебо на 3 стандартных отклонения и более.
достоверными считали увеличения, превышающие средние значе-
Таблица 2
Иммунные ответы на прививку жГВ типа A (H5N2) у лиц без фиксированной достоверной конверсии антител в РТГА
Наличие (+) или отсутствие (-) достоверной конверсии изученных факторов иммунитета
№ волонтера сывороточные антитела локальные IgA-антитела Т-клетки памяти кумулятивные данные по всем тестам* сывороточные антитела локальные IgA-антитела Т-клетки памяти кумулятивные данные по всем тестам* сывороточные антитела локальные IgA-антитела Т-клетки памяти кумулятивные данные по всем тестам*
£ Н Он К S Рч о ад е S К п И о слюна + 00 О О + Q О £ Н Он К S Рч % S К п И о слюна + 00 О О + Q О £ Н Он к Рч % S К п И о слюна + 00 О О + Q О
через 21 день после первой прививки (Д21/Д0) через 21 день после второй прививки (Д42/Д0) через 42 дня после второй прививки (Д63/Д0)
2 - + - - - - - + - + - - + - - + - + - + + + + +
9 - + - - - - - + - + - - - + - + - + - - - - - +
12 - - - - - - - - - - + - - + + + - - + - - + + +
14 + + - - - - + - + + - - + + +
16 - - - + - + - + - - - - + - + + - - - - + - - +
Примечание. * — наличие достоверной конверсии в одном тесте или более в обозначенных временных интервалах; СВДП — секреты верхних дыхательных путей.
вирусспецифической Т-клеточной памяти значительно расширяли информацию о поствакцинальной иммунологической перестройке организма.
Обсуждение
В последние годы особое внимание уделяется изучению вопроса о способности гриппозных вакцин стимулировать вирусспецифические клетки иммунологической памяти, которые играют определяющую роль в пролонгированной защите от гриппа [18, 19]. В недавнем документе ВОЗ (2009), касающемся производства и контроля ЖГВ, рекомендовано оценивать эти препараты не только в РТГА, но и по определению у людей антител в верхнем отделе дыхательного тракта, а также клеточных факторов иммунитета по продукции вирусспецифических Т-клеток памяти [13]. Настоящая работа выполнена в соответствии с этими рекомендациями.
Мы попытались ответить на два главных вопроса: 1) индуцируется ли вирусспецифическая Т-клеточная иммунологическая память в ответ на прививку ЖГВ типа A(H5N2) непраймированных людей, которые ранее с этим птичьим вирусом не контактировали; 2) как сведения о конверсиях антител, определяемых в регламентированном тесте, т. е. в РТГА [3], сочетаются с изменениями уровня других типов антител и вирусспецифических Т-клеток памяти фенотипов CD8+ и CD4+.
Нами показано, что двукратная иммунизация испытуемой ЖГВ стимулировала накопление у волонтеров циркулирующих в крови CD8+ и CD4+ Т-клеток памяти (см. табл. 1). Правомерность отнесения этих лимфоцитов к популяции клеток иммунологической памяти объясняется тем, что после элиминации антигена из организма более 90% эффекторных Т-клеток погибает вследствие апоптоза, а оставшаяся небольшая часть этих лимфоцитов трансформируется в клетки памяти
40
[19]. Вакцинные вирусы, входящие в состав ЖГВ, исчезают из организма людей не позже чем на 10-й день после прививки, а чаще всего это происходит до 7-го дня [1]. В нашем случае уровни клеток определяли минимум через 21 день после иммунизации.
