CC BY
185
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ОБЗОРЫ
Стадия исследования и перспективы использования стволовых клеток в лечении сахарного диабета
Л. Сяофан1, В. Юйфан2, Л. Яли2, П. Сютао2
^Отделение акушерства и гинекологии, Клиника общего профиля Р1А, Пекин, Китай
2Лаборатория стволовых клеток и регенеративной медицины, Пекинский институт трансфузионной медицины, Военно-медицинская академия, Пекин, Китай
При сахарном диабете происходит снижение массы и функции р-клеток. Наиболее перспективными методами лечения пациентов с сахарным диабетом могут быть: замещение клеток островков Лангерганса и проведение регенеративной терапии. Результаты недавно проведенных исследований, посвященных изучению процессов регенерации функциональных инсулин-продуцирующих клеток, показали, что помимо первичных р-клеток поджелудочной железы суще-
ствуют альтернативные клеточные источники, способные генерировать инсулин-продуцирующие клетки посредством дифференцировки, перепрограммирования и трансдифференцировки. К ним относятся: эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и стволовые клетки взрослых. В настоящем обзоре речь идет о стволовых клетках - потенциальном альтернативном пути лечения сахарного диабета.
Ключевые слова:
клеточная терапия, сахарный диабет, стволовые клетки, инсулин-продуцирущие клетки
Research status and prospect of stem cells in the treatment of diabetes mellitus
A. V. Timofeev L. XiaoFang1, W. YunFang2, L. YaLi2, P. XueTao2
department of Obstetrics and Gynecology, General Hospital of PLA, Beijing, China 2Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Transfusion Medicine, Academy of
Military Medical Sciences, Beijing, China
Beta-cell mass and function are decreased to varying degrees in diabetes. Islet cell replacement or regenerative therapy may offer great therapeutic promise to people with diabetes. In addition to primary pancreatic p cells, recent studies on regeneration of functional insulin producing cells (IPCs) revealed that several alternative cell sources, including embryonic stem cells,
induced pluripotent stem cells and adult stem cells, can generate IPCs by differentiation, reprogramming, and trans-differentiation. In this review, we discuss stem cells as a potential alternative cell source for the treatment of diabetes.
Science China Life Sciences. - 2013. - Vol. 56. -P. 306-312.
Key words:
cell therapy, diabetes, stem cells, insulin producing cells
При сахарном диабете (СД) наблюдается нарушение метаболизма глюкозы (обусловленное сниженной секрецией инсулина либо дисфункцией поджелудочной железы), которое характеризуется повышенной концентрацией глюкозы в крови. В настоящее время в мире насчитывается приблизительно 346 млн взрослых людей, страдающих СД. Ожидается, что к 2030 г. количество пациентов с СД достигнет 4 млрд [1]. На основании этиологии можно выделить 3 типа СД:
1. Сахарный диабет типа 1 (СД1) - аутоиммунное эндокринное заболевание, центральное место в развитии которого занимают Т-клетки. Считается, что основным патогенетическим звеном СД1 является дисфункция иммунной системы, кроме того, для данного типа диабета характерна высокая генетическая предрасположенность. В ходе воздействия факторов окружающей среды на людей из группы риска Т-клетки начинают функционировать иначе, секретируя большое количество интерлейкина-2. Цито-
кины, такие как 8-интерферон, запускают воспалительную реакцию в островках поджелудочной железы, что приводит к повреждению р-клеток, последующей дисфункции органа и сниженной секреции инсулина [2]. В итоге развивается сахарный диабет типа 2 (СД2) [2].
2. В основе СД2 лежат такие состояния, как гиперин-сулинемия и инсулинорезистентность. В норме инсулин снижает концентрацию глюкозы в крови посредством активации инсулинзависимого сигнального пути в мышцах, печени и жировой ткани. Но у пациентов с СД2 чувствительность к инсулину в периферических тканях снижается. Постоянное повышение концентрации глюкозы в крови и стимуляция р-клеток вызывает их повреждение, что, в свою очередь, приводит к серьезным нарушениям функции Р-клеток и снижению секреции инсулина. В число факторов риска развития инсулинорезистентности и СД2 входят генетическая предрасположенность, ожирение, неправильный образ жизни. Молекулярные механизмы этиопатогенеза до сих пор не ясны [3]. Несмотря на то что патогенез СД1 и СД2 отличается, оба заболевания проявляются сходными проявлениями, в число которых входят нарушение толерантности к глюкозе, гипергликемия, гиперлипидемия, а также сопутствующие осложнения со стороны различных групп органов.
3. Гестационный сахарный диабет - это особый тип СД. В период беременности развивается физиологическая инсулинорезистентность, повышается уровень секреции гормонов, обладающих контринсулярными эффектами, что повышает потребность организма в инсулине. Максимальная выраженность такого рода изменений наблюдается во II триместре беременности. В связи со снижением секреции инсулина при недостаточности естественных компенсаторных механизмов у беременных женщин может развиться гиперинсулинемия либо гипергликемия. После рождения ребенка концентрация глюкозы в крови матери возвращается к нормальному уровню. Гестационный СД оказывает неблагоприятное влияние на здоровье матери и ребенка, повышая показатели внутриутробной и неона-тальной смертности.
