CC BY
106
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.31-022:616.314-089.28
Автандилов А.Г.1, Воронов И.А.1, Лебеденко И.Ю.1, Диденко Л.В.2, Смирнова Т.А.2, Шевлягина Н.В.2
стафилококки в ротовой полости и их роль в биодеструкции съемных неметаллических протезов
1Кафедра комплексного зубопротезирования ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова», 127206, Москва; 2ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва
Сравнительный анализ структуры поверхности различных материалов показал, что наиболее устойчивыми к биодеструкции, вызываемой стафилококками, являются «Фторакс» и силикон. Устойчивость материала к биодеструкции определяется химическим составом материала. «Фторакс» содержит фтор, дающий антибактериальный эффект. Распределение фтора в этом материале неравномерное. В тех участках поверхности, где регистрируется наличие фтора, не происходит адгезии микроорганизмов и соответственно ее разрушения. Силикон состоит из кремнийор-ганического соединения, и, по-видимому, его органические компоненты не разрушаются ферментами, кислотами или щелочами, продуцируемыми бактериями.
Ключевые слова: карбид кремния; биодеструкция; защитное покрытие.
Для цитирования: Российский стоматологический журнал. 2015; 19(1): 14-20.
Avtandilov A.G.1, Voronov I.A.1, Lebedenko I.Yu.1, Didenko L.V.2, Smirnova T.A.2, Shevlyagina N.V.2
STAPHYLOCOCCI IN THE ORAL CAVITY AND THEIR ROLE IN THE BIODEGRADATION REMOVABLE NON-METALLIC PROSTHESEIS
'Department of integrated prothetic dentistry A.I. Evdokimov Moscow state medical dental University, 127206, Moscow;
2N.F. Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology Ministry of Health of Russia, 123098, Moscow
Comparative analysis of the structure of the surface of different materials showed that the most resistant to biodegradation caused by staphylococci, is "Ftoraks and silicone. The material's resistance to biodegradation is determined by the chemical composition of the material, "Ftoraks contains fluorine, the element which has an antibacterial effect. As shown previously, the distribution of fluorine in this material is uneven. In those parts of the surface, where is recorded the presence of fluoride, there is no adhesion ofmicroorganisms and therefore its destruction (10). Silicone is composed of the organosilicon compounds, and, apparently, those organic components included in it, are not destroyed by enzymes, acids or alkalis produced by bacteria. Keywords: silicon carbide; biodegradability; protective coating.
Citation: Rossiyskiy stomatologicheskiy zhurnal. 2015; 19(1): 14-20.
Введение
До недавнего времени стафилококки не считались резидентным компонентом микрофлоры ротовой полости. Однако в результате ретроспективного анализа образцов посевов за трехлетний период, проведенного A.J. Smith и соавт. [1], было показано, что распространенность Staphylococcus aureus в ротовой полости значительно выше, чем считалось ранее. Рядом авторов был сделан вывод о том, что данный микроорганизм относится к аутохтонным (постоянным, основным) видам микрофлоры полости рта здоровых людей-бактерионосителей, а полость рта является резервуаром стафилококков [2]. При определенных условиях S. aureus вызывает локальные и системные заболевания у ослабленных и пожилых больных. В этом случае S. aureus становится основным и наиболее опасным возбудителем многих гнойно-воспалительных заболеваний, в том числе ротовой полости. В слюне, слизи и крови ротовой полости могут содержаться стафилококки, в том числе метицилинрезистентные. Показано, что при одонтогенных воспалительных заболеваниях стафилококки высеваются в 15% случаев. При определенных условиях возможна колонизация зубной бляшки респираторными патогенами - возбудителями госпитальной пневмонии. S. aureus обнаруживали у 45% обследованных больных [3]. S. epidermidis и другие виды стафилококков, по данным ряда авторов, также рассматриваются как потенциально патоген-
Для корреспонденции: Воронов Игорь Анатольевич, voronov77@ mail.ru
For correspondence: Voronov Igor Anatolievich, [email protected]
ные микроорганизмы в ротовой полости, которые успешно колонизируют различные протезы [4].