Полученные результаты несколько отличаются от данных испытания американской сезонной ЖГВ FluMist [8]. В этой работе отмечено четко выраженное увеличение среднего уровня специфических к вакцинному вирусу гриппа A(H3N2) циркулирующих ИФН-y+CD8+- и ИФН-y+CD4+-клеток памяти у детей 5—9 лет, но не у взрослых. Авторы объясняют данный феномен более высокими уровнями выявляемых клеток перед вакцинацией у взрослых по сравнению с детьми. Это совершенно логично, поскольку взрослые гораздо больше контактировали с давно циркулирующим возбудителем типа A(H3N2). В нашем случае взрослые ранее не имели контактов с птичьим вирусом гриппа A(H5N2). Вероятно, поэтому индукция у них вирусспецифических Т-клеток памяти была выражена лучше. Как и в настоящей работе, американские авторы отметили существование обратной зависимости между фоновыми уровнями вирусспецифических CD8+ и CD4+ Т-клеток перед прививкой и кратностью их увеличения после введения ЖГВ [9]. Иными словами, успешность противогриппозной вакцинации и сезонной, и пандемической вакциной типа A(H5N2) с точки зрения индукции такого важного фактора противогриппозного иммунитета, как Т-клеточная память, во многом зависела от ее фонового предвакцинального уровня: чем он ниже, тем выше поствакцинальная продукция этих клеток. По-видимому, у большей части людей иммунизация ЖГВ на фоне высокого уровня Т-клеток памяти не приводит к какому-либо их значимому увеличению, т. е. с этой позиции вакцинация оказывается бесполезной.
При анализе данных о состоянии в предвакцинальный период Т-клеточной иммунологической памяти обращает на себя внимание, во-первых, сам факт наличия специфических к птичьему вирусу гриппа А (H5N2) CD4+- и CD8+- клеток памяти у людей, которые не контактировали с этим возбудителем, и во-вторых, — существенная гетерогенность данных лиц по этому показателю (см. табл. 1). Аналогичный феномен отмечен другими исследователями, обнаружившими у невакцинированных людей такие же клетки, специфичные к птичьему вирусу гриппа A(H5N1) [12, 15]. Авторы показали, что в подавляющем большинстве данные лимфоциты проявляли специфичность к консервативным структурам вируса гриппа А, т. е. к матриксному белку, нуклеопротеиду и кросс-реактивным эпитопам гемаг-глютинина. Показано также, что у людей заболевание гриппом сезонных вариантов A(H3N2) и A(H1N1) стимулировало образование кросс-реактивной популяции Т-клеток памяти к птичьему вирусу гриппа A(H5N1) [12]. По нашим данным прививка вакциной типа A(H5N2) вызывала продукцию Т-клеток, специфических к циркулирующему вирусу гриппа A(H1N1) (см. табл. 1).
Bce это в совокупности дает основание предположить, что контакты взрослых людей с любым вирусом типа А могут приводить к стимуляции гетерологичной Т-клеточной иммунологической памяти к другим вирусам этого типа, несмотря на их антигенную формулу. Это может происходить за счет формирования перекрестно реагирующих клеток памяти, специфических к консервативным структурам вириона. Учитывая накопившиеся в последние годы данные о стимуляции различными сероподтипами вируса гриппа гетерологичной иммунологической памяти, можно поставить под сомнение правомерность высказываний о «неиммунно-
сти» взрослых людей к новым реально или потенциально пандемическим вариантам этого вируса, основанной только на отсутствии или низком уровне у них циркулирующих антигемагглютинирующих антител.
Нами показано значительное расхождение данных оценки иммуногенности ЖГВ типа A(H5N2) в РТГА, с одной стороны, и характеристики продукции вирусспецифических CD8+- и CD4+- клеток иммунологической памяти — с другой (см. табл. 2). Важно, что у всех лиц, не ответивших конверсией антител в РТГА, зафиксировано достоверное увеличение изученных субпопуляций клеток памяти. Это свидетельствует о том, что регламентированная на сегодняшний день оценка иммуно-генности ЖГВ только по числу конверсий сывороточных антигемагглютинирующих антител в РТГА дает далеко не полное представление о поствакцинальном иммунном ответе организма в целом, и о стимуляции такого важного протективного фактора иммунитета, как Т-клеточная иммунологическая память в частности.