Несмотря на значительный прогресс в терапии СД, пациентам с СД1 и СД2 по-прежнему требуется пожизненное введение экзогенного инсулина, что связано с повышенным риском развития инфекционного процесса, кетоацидоза, гипогликемии, хронических осложнений, патологии сетчатки, нарушения работы почек, а также патологии со стороны сердечно-сосудистой и цереброваскулярной систем [4]. Попытки создания эндогенной системы секреции инсулина посредством трансплантации поджелудочной железы и ее островков достигли значительного прогресса [5, 6], однако большой дефицит донорских органов препятствует широкому развитию этих методов лечения, поэтому разработка методов трансплантации стволовых клеток может стать идеальным выбором для терапии СД1.
Стволовые клетки обладают выраженной способностью к самообновлению и дифференцировке. Теоретически плюрипотентные стволовые клетки способны дифференцироваться в клетки любых типов тканей тела, поэтому они являются идеальным клеточным материалом как для регене-
ративной медицины, так и для тканевой инженерии. Было установлено, что стволовые клетки способны заменить стареющие, поврежденные либо погибшие клетки в органах взрослого человека. В связи с этим их все шире применяют при лечении терминальной стадии патологий, резистентных к проведению стандартной терапии (инфаркт миокарда, тяжелые ожоги, дегенеративные заболевания нервной системы и т.д.). В настоящей статье представлен обзор последних данных научных исследований, проведенных в области применения инсулин-продуцирующих клеток, полученных из стволовых клеток, при лечении СД.
Статус исследования о назначении заместительной терапии стволовыми клетками при сахарном диабете
С момента открытия и выделения инсулина в 1920 г. заместительная терапия экзогенным инсулином стала основным методом контроля концентрации глюкозы в плазме крови. В основе СД лежит утрата специфической клеточной функции. Теоретически в качестве заместительной клеточной терапии можно использовать трансплантацию поджелудочной железы с целью компенсации утраченной функции р-клеток. С 1966 по 2008 г. в общей сложности было выполнено более 30 000 трансплантаций поджелудочной железы [7]. Поскольку трансплантация поджелудочной железы представляет сложное оперативное вмешательство, которое может сопровождаться различными послеоперационными осложнениями, исследователи изучили возможность трансплантации островков поджелудочной железы и подтвердили повышение уровня сывороточного C-пептида после трансплантации. Трансплантация островков Лангерганса представляет минимальное инва-зивное вмешательство. В протоколе Edmonton 2000 7 пациентов не нуждались в инсулинотерапии в среднем в течение 11,9 мес [8]. Несмотря на то что трансплантация поджелудочной железы и ее островков позволяет достичь положительных терапевтических эффектов, по-прежнему сохраняется проблема дефицита донорских органов.
Трансплантация поджелудочной железы и ее островков не является традиционным методом лечения СД. При этом успешная трансплантация р-клеток стала прорывом в терапии стволовыми клетками. Благодаря способности к самообновлению и дифференцировке в различные типы клеток стволовые клетки обладают преимуществом при проведении заместительной клеточной терапии и играют уникальную роль в онтогенетике и других научных областях. Терапия стволовыми клетками с точки зрения терапии СД обладает следующими преимуществами: не имеет ограничений, связанных с поиском донора, может обеспечить длительным источником функциональных р-клеток. Клетки островков Лангерганса, полученные из стволовых клеток, позволяют избежать реакции отторжения трансплантата и тем самым снизить необходимость в иммуносупрессивной терапии. Кроме того, эти клетки способны секретировать различные цитокины, улучшая микроокружение в очагах повреждения поджелудочной железы, улучшая прогноз. В число стволовых клеток, применяемых для замещения р-клеток, входят
стволовые клетки поджелудочной железы, стволовые клетки печени, мезенхимальные стволовые клетки (MSCs), эмбриональные стволовые клетки (ESCs), а также индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs).
Стволовые клетки поджелудочной железы
Островки поджелудочной железы содержат функциональные клетки 4 типов: глюкагон-секретирующие a-клетки, инсулин-секретирующие р-клетки, соматостатин-секретирующие 8-клетки и PP-клетки. Стимуляция пролиферации уже имеющихся р-клеток является самым простым и удобным источником новых р-клеток. В ходе постнаталь-ного развития выраженная пролиферация р-клеток наблюдается при таких физиологических изменениях, как беременность и ожирение, что подтверждает способность этих клеток к самообновлению. Результаты исследований продемонстрировали, что после резекции 90% поджелудочной железы у взрослых крыс панкреатические ткани и р-клетки начинают активно пролиферировать [9]. Однако пока неясно, являются ли новые р-клетки результатом пролиферации уже имеющихся р-клеток или они появляются в результате дифференцирования панкреатических стволовых клеток.