Стафилококки способны как формировать собственные биопленки, так и действовать в качестве инициаторов биопленочного процесса у других микробов [5, 6]. Полисахаридный матрикс биопленки состоит из полимерного ацетилглюкоза-мина PNAG, включающего экзополисахаридный внеклеточный адгезин (PIA). PIA локализован на поверхности бактериальной клетки, и в случае его отсутствия стафилококки не способны формировать полноценный экзоклеточный полимерный матрикс [7]. Есть также данные о PIA-независимой белковой пленке, образованной стафилококками, которые способны синтезировать белок Bap (биофильмассоциирован-ный протеин), благодаря которому повышается способность бактерий к адгезии. Стафилококковые биопленки, содержащие белок Bap, участвуют в реализации хронических инфекционных процессов [8].
Колонизация бактериями зуботехнических материалов, в том числе зубопротезных, образование на их поверхности биопленок являются важным аспектом в проблеме разрушения зубных протезов [9]. Надежность зубных протезов зависит от их устойчивости к биоповреждениям, вызываемым микроорганизмами-биодеструкторами.
Ранее с помощью сканирующей электронной микроскопии в эксперименте было показано, что стафилококки обладают мощным биодеструктивным потенциалом в отношении полиуретановых и полиметилметакрилатных пластмасс [10]. В связи с этим остаются актуальными дальнейшее изучение процессов разрушения зубных протезов при их эксплуатации и поиск новых материалов и их покрытий, устойчивых к биоразрушению.
Рис. 1. "Денталур", 24 ч инкубации: адгезированные стафилококки (а); 48 ч инкубации: образование микроколоний (б), 7 сут инкубации: увеличение биомассы стафилококков на поверхности (в), образование массивной биопленки (г). Здесь и на рис. 2-6: ув. 20 000.
Цель исследования - с помощью метода сканирующей электронной микроскопии провести сравнительный анализ взаимодействия S. aureus с поверхностью неметаллических компонентов съемных зубных протезов и оценить протектив-ные свойства покрытия карбидом кремния на них в отношении данного микроорганизма.
Материал и методы
В работе были использованы образцы пластмасс полиуретан «Денталур» (ОАО «НИИР», Россия), «Фторакс», «Бесцветная пластмасса» (АО «Стома», Украина), акриловый материал «Acry-Free», «Quattro Ti» (Италия), силикон «Molloplast-B» (Германия). Кроме того, были исследованы образцы «Фторакс» и силикона с покрытием карбидом кремния.
Все образцы пластмасс размером 1 см2 были проинкубированы с S. aureus (клиническим изолятом, выделенным из ротовой полости больного с парадонтитом, и референсным штаммом S. aureus ATTC 29213) в чашках Петри с жидкой питательной средой Luria-Bertani в течение 48 ч, 7 сут и 1,5 мес при 37оС в термостате.
Образцы «Фторакса» без покрытия карбидом кремния и с покрытием также инкубировали в течение 7 сут в питатель-
ном бульоне с внесением в него 1 мл слюны пациента, у которого предварительно был выявлен S. epidermidis.
После инкубации образцы были фиксированы в 10% растворе формалина, высушены при комнатной температуре и помещены на специальные алюминиевые столики с помощью карбонового скотча. Далее образцы были ныпылены слоем золота толщиной 5 нм и исследованы в двулучевом сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 3D («FEI Company», США) при ускоряющих напряжениях 5 и 10 кВ в режимах низкого и высокого вакуума.
Результаты и обсуждение
Через 48 ч после инкубации с референсным штаммом S. aureus ATTC 29213 на поверхности всех изученных пластмасс, включая «Фторакс» и силикон с покрытием карбидом кремния, были обнаружены адгезированные одиночно лежащие стафилококки и сформированные ими микроколонии. Максимальное скопление бактерий наблюдалось по периферии образцов и в области механических повреждений (царапин, сколов, углублений на поверхности) (рис. 1).
