Сравнительный мультилокусный vntrи snp-анализ вакцинных штаммов Bacillus anthracis Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

19. Talkington D, Bopp C., Tarr C. et al. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(11): 2122-29.

20. TenoverF.C., ArbeitR.D., GoeringR.V. et al. J. Clin. Microbiol. - 1995; 33(9): 2233-9.

21. The National Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance [Электронный ресурс]. URL:http//www.pulsenetinternational. org. (дата обращения: 15.12.2012).

23. van Belkum A., Tassios P. T., Dijkshoorn L. et al. J. Clin. Microbiol. Infect. 2007; 13 (Suppl. 3): 1-46.

Поступила 18.03.13

RETROSPECTIVE MACRORESTRICTIVE ANALYSIS OF THE VIBRIO CHOLERAE ELTOR STRAINS ISOLATED AT EPIDEMIC COMPLICATIONS IN THE FAR EAST OF RUSSIA

L. V. Mironova, M. V. Afanasev, E. A. Basov, L. Y. Urbanovich,

S. V. Balakhonov Irkutsk Antiplague Research Institute, Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Irkutsk, Russia

The retrospective study of the clonal structure of 24 Vibrio chol-erae eltor strains isolated at epidemic complications in the Far East of Russia was carried out on the basis of the macrorestrictive analysis of the genome DNA using NotI and Sfil endonucleases. It was found that clonal (by amplification profiling data) toxigenic strains (n = 23) were characterized by variability of NotI/ SfiI-generated restriction profiles. The V. cholerae eltor isolated in Yuzhno-Sakhalinsk outbreak were differentiated to four pulse-types with one dominating type detected in 76% of the strains. Individual restrictive NotI/SfiI-profile was characteristic for the isolates from Primorye Territory. A non-toxigenic strain formed a separate dendrogram line from the toxigenic strains on the basis of PFGE-pattern structure.

Efficiency of macrorestriction analysis application for the profound characteristic of the V. cholerae population structure and ascertainment of molecular-epidemiological regularities of territorial distribution of the separate V. cholerae clones was shown.

Key words: Vibrio cholerae, macrorestrictive analysis, PFGE, NotI endonuclease, Sfil endonuclease, molecular-epidemiological analysis

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.852.11:579.253].083.1:577.21.08

М.В. Афанасьев, Е.В. Кравец, З.Ф. Дугаржапова, В.Е. Такайшвили, В.С. Половинкина,

С.В. Балахонов

сравнительный мультилокусный vntr- и snp-анализ вакцинных штаммов bacillus anthracis

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Проведен сравнительный анализ VNTR- и SNP-генотипов четырех штаммов Bacillus anthracis, три из которых вакцинные, один — вирулентный. В процессе анализа установлено, что данные штаммы формировали четыре SNP-паттерна, полностью соотносящихся с VNTR-профилями. Обнаружено, что все исследуемые штаммы, кроме вакцинного B. anthracis СТИ-1, по SNP-профилю не могли быть отнесены к трем распространенным в мире глобальным генетическим линиям возбудителя сибирской язвы.

Ключевые слова: Bacillus anthracis; генотипирование; VNTR-анализ; SNP-анализ; эпидемиология сибирской язвы; сибиреязвенные вакцины

Сибирская язва относится к группе особо опасных инфекционных болезней, общих для человека и животных, с потенциальной возможностью использования возбудителя данного заболевания, Bacillus anthracis, для биотеррористических целей. Поэтому каждый случай заболевания людей и/или животных с подозрением на сибирскую язву требует особого внимания и эпидемиологического расследования, основанного на результатах лабораторного анализа. Лабораторное подтверждение диагноза сибирской язвы относится к ключевым факторам, определяющим необходимость проведения комплекса противоэпизоотических, противоэпидемических и профилактических мероприятий, направленных на выявление путей и факторов передачи инфекции, локализацию и ликвидацию очага сибиреязвенной инфекции, а также предотвращение дальнейшего распространения возбудителя [6].

При лабораторном исследовании штаммов B. anthracis в качестве дополнительного метода применяется молекулярно-генетическое MLVA-типирование, позволяющее установить принадлежность выделенных культур возбудителя к определенному генотипу. Сравнительный анализ генотипов исследуемых штаммов не только открывает

возможность выявления или подтверждения предполагаемого источника инфекции, путей и факторов передачи, но и дает возможность значительно расширить объективные данные о биологических особенностях конкретного изо-лята возбудителя. Большое значение имеет возможность дифференциации с помощью генотипирования вакцинных штаммов, применяемых в клинической практике и ветеринарии, от полевых, в том числе и атипичных, при исследовании материала с подозрением на контаминацию возбудителем сибирской язвы, в случаях сибиреязвенных эпизоотий, а также для исключения случаев внутрилабора-торной контаминации исследуемых образцов.