Wang и соавт. [10] установили, что перевязка протоков поджелудочной железы у крыс приводит к образованию большого количества новых островков Лангерганса, которые состоят преимущественно из р-подобных клеток. Это говорит о том, что образование новых р-клеток нельзя объяснить только пролиферацией уже имеющихся р-клеток. Исследователи предположили, что новые р-клетки происходят от стволовых клеток, которые, возможно, образовались в результате дифференцировки и пролиферации клеток протоков поджелудочной железы. Xu и соавт. [11] после перевязки протока поджелудочной железы обнаружили нейрогенин-3 (NGN3) -положительные клетки. В подходящих условиях эти клетки могли дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки in vitro. Inada и соавт. [12] поддержали теорию о том, что проток поджелудочной железы, ее ацинусы и островки развиваются из эпителиальных клеток протока поджелудочной железы в постнатальном периоде. Так или иначе в настоящее время отсутствует единая точка зрения о том, является ли эпителий протока поджелудочной железы источником р-клеток. Furayama и соавт. [13] выполнили несколько экспериментов in vivo с целью стимуляции регенеративных процессов в поджелудочной железе и в результате применения метода отслеживания клеточных поколений не выявили наличия р-клеток, дифференцировавшихся из клеток - предшественников поджелудочной железы. Было высказано предположение о том, что в ходе эмбрионального развития эндокринные клетки образуются из эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы и отделяются от клеток-предшественников, экспрессирующих бокс гена 9, кодирующий белки группы высокой подвижности, связанные с геном половой детерминации SRY. Что касается Р-клеток, их число поддерживается посредством самообновления уже имеющихся р-клеток. Разумеется, методы отслеживания клеточных поколений, применяемые в настоящее
время, имеют ограничения. Из-за достаточно низкой эффективности метода большинство клеток протокового эпителия не получают метки в виде радиоактивного изотопа, поэтому в настоящее время по-прежнему неясно, присутствуют ли среди протокового эпителия предшественники ß-клеток.
В островках поджелудочной железы человека и крыс учеными были обнаружены плюрипотентные клетки, способные дифференцироваться в различные типы эндокринных клеток поджелудочной железы. Тем не менее Bonner и соавт. [14] предположили, что рост и обновление ß-клеток с высокой степенью вероятности не связаны со клетками-предшественниками, осуществляясь за счет медленной репликации зрелых ß-клеток. Brennand и соавт. [15] подтвердили, что ß-клетки представляют гомогенные клетки, способные поддерживать собственное число путем медленной репликации. Таким образом, стимуляция пролиферации ß-клеток, возможно, является наилучшим способом получения их достаточного количества для проведения клеточной терапии. Было установлено, что большое количество таких факторов, как белок - переносчик глюкозы-1 и рецепторы к кортиколиберину 1-го типа стимулируют пролиферацию ß-клеток [16], однако конкретные механизмы до сих пор неясны. Детальный анализ механизма самообновления ß-клеток имеет большое значение для получения новых ß-клеток из уже имеющихся клеток данного типа. Однако в настоящее время по-прежнему довольно сложно получить достаточное количество новых ß-клеток из уже имеющихся. В то же время отсутствует единое мнение относительно источников стволовых клеток поджелудочной железы. Simon и соавт. [17] при помощи методов отслеживания клеточных поколений и сортировки клеток выделили из протоков поджелудочной железы и тканей островков поджелудочной железы трансгенных мышей изолированные клетки с панкреатическим дуоденальным гомеобоксом (PDX1) +/инсулин+/изоформой переносчика глюкозы 2-. Эти клетки образовывали сферы и размножались путем образования клонов in vitro, а также демонстрировали способность дифференцироваться в различные типы клеток поджелудочной железы. Трансплантация этой клеточной популяции приводила к устранению симптомов СД у мышей, обработанных стрептозоцином (STZ). Таким образом, авторы определили эту группу клеток, как клетки - предшественники поджелудочной железы.
Альтернативными источниками ß-клеток являются клетки экзокринных желез - основной тип клеток поджелудочной железы. PDX1 - это специфический фактор транскрипции панкреатических клеток-предшественников, являющийся геном со спонтанной индукцией и самоактивацией экспрессии. Так же как и эндокринные клетки, экзокринные клетки происходят от PDXl-положительных клеток-предшественников, и в подходящих условиях можно индуцировать образование клеток, обладающих фенотипи-ческими характеристиками клеток эндокринной секреции [18]. В 2008 г. Zhou [19] использовал 3 фактора транскрипции (PDX1, NGN3 и активирующий макрофаги фактор A) для трансформации экзокринных панкреатических клеток в ß-подобные клетки. Несмотря на то что полученные клетки сильно отличались от эндогенных ß-клеток разме-
рами, формой и ультраструктурой, они могли секретировать инсулин, снижая выраженность симптомов гипергликемии.
Эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
Ранние исследования ESCs из этических соображений были сфокусированы главным образом на ESCs мышей. В процессе дифференцировки in vitro можно получить небольшое количество клеток поджелудочной железы (1-3%) [20]. В то же время, несмотря на возможность получения эндокринных клеток поджелудочной железы в результате дифференцировки in vitro, точно проконтролировать весь процесс дифференцировки либо определить происхождение инсулина, содержащегося в клетках (результат синтеза либо захвата из индукционной среды) невозможно [21]. Считается, что поддержание функции Р-клеток зависит от микроокружения островков поджелудочной железы, в частности от взаимодействия между Р-, а- и 8-клетками. Kahan и соавт. [22] установили, что оптимальным процесс дифференцирования ESCs мышей является только в присутствии островковых клеток; авторы особо подчеркнули значение микроокружения для процесса дифференцировки [23]. Исходя из этого исследователи трансплантировали панкреатические эндокринные клетки-предшественники, полученные из ESC, с целью наблюдения их созревания и терапевтических эффектов.