С увеличением срока инкубации количество бактерий на поверхности всех изученных образцов увеличивалось. К 7-м суткам инкубации наиболее выраженная многослойная
Рис. 2. Инкубация 7 сут. Образование биопленок на поверхности пластмасс: "Денталур" (а); "Бесцветная пластмасса" (б); "Quattro Ti" (в); "Acry-Free" (г).
Видны дефекты поверхности f.
с отчетливым экзополиматриксом биопленка формировалась на поверхности «Денталура», «Бесцветной пластмассы», «Quattro Ti» и «Acry-Free», в то время как на поверхности «Фторакса» и силикона выявлялись участки с одиночными адгезированными бактериями и микроколониями (рис. 2, 3).
На поверхности образцов базисных пластмасс («Денталур», «Acry-Free», силикон, «Фторакс», «Бесцветная пластмасса») с покрытием карбидом кремния после инкубации со стафилококком существенно уменьшалось количество адге-зированных бактерий, микроколоний и биопленок по сравнению с необработанными материалами (рис. 4).
В то же время обработанные карбидом кремния образцы пластмассы «Quattro Ti» после инкубации со стафилококком в течение 7 сут интенсивно колонизировались стафилококком. Бактерии образовывали биопленку и разрушали поверхность материала (рис. 5).
Дефекты поверхности пластмасс в областях сформированной биопленки выявлялись на поверхности «Денталура», «Бесцветной пластмассы» и в отдельных участках на поверхности «Фторакса», а также на поверхности «Quattro Ti» без покрытия карбидом кремния и с покрытием (см. рис. 2, 5). Дефектов поверхности силикона без покрытия, силикона и «Фторакса» с покрытием карбидом кремния выявлено не было.
Следует отметить, что когда покрытие карбидом кремния было неравномерным или имело дефекты прилежания
к пластмассе («Фторакс», силикон, «Acry-Free»), стафилококки колонизировали именно эти области и инициировали процесс разрушения на свободной от покрытия поверхности пластмассы (рис. 6).
В образцах, оинкубированных с клиническим изолятом S. aureus, наблюдалась картина, идентичная описанной для стафилококка референсного штамма. Следует отметить, что в этом случае интенсивность колонизации и образования биопленки на поверхности всех изученных пластмасс была более выраженной.
При электронно-микроскопическом исследовании препарата «Фторакс», инкубированного с совокупным микробио-мом полости рта пациента, у которого были обнаружены S. epidermidis, выявлено образование ярко выраженного налета, покрывающего всю поверхность образца. По структуре поверхность налета была идентична поверхности экзополиса-харидного матрикса, характерного для сформированных бактериальных биопленок. Только в отдельных участках можно было видеть контуры бактерий, которые также были покрыты слоем матрикса (рис. 7).
Чтобы визуализовать сами бактерии, слой матрикса был удален трехкратным промыванием 96о этанолом поверхности образца. После этой процедуры при повторном микро-скопировании было показано, что бактерии формировали смешанные биопленки, по морфологическим характеристи-
Рис. 3. Инкубация 7 сут. Адгезированные стафилококки на поверхности "Фторакс" (а), силикон (б).
Рис. 4. Инкубация со стафилококком в течение 7 сут: биопленка | на поверхности "Денталура" с покрытием карбидом кремния (а). Единичные адгезированные бактерии | на поверхностях с покрытием карбидом кремния: "Асгу-Ргее" (б), силикон (в), "Фторакс" (г).
Рис. 5. "Quattro Ti" с покрытием карбидом кремния после инкубации со стафилококком в течение 7 сут. Дефекты поверхности f.