В связи с вышеизложенным в последние годы как у нас в стране, так и за рубежом растет число публикаций, посвященных различным аспектам генотипирования сибиреязвенного микроба [3—5, 7, 8, 11, 14], в том числе и вакцинных штаммов [5]. Однако в зарубежных работах встречается информация только об одном штамме российского происхождения — СТИ-1 [10]. Российские исследователи, изучившие генотипы 5 известных вакцинных штаммов [5], пришли к заключению, что использование данных о структуре VNTR-генотипов по 18 вариабельным локусам хромосомной локализации оказывается недостаточным для дифференциации вакцинных штаммов В. anthracis 55 ВНИИВВиМ и СТИ-1.

В представленной работе для расширенной молекулярно-генетической характеристики вакцинных штаммов с целью их идентификации и дифференциации нами был выполнен анализ вариабельности 15 VNTR-локусов [10, 15], а также изучены дополнительные генетические детерминанты и 12 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) [14], для детекции которых впервые был применен новый методический подход и разработана система оригинальных олигонуклеотидных зондов.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы

В работе использовали 4 штамма: 3 вакцинных (B. anthracis 34F2 Stem, B. anthracis 55 ВНИИВВиМ, B. anthracis СТИ-1) и вирулентный штамм B. anthracis И9 из коллекции Музея живых культур (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора).

Штамм B. anthracis 34F2 Stem выделен путем отбора бескап-сульных клонов на 50% сывороточном агаре в атмосфере СО2 (Южная Африка, 1937 г.) [13]. Штамм B. anthracis 55 ВНИИВ-ВиМ является производным аттенуированного бескапсульно-го сибиреязвенного штамма 55 (Россия, 1983 г.) [1]. Штамм B. anthracis СТИ-1 получен путем пассажа вирулентной культуры на чашках со свернутой нормальной лошадиной сывороткой (Россия, 1940 г) [2]. Штамм И9, изолированный от больного человека с кожной формой сибирской язвы (Россия, Республика Тыва, 1956 г.), был включен в исследование в качестве типового вирулентного штамма.

В настоящее время в России вакцинные штаммы B. anthracis 55 ВНИИВВиМ и B. anthracis СТИ-1 используются соответственно для иммунизации сельскохозяйственных животных и декретированных групп населения, а также для контроля качества питательных сред и диагностических препаратов в лабораториях особо опасных инфекций и противочумных учреждениях.

Идентификация штаммов

Идентификацию исследуемых штаммов проводили в соответствии с МУ 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы» с применением экспресс-методов: РТ-ПЦР (тест-система «Ампли-Сенс Bacillus anthracis-FRT», ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва) и МФА («Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические люминесцирующие сухие» (ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора, Ставрополь); «Иммуноглобулины диагностические флюоресцирующие сибиреязвенные неадсорбиро-ванные сухие» (ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ (филиал МедГАМАЛ, Москва), а также комплекса бактери-оскопических, бактериологических и биологических методов.

Выделение ДНК

Выделение ДНК из исследуемых культур выполняли после предварительного прорастания спор с пенициллином и лизиса гу-анидинизотиоцианатом, с последующим использованием набора для выделения ДНК («ДНК-сорб-В», ФГУН ЦНИИЭ Роспотреб-надзора, Москва) в соответствии с инструкцией производителя.

Анализ полиморфизма числа тандемных повторов

(VNTR-анализ)

Для анализа использовали 15 локусов тандемных повторов в геноме B. anthracis, описанных ранее [14]: vrrA, vrrB1, vrrB2, vrrC1, vrrC2, CG3, pX01aat, pX02at, VNTR12, VNTR16, VNTR17, VNTR19, VNTR23, VNTR32 и VNTR35. Наборы использованных праймеров и программа амплификации указаны в табл. 1. Один из праймеров в каждой паре метили по 5'-концу фосфо-рамидной флюоресцентной краской (FAM, TAMRA или ROX). ПЦР-реакцию проводили в амплификаторе ABI2720 («Applied Biosystems», США). Продукты реакции разводили в 100 раз в деионизированной воде. 10 мкл смеси, содержащей разведенный ПЦР-продукт, маркер молекулярной массы GeneScan™ 500 LIZ™ Size Standard (кат. № 4322682; «Applied Biosystems», США) и высокоочищенный деионизированный формамид (кат. № 4311320; «Applied Biosystems», США) в соотношении 1:0,5:8,5 вносили в 96-луночные плашки MicroAMP («Applied Biosystems», США). После денатурации продуктов реакционной смеси при 95°С в течение 2 мин плашки немедленно охлаждали во льду и использовали для дальнейшего анализа.

Размер полученных ампликонов определяли методом капиллярного электрофореза на ДНК-анализаторе ABI Prism® 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США; «Hitachi», Япония) путем сравнения с маркером молекулярной массы GeneScan™ 500 LIz™ Size Standard (кат. № 4322682; «Applied Biosystems», США).

Продукты амплификации локусов, ожидаемый размер которых превышал 500 п.о. (локусы vrrC1, vrrC2, BaVNTR32), анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле однократно в ТВЕ-буфере с последующей окраской бромистым этидием. Размер полученных фрагментов определяли путем сравнения фрагмента с маркером молекулярной массы ДНК — GeneRuler™ 100 bp DNA Ladders («Fermentas», Литва) с использованием программного пакета Quantity One v.4.4.0 («Bio-Rad», США).