Broten и соавт. [21] использовали ESCs человека для получения панкреатических клеток-предшественников. Результаты исследований подтвердили, что клетки, экспрес-сирующие PDX1, являются панкреатическими клетками-предшественниками; но, несмотря на это, они не способны секретировать инсулин и не дают ответной реакции на изменение концентрации глюкозы. При этом после пересадки мышам они продолжали дифференцироваться и созревать, приобретая способность к синтезу и процессингу инсулина. Вместе с результатами, полученными Kahan, данные этого исследования продемонстрировали, что ESCs человека могут реагировать на сигналы, поступающие извне и дифференцироваться в эндокринные клетки островков поджелудочной железы. Эти результаты доказали взаимосвязь между микроокружением in vivo в исследованиях на клетках мышей и человека, что позволяет предположить существование защитного механизма развития островков Лангерганса как у людей, так и у мышей.
Результаты исследования D'Amour и соавт. [23] составляют важный раздел изучения инсулин-продуцирующих клеток, полученных из ESCs человека. Впервые они дифференцировали ESCs в инсулин-продуцирующие клетки в 5 этапов: дефинитивная энтодерма, передняя кишка, задняя кишка, энтодерма поджелудочной железы, эндокринные клетки. Этапы протокола дифференцировки основаны на онтогене-тике поджелудочной железы. Содержание инсулина в клетках сходно с таковым в клетках островков Лангерганса плода человека. При стимуляции калия хлоридом и другими стимуляторами секреции эти клетки могут секретировать инсулин, не реагируя на стимуляцию глюкозой. При этом секреция
инсулина при стимуляции глюкозой является важным индикатором зрелости р-клеток. Неонатальные островки Лангерганса начинают нормально функционировать примерно через 4 нед после рождения ребенка. Это указывает на то, что эндокринные клетки, полученные D'Amour, находились все еще на стадии клеток незрелого островка Лангерганса. В связи с тем, что в настоящее время механизм созревания функционального островка поджелудочной железы in vivo не выяснен, эффективный метод стимуляции созревания островков Лангерганса in vitro до сих пор найти не удалось. Для определения стадии созревания и терапевтических эффектов этих клеток [24] ESCs индуцировали до образования панкреатических клеток-предшественников, которые соответствовали панкреатической ткани 6-9-недельного плода, а затем трансплантировали мышам для дальнейшего созревания. Спустя 40 дней после трансплантации клетки стимулировали глюкозой, в результате чего у мышей-реципиентов было выявлено высвобождение C-пептида. Это позволяет предположить, что в организме мыши произошел de novo синтез инсулина человека. Но более важно то, что эти клетки были способны корректировать STZ-индуцированную гипергликемию у мышей. После использования специально подобранного протокола индукции результаты исследований показали, что инсулин-секретирующие клетки островков поджелудочной железы, полученные in vitro и затем трансплантированные in vivo, способны продолжить процесс созревания и достичь нормального уровня функционирования р-клеток. После исследования D'Amour ученые стали уделять больше внимания вопросу повышения эффективности метода дифференцировки ESC в панкреатические клетки-предшественники. Chen и соавт. [25] обнаружили, что небольшая молекула индолактам V может стимулировать дифференцировку ESCs человека в PDXl-положительные клетки как in vitro, так и in vivo, что может дать начало новому методу получения большого количества р-клеток из ESC.
Помимо ESCs, применение iPSCs можно рассматривать в качестве перспективного метода терапии СД. Bar-Nur [26] дифференцировал iPSCs, полученные из р-клеток, в инсулин-продуцирующие клетки. Эти клетки после стимуляции глюкозой могли секретировать инсулин. Они были трансплантированы мышам с СД2 с целью нормализации уровня гликированного гемоглобина и коррекции повышенной концентрации глюкозы. Результаты исследования представляют доказательную базу для клинического применения iPSCs при лечении СД1/СД2. В настоящее время наиболее распространена стратегия индукции iPSC, при которой используются вирусы, интегрирующиеся в геном клеток. Однако в результате спонтанной реактивации вирусных трансгенов высок риск образования опухоли. Со временем качество исследований повышалось и уровень безопасности применения iPSCs стал намного выше, а число областей возможного клинического применения вирусов значительно увеличился. Stadtfetd [27] разработал метод получения iPSCs при помощи аденовируса. Данный метод предусматривал кратковременную выраженную экспрессию экзогенных генов в клетках без их интеграции в геном, что обеспечивало безопасность клинического применения iPSCs. Еще один метод получения iPSCs включает добав-
ление соответствующих факторов роста в среду культивирования сперматогониальных стволовых клеток с целью их перепрограммирования в iPSCs, способные дифференцироваться в клетки всех 3 зародышевых листков [28]. Так как в процессе конверсии экзогенные гены не применялись, интеграция экзогенных генов и связанные с ней риски не описаны. В 2010 г. на ежегодной конференции Американской ассоциации по изучению биологии клетки было установлено, что iPSCs, полученные из сперматогониальных стволовых клеток, можно индуцировать до образования Р-подобных клеток, способных реагировать на физиологические значения концентрации глюкозы in vitro и снижать уровень глюкозы в крови у мышей с СД in vivo.