кам относившиеся к 4 разным группам: коккам размером от 400 до 600 нм, стрептококкам от 600 нм до 1 мкм, крупным округлым микроорганизмам от 1 до 2 мкм и палочковидным бактериям 500-600 нм. В области биопленок происходило формирование дефектов поверхности «Фторакса» без покрытия (рис. 8).
Заключение
Золотистые стафилококки способны колонизировать поверхность неметаллических (полимерных) материалов, используемых для изготовления съемных зубных протезов. Этапы взаимодействия с поверхностью искусственных материалов можно представить следующим образом: образуется налет (безмикробный) одновременно с адгезией к поверхности отдельных бактериальных клеток, после адгезии бактерии делятся и образуют микроколонии, которые с увеличением срока инкубации увеличиваются в размерах и покрываются слоем экзоклеточного матрикса, т. е. формируют биопленку. При образовании биопленки на поверхности изученных материалов появляются дефекты в виде трещин, регистрируется слущивание частиц с поверхности и крошко-видный материал [9, 10].
Рис. 6. Колонизация стафилококком в области дефекта поверхности материалов с покрытием карбидом кремния: "Acry-Free" (а) и "Quattro Ti" (б).
Рис. 7. 7 сут инкубации: образование бактериального налета на поверхности пластмасс "Фторакс" без покрытия карбидом кремния: обзор. Ув. 55 (а), фрагмент поверхности пластмассы, обведены участки биообрастания (б). Ув. 4000.
Рис. 8. Поверхность "Фторакса" без покрытия, 7 сут инкубации: биопленка (а, б) - щелевидный дефект пластмассы под биопленкой | (в). Адгезированные бактерии и микроколонии: кокков (г), стрептококков (д), грибов (е).
По нашим данным, клинические изоляты S. aureus и S. epidermidis по сравнению с референсным штаммом S. aureus ATTC 29213 более интенсивно колонизируют поверхности полимерных пластмасс и силикона. Возможной причиной этого, вероятно, является экспрессия белков-адгезинов и экзополисахаридного внеклеточного адгезина PIA клиническими изолятами стафилококка, поскольку для указанных штаммов, обитающих в условиях агрессивной для них среды (организм человека), наличие этих факторов обеспечивает выживание популяции. Клинический изолят S. epidermidis успешно колонизирует поверхность «Фторакса» совместно с другими микроорганизмами - обитателями ротовой полости.
Сравнительный анализ структуры поверхности различных материалов показал, что наиболее устойчивыми к биодеструкции, вызываемой стафилококками, являются «Фторакс» и силикон. Устойчивость материала к биодеструкции определяется химическим составом материала; «Фторакс» содержит фтор, дающий антибактериальный эффект. Как было показано ранее, распределение фтора в этом материале неравномерное. В тех участках поверхности, где регистрируется наличие фтора, не происходит адгезии микроорганизмов и соответственно ее разрушения [9]. Силикон состоит из крем-нийорганического соединения, и, по-видимому, его органические компоненты не разрушаются ферментами, кислотами или щелочами, продуцируемыми бактериями.
Полиуретан и полиметилметакрилатные (акрилы) смолы подвергаются стафилококковой биодеструкции, поскольку эфирные связи между мономерами у этих полимерных материалов могут расщепляться эстеразами, продуцируемыми стафилококком, кроме того, выделяемые в процессе жизнедеятельности бактериями кислоты реализуют процесс кислотного гидролиза тех же эфирных связей в полимерах [11].
Учитывая это обстоятельство, можно считать актуальной разработку специальных антибиодеструктивных покрытий полимерных пластмасс [12]. В данном исследовании были использованы покрытия на основе карбида кремния. Несмотря на то что стафилококки успешно адгезируются к поверхности покрытия и формируют микроколонии, ярко выраженной биопленки на их поверхности не образуется, что, вероятно, связано с тем, что бактерии не могут извлечь из материала необходимый для синтеза экзоклеточного матрикса углерод. Соответственно не происходит и разрушения поверхности с покрытием карбидом кремния, поскольку биодеструктивный потенциал стафилококков в данном случае не реализуется.