В совокупности полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:
— двукратная интраназальная иммунизация ЖГВ типа A(H5N2) «наивных» по отношению к этому возбудителю взрослых людей индуцирует у них клеточный иммунный ответ в виде продукции циркулирующих вирусспецифических CD8+- и CD4+-клеток памяти;
— количественные показатели поствакцинального накопления этих клеток зависят от их предвакцинального уровня (обратная зависимость);
— часть взрослых людей не является абсолютно неиммунной в отношении птичьего вируса гриппа A(H5N2), поскольку у них обнаруживаются перекрестно реагирующие Т-клетки иммунологической памяти, специфические к этому возбудителю; индивидуальные показатели концентрации (в %) таких клеток значительно варьируют;
— иммунизация ЖГВ типа A(H5N2) стимулирует накопление Т-клеток иммунологической памяти, специфических не только к этому возбудителю, но к циркулирующему вирусу гриппа A(H1N1);
— по отношению к традиционным данным оценки иммуногенности ЖГВ типа A(H5N2) по конверсиям антител в РТГА (регламентированный метод) дополнительные сведения об индукции вирусспецифических Т-клеток памяти значительно расширяют представление о поствакцинальном иммунном ответе и формировании иммунной защиты.
ЛИТЕРАТУРА
1. Александрова Г. И., Климов А. И. Живая вакцина против гриппа. — Спб., 1994.
2. Найхин А. Н., Донина С. А., Кустикова Ю. Г. и др. Моноклональная иммуноферментная тест-система для оценки секреторного иммунитета к вирусам гриппа А и В // Вопр. вирусол. — 1997. — № 5. — С. 212—219.
3. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42-0504-4097-04 на вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую.
4. Current protocols in immunology / Eds J. E. Coligan et al. — 2004.
5. Desheva J. A., Lu X. H., Rekstin A. R. et al. Characterization of an influenza A H5N2 reassortant as a candidate for live-attenuated and inactivated vaccines against highly pathogenic H5N1 viruses with pandemic potential // Vaccine. — 2006. — Vol. 24. — P. 6859—6866.
6. Girard M., Palkonyay L., Kieny M. P. Report of the 4th meeting on the evaluation of pandemic influenza prototype vaccines in clinical trials // Vaccine. — 2008. — Vol. 26. — P. 4975— 4977.
7. Hayden F. G., Howard W. A., Palkonyay L., Kieny M. P. Report of the 5th meeting on the evaluation of pandemic influenza prototype vaccines in clinical trials: World Health Organization, Geneva, Switzerland, 12—13 February 2009 // Vaccine. —
41
2009. — Vol. 27. — P. 4079—4089.
8. He X. S., Holmes Т. Н., Zhang C. et al. Cellular immune responses in children and adults receiving inactivated or live attenuated influenza vaccines // J. Virol. — 2006. — Vol. 80, N 23. — P. 11 756—11 766.
9. He X. S., Holmes Т. Н., Sasaki S. et al. Baseline levels of influenza-specific CD4 memory T-cells affect T-cell responses to influenza vaccines // PLoS One. — 2008. — Vol. 3, N 7. — P. 2574.
10. Joly E., Hudrisier D. What is trogocytosis and what is its purpose? // Nat. Immunol. — 2003. — Vol. 4, N 9. — P. 815.
11. Kendal A. P., Pereire M. S., Skehel J. Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. — Atlanta, 1982. — P. В17—B35.
12. Lee L. Y., Ha do L. A., Simmons C. et al. Memory T cells established by seasonal human influenza A infection cross-react with avian influenza A(H5N1) in healthy individuals // J. Clin. Invest. — 2008 — Vol. 118, № 10. — P. 3478—3490.
13. Proposed WHO recommendations for the production and control of influenza vaccines (human, live attenuated). Available from http://www.who.int/vaccine_research/diseases/influenza/ Draft_WHO_recs_LAI V_2627_Feb09.pdf.
14. Romanova J., Krenn B. M., WolschekM. et al. Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNSl H5N1 influ-
enza vaccine // PLoS One. — 2009. — Vol. 4. — P. 5984.
15. Roti M., Yang J., Berger D. et al. Healthy human subjects have CD4+ T cells directed against H5N1 influenza virus // J. Immunol. — 2008. — Vol. 180, N 3. — P. 1758—1768.