Несмотря на обнадеживающие результаты, эти исследования по-прежнему находятся на начальной стадии использования ESCs и iPSCs при лечении СД. Процесс дифференцирования панкреатических эндокринных клеток и механизм созревания активных островков Лангерганса по-прежнему неясны. Кроме того, в современных исследованиях отсутствуют данные о долговременной эффективности и безопасности применения ESCs и iPSCs при лечении СД. Это указывает на необходимость выполнения большого количества научно-исследовательских работ, прежде чем станет возможно проведение клинических исследований на людях.
Мезенхимальные стволовые клетки
Красный костный мозг содержит 2 типа стволовых клеток - гемопоэтические (HSCs) и мезенхимальные (MSCs). Исследователям удалось успешно дифференцировать оба эти вида стволовых клеток в различные типы клеток, что предполагает наличие у этих стволовых клеток мультипотентных свойств. Учитывая, что стволовые клетки костного мозга легко получить в клинических условиях, изучение клеток костного мозга стало одним из основных направлений в исследовании клеточной терапии СД [29].
На сегодняшний день были получены следующие результаты исследований, проведенных с применением стволовых клеток костного мозга в ходе лечении СД [30]. Введение MSCs в периферическую вену способно ингибировать ауто-реактивные T-клетки и снижать выраженность аутоиммунной реакции при СД1. Urban и соавт. [31] продемонстрировали, что иммуномодулирующий эффект MSCs - один из механизмов, способствующих регенерации р-клеток. Исследователи вводили смесь HSCs и MSCs в костный мозг мышей, поврежденный стрептозоцином (STZ)/ионизирующим излучением. Это позволило успешно нормализовать повышенный уровень глюкозы в крови у мышей. Следует отметить, что, кроме всего прочего, исследователи обнаружили у MSCs способность ингибировать пролиферацию T-клеток, специфических в отношении панкреатических р-клеток. Это позволяло уменьшить выраженность повреждения новых р-клеток (T-клетками) и в определенной степени активизировать регенерацию р-клеток. Данный метод в сочетании с трансплантацией островков Лангерганса позволяет имплантату избежать иммунологического надзора и повысить частоту выживаемости имплантата. Было установлено, что MSCs подавляют процессы ауто- и аллоиммунизации. Ding и соавт.
[32] воспользовались преимуществами данного свойства при трансплантации MSCs костного мозга и аллогенных островков Лангерганса. Данный метод позволил продлить период выживаемости трансплантированных островков поджелудочной железы и поддерживать нормальный уровень глюкозы в крови на протяжении длительного периода времени. Было высказано предположение о том, что MSCs играют определенную роль в ускользании от механизмов иммунологического надзора и повышают показатели выживаемости трансплантированных островков Лангер-ганса посредством синтеза и секреции матричной металло-протеиназы 2-го и 9-го типов во внеклеточный матрикс. MSCs костного мозга также были дифференцированы в инсулин-продуцирующие клетки с целью проведения заместительной клеточной терапии. В ранних исследованиях научный поиск был сконцентрирован на потенциальной способности к дифференцированию стволовых клеток костного мозга, которую можно было использовать для достижения терапевтических эффектов. Было установлено, что MSCs костного мозга могут дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки in vitro и in vivo, а также корректировать повышенную концентрацию глюкозы в крови у мышей с СД [33, 34]. Однако такая способность MSCs дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки подвергалась сомнению, поскольку дифференцированные клетки костного мозга составляли лишь небольшой процент трансплантированных клеток [35]. Кроме того, важен тот факт, что снижение концентрации глюкозы в плазме крови и повышение уровня инсулина наблюдалось до появления инсулин-продуцирующих клеток, происходящих из MSC. Таким образом, успех применения MSCs костного мозга при лечении СД, вероятно, достигается не в результате прямой дифференцировки MSCs костного мозга в р-клетки, а посредством эндокринных либо пара-кринных механизмов, положительно влияющих на уже имеющиеся р-клетки, стимулируя их пролиферацию, секрецию инсулина и обеспечивая эффективный контроль концентрации глюкозы в крови.
Эти исследования in vivo раскрывают потенциал стволовых клеток костного мозга с точки зрения стимуляции регенерации р-клеток в поврежденной ткани поджелудочной железы. Кроме того, они открывают большие перспективы при выявлении механизмов, лежащих в основе эффектов, получаемых от стволовых клеток костного мозга. Доскональному исследованию поддаются далеко не все механизмы. Тем не менее можно сделать вывод о том, что стволовые клетки костного мозга могут стимулировать регенерацию поврежденных р-клеток поджелудочной железы, а также стать альтернативным источником р-клеток после индукции. Доподлинно известно, что стволовые клетки костного мозга оказывают терапевтические эффекты при СД и идеальны для проведения будущей клеточной терапии и лечения СД.