В целях улучшения качества покрытия карбидом кремния полимерных пластмасс необходимо строгое соблюдение технологии его нанесения, предусматривающей равномерность его распределения по поверхности и отсутствие каких-либо дефектов между покрытием и материалом пластмасс или силикона.
ЛИТЕРАТУРА
1. Smith A.J., Robertson D., Tang M.K., Jackson M.S., Mac Kensis D., Bagg J. Staphylococcus aureusinthe in the oral cavity: a three-year retrospective analysis of clinical laboratory data. Br. Dent. J. 2003; 195 (12): 701-3.
2. Smith A.J., Jackson M.S., Bagg J. The ecology of Staphylococcus species in the oral cavity. J. Mol. Microbiol. 2001; 50: 940-6.
3. El-Soth A.A., Pietrantoni C., Bhat A., Okada M., Zambon J., Aquilina A., Berbary E. Colonization of dental plaque: a reservoir of respiratory pathogen for hospital- acquired pneumonia in institutionalized elder. Chest. 2004; 126(5): 1575-82; Med.. Microbiol. 2008; 57(1): 95-9.
4. Ohara-Nemoto Y., Haraga H., Kimura S., Nemoto T.K. Occurrence of Staphylococci in the oral cavities of healthy adults and nasal oral trafficking of the bacteria. J. Biol. Chem. 2001; 382(7): 1095-9.
5. Gotz F. Staphylococcus and biofilms. Mol. Microbiol. 2002; 43: 1367-78.
6. Маянский А.Н., Чеботарь И.В. Стафилококковые биопленки: структура, регуляция, отторжение. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011; 1: 101-8.
7. Vuong С., Voyich J.M., Fischer E.R., Braughton K.R., Whitney A.R., DeLeo F.R., Otto M. Polysaccharide intercellular adhesin (PIA) protects Staphylococcus epidermidis against major components of the human innate immune system. Cell Microbiol. 2004; 6(3): 269-75.
8. Latasa С., Solano С., Penades J.R., Lasa I. Biofilm-associated protein. C.R. Soc. Biol. 2006; 329: 849-57.
9. Автандилов Г.А. Биодеструкция зубных протезов из полимерных материалов (экспериментальное исследование): Дисс. ... канд. мед. наук. 2013.
10. Автандилов Г.А. Ультраструктурное исследование процесса взаимодействия Staphylococcus aureus с полиуретаном. Dental forum. 2011; 3: 11-2.
11. Didenko L.V., Avtandilov G.A., Shevlyagina N.V., Smirnova T.A., Lebedenko I.Y., Tatti F. et al. Biodestruction of polyurethane by Staphylococcus aureus (an investigation by SEM, TEM and FIB). Curr. Microscopy Contrib. Adv. Sci. Technol. Microscopy Ser. 2012; 1(5): 323-34.
12. Воронов И.А., Митрофанова Е.А., Калинин А.Л., Семакин С.Б., Диденко Л.В., Автандилов Г.А. Разработка нового покрытия из карбида кремния для защиты зубных протезов от биодеструкции. Российский стоматологический журнал. 2014; 1: 4-9.
Поступила 06.11.14
REFERENCES
1. Smith A.J., Robertson D., Tang M.K., Jackson M.S., MacKensis D., Bagg J. Staphylococcus aureusinthe in the oral cavity: a three-year retrospective analysis of clinical laboratory data. Br. Dent. J. 2003; 195 (12): 701-3.
2. Smith A.J., Jackson M.S., Bagg J. The ecology of Staphylococcus species in the oral cavity. J. Mol. Microbiol. 2001; 50: 940-6.