16. Rowe Т., Abernathly R. A., Hu-Primmer J. et al. Detection of antibody to avian influenza A(H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays // J. Clin. Microbiol. — 1999. — Vol. 37, N 4. — P. 937—943.
17. Rudenko L., Desheva J., Korovkin S. et al. Safety and immu-nogenicity of live attenuated influenza reassortant H5 vaccine (phase I—II clinical trials) // Influenza Other Respi Viruses. — 2008 — Vol. 2 — P. 203—209.
18. Swain. S. L., Agrewala J. N., Brown D. M. et al. CD4+ T-cell memory: generation and multi-faceted roles for CD4+ T cells in protective immunity to influenza // Immunol. Rev. — 2006. — Vol. 211. — P. 8—22.
19. Welsh R. M., Selin L. K., Szomolanyi-Tsuda E. Immunological memory to viral infections // Annu. Rev. Immunol. — 2004. — Vol. 22. — P. 711—743.
20. World Health Organization. Epidemiology of WHO-confirmed human cases of avian influenza A(H5N1) infection // Wkly Epidemiol. Rec. — 2006. — Vol. 81, — P. 249—257.
Поступила 15.04.10
В ПОМОЩЬ ВИРУСОЛОГУ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.921.5-079.4:575.08
С. А. Лободанов1, А. А. Никонова1, Е. Б. Файзулоев2, С. В. Трушакова2, Ю. И. Забияка1, М. А. Калинкина2,
В. Т. Иванова2, Е. С. Шевченко2, В. В. Зверев, Е. И. Бурцева2
Оценка эффективности дифференциальной диагностики гриппа методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени
'НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН; 2ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России; 'Инновационно-технологический центр «Биологически активные соединения и их применение» РАН, Москва
Представлены результаты сравнительного анализа выявления вирусов гриппа в клинических образцах методом мультиплексной пЦр с детекцией в режиме реального времени (ПцР-РВ) и методом изоляция вирусов в культуре клеток MDCK. В работе исследовали 267 образцов носоглоточных смывов от больных с симптомами гриппа, полученных в течение двух эпидемических сезонов (2008-2009 и 2009-2010 гг.). Вирусы гриппа были выявлены методом мультиплексной ПЦР-РВ в 104 образцах (в 48 - ВГА и 56 - ВГВ), культуральным методом - в 84 образцах (в 35 - ВГА и 49 - ВГВ). Результаты обнаружения вирусов гриппа двумя методами совпали на 89,4%. На основании испытаний метода мультиплексной ПЦР-РВ на панели охарактеризованных клинических образцов была сделана оценка диагностической чувствительности выявления ВГА - 94,3% и ВГВ - 95,9%. Показано, что мультиплексная ПЦР-РВ не только не уступает в диагностической чувствительности методу выделения вирусов в культуре клеток, но в определенных условиях превосходит его.
Ключевые слова: мультиплексная ПЦР в режиме реального времени, ОРВИ и грипп, лабораторная диагностика
Evaluation of the efficiency of differential diagnosis of influenza by multiplex real-time polymerase chain reaction
S. A. Lobodanov1, A. A. Nikonova1, E. B. Faizuloyev1, S. V. Trushakova2, Yu. I. Zabiaka1, M. A. Kalinkina3, V. T. Ivanova2, E. S. Shevchenko2, V. V. Zverev1, E. I. Burtseva2
1I. I. Mechnikov Research Institute of Vaccine and Sera, Russian Academy of Medical Sciences; 2D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia; '“Biologically Active Compounds and Their Application” Center of Innovations and Technologies, Russian Academy of Sciences, Moscow
The paper gives the results of a comparative analysis of the detection of influenza viruses in clinical samples, by using multiplex real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and by virus isolation in MDCK cell cultures. The investigation employed 267 nasopharyngeal swab specimens obtained from patients with influenza symptoms during two epidemic seasons (2008-2009 and 2009-2010). influenza viruses were found in 104 samples (48 with
Контактная информация:
Лободанов Сергей Александрович, мл. науч. сотр.; e-mail: lobodanov@yahoo.com
42