Стволовые клетки печени
Поскольку в ходе онтогенеза печень и поджелудочная железа происходят из эндодермы и обладают общими клетками-предшественниками, было высказано предположение о том, что клетки печени можно использовать
в качестве альтернативного источника ß-клеток [36]. Экзогенные PDX1 и NGN3 были экспрессированы в печень мыши посредством аденовирусной трансдукции, что, в свою очередь, индуцировало экспрессию эндокринных и экзокринных генов в клетках печени. Трансдифферен-цированные клетки были способны выживать в печени на протяжении длительного периода. Вокруг центральных вен печени образовались новые кластеры панкреатической ткани, где происходило высвобождение инсулина; при этом кластеры не нарушали нормальное функционирование печени. Что более важно, печеночная ткань, секре-тирующая инсулин, корректировала STZ-опосредованную гипергликемию и поддерживала нормальную концентрацию глюкозы в крови на протяжении 8-месячного периода [37, 38]. В то же время Yang [39] обнаружили, что в некоторых случаях PDXl-перепрограммированная печеночная ткань способна образовывать только панкреатические ß-клетки-предшественники, которые далее дифференцируют в функциональные инсулин-продуцирующие клетки in vitro либо in vivo только при условии повышенной концентрации глюкозы. На сегодняшний день не получено доказательств того, что модифицированные почечные клетки могут пролиферировать in vitro. Кроме того, нет доказательств, что можно получить достаточное количество функциональных клеток для трансплантационной терапии.
Тем не менее исследования этих тканей печени по-прежнему достаточно перспективны и не вызывают разногласий, подобно работам со стволовыми клетками поджелудочной железы. Благодаря простому способу их забора посредством биопсии и выраженной способности к регенерации ткани печени стали идеальным источником клеток для проведения трансдифференцировки. В будущем потребуется разработать эффективный метод размножения трансдифференцированных печеночных клеток in vitro. Также требует дополнительного изучения вопрос безопасности применения трансдифференцированной печеночной ткани, индуцированной в организме человека.
Проблемы и перспективы клеточной терапии сахарного диабета
Результаты многих исследовании подтвердили, что стволовые клетки могут позволить пациентам с СД поддерживать нормальную концентрацию глюкозы в крови в течение нескольких лет независимо от введения инсулина. Тем не менее существует множество проблем, связанных с применением стволовых клеток в клинической практике лечения СД. Во-первых, это источник клеток. Каждому реципиенту требуется около 100 000 панкреатических островков для трансплантации; кроме того, in vitro должно быть приготовлено большое количество альтернативных клеток. Несмотря на то что несколько исследовательских коллек-
тивов использовали различные методы для дифференци-ровки стволовых клеток в р-подобные клетки, при их клиническом применении эти клетки были далеки от соответствия функциональным требованиям в связи с относительно низкой эффективностью дифференцировки в целевые клетки. И поэтому исходя из перспектив проведения дальнейших исследований по развитию и дифференцировке островков поджелудочной железы необходимо разработать достаточно эффективный метод стимуляции дифференцировки стволовых клеток в функциональные р-клетки для массовой продукции клеток, подлежащих трансплантации. Во-вторых, терапия стволовыми клетками связана с рядом побочных эффектов, которые нельзя не принимать во внимание. Kroon и соавт. [24] продемонстрировали, что вероятность развития тератом или других тканевых компонентов после трансплантации мышам клеток поджелудочной железы, полученных из ESC человека, превышает 15%. Результаты других исследований показали, что пролиферация MSCs in vitro повышает риск развития опухолевой ткани и метастазов [40, 41]. До начала применения клеточной терапии в клинических исследованиях следует тщательно оценить и учесть все эти проблемные моменты и принять необходимые меры, позволяющие снизить существующие риски. Кроме того, терапия стволовыми клетками связана с проблемой отторжения трансплантата [42]. После терапии аллогенными клетками пациент должен пройти иммуносупрессивное лечение. Однако иммунодепрессанты могут способствовать развитию инсулинорезистентности и подавлению секреции инсулина, что создает дополнительные препятствия для имплантации клеток с целью поддержания адекватного уровня глюкозы в крови. Кроме того, иммунодепрессанты повышают риск развития злокачественных новообразований, хотя данный эффект был установлен только при трансплантации почек. Что касается терапии СД1, после трансплантации альтернативного варианта аутологичных клеток высок риск их повреждения аутоантителами, поэтому необходимо найти способ защиты таких клеток. При лечении СД2 клетки необходимо тщательно исследовать, поскольку дисфункция р-клеток, как правило, тесно связана с генетическими отклонениями или изменениями. При трансплантации р-подобных клеток, полученных у пациентов с СД2, контроль концентрации глюкозы в крови может отсутствовать в течение длительного периода времени.
Применение любого нового метода лечения в клинической практике сопряжено с множеством проблем, но, несмотря на это, авторы данной статьи полагают, что заместительная клеточная терапия и регенеративная медицина в конечном итоге будут широко применяться в клинической практике, значимо повысят эффективность проводимого лечения и даже могут решить проблему излечения СД. Все это поможет существенно повысить уровень жизни населения и уменьшить количество жалоб больных с СД.