3. El-Soth A.A., Pietrantoni C., Bhat A., Okada M., Zambon J., Aquilina A., Berbary E.. Colonization of dental plaque: a reservoir of respiratory pathogen for hospital- acquired pneumonia in institutionalized elder. Chest. 2004; 126(5): 1575-82; Med.. Microbiol. 2008; 57(1): 95-9.
4. Ohara-Nemoto Y., Haraga H., Kimura S., Nemoto T.K. Occurrence of staphylococci in the oral cavities of healthy adults and nasal oral trafficking of the bacteria. J. Biol. Chem. 2001; 382(7): 1095-9.
5. Gotz F. Staphylococcus and biofilms. Mol. Microbiol. 2002; 43: 1367-78.
6. Mayanskiy A.N., Chebotar' I.V. Staphylococcal biofilms: structure, regulation, rejection. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immu-nobiologii. 2011; 1: 101-8. (in Russian)
7. Vuong C., Voyich J.M., Fischer E.R., Braughton K.R., Whitney A.R., DeLeo F.R., Otto M. Polysaccharide intercellular adhesin (PIA) protects Staphylococcus epidermidis against major components of the human innate immune system. Cell Microbiol. 2004; 6(3): 269-75.
8. Latasa C., Solano C., Penades J.R., Lasa I. Biofilm-associated protein. C.R. Soc. Biol. 2006; 329: 849-57.
9. Avtandilov G.A. Biodegradation of Dental Prostheses Made of Polymeric Materials (ExperimentalStudy): Diss. 2013. (in Russian)
10. Avtandilov G.A. Ultrastructural study of the process of interaction of Staphylococcus aureus with polyurethane. Dental forum. 2011; 3: 11-2. (in Russian)
11. Didenko L.V., Avtandilov G.A., Shevlyagina N.V., Smirnova T.A., Lebedenko I.Y., Tatti F. et al. Biodestruction of polyurethane by Staphylococcus aureus (an investigation by SEM, TEM and FIB). Curr. Microscopy Contrib. Adv. Sci. Technol. Microscopy Ser. 2012; 1(5): 323-34.
12. Voronov I.A., Mitrofanov E.A., Kalinin A.L., Semakin S.B., Didenko L.V., Avtandilov G.A. Development of a new coating of silicone carbide to protect the dentures from biodegradation. Rossiyskiy stom-atologicheskiy zhurnal. 2014; 1: 4-9. (in Russian)
Received 06.11.14
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.314.17-002-08:615.46
Асташина Н.Б.1, Анциферов В.Н.2, Седегова О.Н.1, Логинова Н.П.1, Каченюк М.Н.2
оценка основных характеристик углеродного волокнд и перспективы его применения на этапах лечения пациентов с генерализованным пародонтитом
ТБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера» Минздрава России, 614000, г. Пермь; 2ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет», 614600, г. Пермь
Интенсивное развитие материаловедения в стоматологии обусловлено синтезом и внедрением наиболее безопасных материалов, применение которых позволяет повысить эффективность лечения пациентов с патологией зубочелюст-ной системы. В качестве конструкционного материала для шинирования зубов возможно применение углеродного волокна, обладающего высокой прочностью и стойкостью к усталостным нагружениям. Для оценки возможности использования композиционного углеродного волокна в качестве шинирующей конструкции экспериментально изучены физико-механические и биологические свойства углеродного волокна. Результаты экспериментов показали, что композиционное углеродное волокно обладает высокими пластическими свойствами и при имплантации волокна выраженных патоморфологических изменений в органах экспериментальных животных не выявлено. В результате проведенных исследований подтверждена биологическая совместимость углеродного волокна, что позволяет использовать данный материал в практической стоматологии.
Ключевые слова: биологически совместимые материалы; углеродное волокно; материалы для шинирования зубов; генерализованный пародонтит.
Для цитирования: Российский стоматологический журнал. 2015; 19(1): 20-24.
Для корреспонденции: Асташина Наталия Борисовна, [email protected] For correspondence: AstashinaNataliyaBorisovna, [email protected]