Краткий обзор методов клеточной терапии сахарного диабета
Ф
Тип Источник Стратегии индукции Место трансплантации и количество клеток In v GR vo R Преимущества Ограничения
ES клетки, например: CyT49, H8, H9 [24, 25] Собственная клеточная масса Поэтапная диффе-ренцировка, основанная на онтогенетике (2-7) х106 суб-капсулярное пространство почек; 1,5х106-1хю7 эпидидимальная жировая ткань Аа Неограниченная поставка Риск образования тератом, этические разногласия
iPS клетки [26, 43] Клетки кожи, Р-клетки островков поджелудочной железы; спермато-гониальные стволовые клетки Поэтапная диффе-ренцировка, основанная на онтогенетике (2-7) х106 суб-капсулярное пространство почек Аа Аутологичный источник; неограниченная поставка; отсутствие этических противоречий Эпигенетическая память
Стволовые клетки взрослых
Стволовые клетки печени [38, 44, 45] Овальные клетки печени; стволовые клетки желчных протоков; клеточные линии WB Аденовирусная трансфекция; поэтапная диффе-ренцировка (2-7) х106 суб-капсулярное пространство почек Аа Аутологичный источник; простой забор, эндодермаль-ное происхождение Затруднительно получить достаточную клеточную массу in vitro для использования в трансплантационной терапии; эпигенетическая память
Стволовые клетки поджелудочной железы [10, 17, 19] Панкреатические экзокринные клетки, клетки протоков и островков Лан-герганса PDXl+клетки, полученные методом FACS; аденовирусная трансфекция 350-500 РМР сфер, субкапсуляр-ное пространство почек Аа Аутологичный источник Проблемы пролиферации
МЭСб костного мозга [33-35] Костный мозг, жировая ткань, пупочный канатик, надкостница и т.д. Поэтапная диф-ференцировка; дифференцировка in vivo 4,2х107 хвостовая вена; 2х106 суб-капсулярное пространство почек и селезеночная вена Аа Простой забор; стимуляция васкуля-ризации, индукция регенерации пан-креатическихIPC в поджелудочной железе; иммуно-протективный эффект Риск злокачественной трансформации in vitro; риск образования опухоли после трансплантации; трудности прямой дифференцировки
Ф
Примечание. GRIR - глюкозочувствительное высвобождение инсулина; ES-клетки - эмбриональные стволовые клетки; MSCs-клетки - мезенхимальные стволовые клетки; iPS-клетки - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.
СВЕДЕНИЯ О ВЕДУШЕМ АВТОРЕ
Яли Ли (Yali Li) - доктор медицины отделения акушерства и гинекологии Клиники общего профиля PLA, Пекин, Китай E-mail: [email protected]
ЛИТЕРАТУРА
1. Scully T. Diabetes in numbers // Nature. - 2012. -Vol. 485. - P. S2-S3.
2. van Belle T.L., Coppieters K.T., von Herrath M.G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies // Physiol. Rev. - 2011. - Vol. 91. - P. 79-118.
3. Luan B., Zhao J., Wu H. et al. Deficiency of a beta-arrestin-2 signal complex contributes to insulin resistance // Nature. - 2009. - Vol. 457. - P. 1146-1149.
4. Nathan D.M., Cleary P.A., Backlund J.Y. et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes // N. Engl. J. Med. - 2005. - Vol. 353. -P. 2643-2653.
5. Berney T., Johnson P.R. Donor pancreata: evolving approaches to organ allocation for whole pancreas versus islet transplantation // Transplantation. - 2010. - Vol. 90. -P. 238-243.
6. Fridell J.A., Rogers J., Stratta R.J. The pancreas allograft donor: current status, controversies, and challenges for the future // Clin. Transplant. - 2010. - Vol. 24. - P. 433-449.
7. Vardanyan M., Parkin E., Gruessner C. et al. Pancreas vs. islet transplantation: a call on the future // Curr. Opin. Organ. Transplant. - 2010. - Vol. 15. - P. 124-130.
8. Shapiro A.M., Lakey J.R., Ryan E.A. et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen // N. Engl. J. Med. - 2000. - Vol. 343. - P. 230-238.
9. Bonner-Weir S., Baxter L.A., Schuppin G.T. et al. A second pathway for regeneration of adult exocrine and endocrine pancreas. A possible recapitulation of embryonic development // Diabetes. - 1993. - Vol. 42. - P. 1715-1720.
10. Wang R.N., Kloppel G., Bouwens L. Duct- to islet-cell differentiation and islet growth in the pancreas of duct-ligated adult rats // Diabetologia. - 1995. - Vol. 38. - P. 1405-1411.
11. Xu X., D'Hoker J., Stange G. et al. Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas // Cell. - 2008. - Vol. 132. - P. 197-207.
12. Inada A., Nienaber C., Katsuta H. et al. Carbonic anhydrase Il-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth // Proc. Natl Acad. Sci. USA. -2008. - Vol. 105. - P. 19915-19919.
13. Furuyama K., Kawaguchi Y., Akiyama H. et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine // Nat. Genet. - 2011. -Vol. 43. - P. 34-41.
14. Bonner-Weir S., Li W.C., Ouziel-Yahalom L. et al. Beta-cell growth and regeneration: replication is only part of the story // Diabetes. - 2010. - Vol. 59. - P. 2340-2348.
15. Brennand K., Huangfu D., Melton D. All beta cells contribute equally to islet growth and maintenance // PLoS Biol. - 2007. - Vol. 5. - P. e163.
16. Huising M.O., van der Meulen T., Vaughan J.M. et al. CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2010. -Vol. 107. - P. 912-917.
17. Smukler S.R., Arntfield M.E., Razavi R. et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin // Cell Stem. Cell. - 2011. - Vol. 8. -P. 281-293.
18. Baeyens L., De Breuck S., Lardon J. et al. In vitro generation of insulin-producing beta cells from adult exocrine pancreatic cells // Diabetologia. - 2005. - Vol. 48. - P. 49-57.
19. Zhou Q., Brown J., Kanarek A. et al. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells // Nature. -2008. - Vol. 455. - P. 627-632.
20. Mfopou J.K., Chen B., Sui L. et al. Recent advances and prospects in the differentiation of pancreatic cells from human embryonic stem cells // Diabetes. - 2010. - Vol. 59. - P. 20942101.
21. Brolen G.K., Heins N., Edsbagge J. et al. Signals from the embryonic mouse pancreas induce differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing beta-cell-like cells // Diabetes. - 2005. - Vol. 54. - P. 2867-2874.
22. Kahan B.W., Jacobson L.M., Hullett D.A. et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation // Diabetes. - 2003. - Vol. 52. - P. 20162024.
23. D'Amour K.A., Bang A.G., Eliazer S. et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells // Nat. Biotechnol. - 2006. - Vol. 24. -P. 1392-1401.
24. Kroon E., Martinson L.A., Kadoya K. et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates
glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo // Nat. Biotechnol. - 2008. - Vol. 26. - P. 443-452.
25. Chen S., Borowiak M. Fox J.L. et al. A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage // Nat. Chem. Biol. - 2009. - Vol. 5. - P. 258-265.
26. Bar-Nur O., Russ H.A., Efrat S. et al. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells // Cell Stem Cell. - 2011. - Vol. 9. - P. 17-23.
27. Stadtfeld M., Nagaya M., Utikal J. et al. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration // Science. - 2008. - Vol. 322. - P. 945-949.
28. Golestaneh N., Kokkinaki M., Pant D. et al. Pluripotent stem cells derived from adult human testes // Stem Cells Dev. -2009. - Vol. 18. - P. 1115-1126.
29. PileggiA. Mesenchymal stem cells for the treatment of diabetes // Diabetes. - 2012. - Vol. 61. - P. 1355-1356.
30. Moore R.F., Mounayar M., Abdi R. Utility of mesenchymal stem cell therapy in type 1 diabetes // Stem Cells and Cancer Stem Cells. - 2012. - Vol. 6. - P. 197-203.
31. Urban V.S., Kiss J., Kovacs J. et al. Mesenchymal stem cells cooperate with bone marrow cells in therapy of diabetes // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 244-253.
32. Ding Y., Xu D., Feng G. et al. Mesenchymal stem cells prevent the rejection of fully allogenic islet grafts by the immunosuppressive activity of matrix metalloproteinase-2 and -9 // Diabetes. - 2009. - Vol. 58. - P. 1797-1806.
33. Kim S.J., Choi Y.S., Ko E.S. et al. Glucose-stimulated insulin secretion of various mesenchymal stem cells after insulin-producing cell differentiation // J. Biosci. Bioeng. -2012. - Vol. 113. - P. 771-777.
34. Ho J.H., Tseng T.C., Ma W.H. et al. Multiple intravenous transplantations of mesenchymal stem cells effectively restore long-term blood glucose homeostasis by hepatic engraftment and beta-cell differentiation in streptozocin-induced diabetic mice // Cell Transplant. - 2012. - Vol. 21. - P. 997-1009.
35. Hess D., Li L., Martin M. et al. Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration // Nat. Biotechnol. -2003. - Vol. 21. - P. 763-770.
36. Zaret K.S., Grompe M. Generation and regeneration of cells of the liver and pancreas // Science. - 2008. - Vol. 322. -P. 1490-1494.
37. Ber I., Shternhall K., Perl S. et al. Functional, persistent, and extended liver to pancreas transdifferentiation // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. - P. 31950-31957.
38. Yechoor V., Liu V., Espiritu C. et al. Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes // Dev. Cell. - 2009. - Vol. 16. - P. 358-373.
39. Yang L.J. Liver stem cell-derived beta-cell surrogates for treatment of type 1 diabetes // Autoimmun. Rev. - 2006. -Vol. 5. - P. 409-413.
40. Tang D.Q., Wang Q., Burkhardt B.R. et al. In vitro generation of functional insulin-producing cells from human bone marrow-derived stem cells, but long-term culture running risk of malignant transformation // Am. J. Stem Cells. - 2012. -Vol. 1. - P. 114-127.
41. Vajdic C.M., van Leeuwen M.T. Cancer incidence and risk factors after solid organ transplantation // Int. J. Cancer. -2009. - Vol. 125. - P. 1747-1754.
42. Halban P.A., German M.S., Kahn S.E. et al. Current status of islet cell replacement and regeneration therapy // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2010. - Vol. 95. - P. 1034-1043.
43. Alipio Z., Liao W., Roemer E.J. et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-
pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2010. - Vol. 107. - P. 13426-13431.
44. Cardinale V., Wang Y., Carpino G. et al. The biliary tree - a reservoir of multipotent stem cells // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. - 2012. - Vol. 9. - P. 231-240.
Liu J., Liu Y., Wang H. et al. Direct differentiation of hepatic stemlike WB cells into insulin-producing cells using small molecules // Sci. Rep. - 2013. - Vol. 3. - P. 1185.
Ф