Таким образом, для каждого штамма был получен 15-символьный цифровой паттерн, в котором каждая цифра соответствовала размеру ампликона (п.о.) и соотносилась с числом тандемных повторов в том или ином локусе.

Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP-

анализ)

Для анализа использовали 13 ранее описанных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP-локусов) [14], условно обозначенных как ABr001, ABr002, ABr003, ABr004, ABr006, ABr007, ABr008, ABr009, BBr001, BBr002, BBr003, BBr004 и ABBr001.

Набор праймеров, использованных для амплификации фрагментов генома, содержащих указанные выше полиморфизмы, и программа амплификации указаны в табл.1.

Детекцию однонуклеотидных полиморфизмов осуществляли при помощи набора SNaPshot Multiplex Kit (кат. № 4323159; «Applied Biosystems», США), в соответствии с инструкциями производителя. В основе метода лежит термоциклическая реакция элонгации специфического зонда определенной молекулярной массы, фланкирующего точку полиморфизма, на один дидезоксинуклеотид, в зависимости от нуклеотидного контекста в этой точке. Каждый из четырех дидезоксинуклеотидов, входящих в состав реакционной смеси, содержал в качестве метки соответствующий флюоресцентный краситель, что позволяло в процессе анализа продуктов реакции методом капиллярного электрофореза, исходя из известной массы зонда, определять нуклеотидный контекст в точке полиморфизма. Нами разработана панель зондов (см. табл. 1) для детекции всех 13 полиморфизмов. Разная длина зондов дает возможность одновременного анализа нескольких локусов в формате одной реакции.

Биоинформационный и статистический анализ данных

Для учета результатов исследования, формирования промежуточных таблиц, осуществления элементарных расчетов использовали программные ресурсы пакета Microsoft Office Excel 2003.

Для численной оценки вариабельности генетических локу-сов использовали индекс аллельного полиморфизма (h) [12].

Построение филогенетического древа осуществляли методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (Unweighted pair-group method using arithmetic averages - UPGMA) с использованием опции categorical parameter при помощи программного комплекса Bionumerics v. 6.01 («Applied Maths», Бельгия).

Результаты и обсуждение

В качестве метода генотипирования использовали расширенный протокол, включающий анализ 28 локусов: 15 локусов вариабельных тандемных повторов [9, 14] и 13 локусов однонуклеотидных полиморфизмов [13]. Основанные на аналогичных принципах подходы (анализ полиморфизма одиночных нуклеотидов и/или тандемных повторов) успешно применялись ранее для изучения внутривидового генетического разнообразия B. anthracis, оценки генетической стабильности вакцинных линий, а также расследования актов биологического терроризма в США в 2001 г. [5, 7, 9, 11].

Результаты молекулярно-генетического анализа и сравнения группы вакцинных и типового вирулентного штаммов B. anthracis представлены в табл. 2.

Из 15 исследованных VNTR-локусов 4 (vrrA, vrrBl, vrrB2 и BaVNTR12) были абсолютно инвариа-бельны у всех штаммов. Локус BaVNTR17 был исключен из работы, поскольку для всех исследованных штаммов результаты амплификации по этому локусу оказались отрицательными. Вариабельность (h) оставшихся 10 локусов составила от 0,12 до 0,4. Размеры ПЦР-продуктов, а следовательно, и число повторов в локусах vrrCl, vrrC2, CG3, BaVNTR19, BaVNTR32 и BaVNTR35 штаммов B. anthracis 55 ВНИИВВиМ и B. anthracis СТИ-1 были идентичными так же, как и для пары штаммов B. anthracis 34F2 Stern и B. anthracis И9. Штамм B. anthracis 34F2

Таблица 1

последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов, использованных для амплификации локусов, содержащих вариабельные тандемные повторы, и анализа однонуклеотидных полиморфизмов

Локус Обозначение Последовательность праймера (5'^3') Тем-

Длина, (молеку- пера-тура отжига (Та)

лярная масса, Д)

Праймеры для амплификации локусов, содержащих вариабельные тандемные повторы

BaVNTR12 BaVNTR12F ROX-CGTACGAAGTAGAAGTCATTAA 22 6791,5)

(ЫС003995 2485205-2485318) BaVNTR12R GCATATAATTGCACCTCATCTAG 23 6982,6)

BaVNTR19 BaVNTR19F FAM-GTGATGAAATCGGACAAGTTAGGAG 25 7819,1)

(ЫС003995 955120-955243) BaVNTR19R GAAATATTTTATTAAACATGCTTTCCATCC 30 9114,0)

BaVNTR35 BaVNTR35F TAMRA-AAATAATATGTTCCTTTTGCTG 22 6714,4)

(ЫС003995 2771693-2771806) BaVNTR35R GTCCTGAAATAAATGCTGAAT 21 6453,3)

BaVNTR16 BaVNTR16F FAM-CTCTTGAAAATATAAAACGCA 21 6406,3)

(ЫС003981 35721-35992) BaVNTR16R GAATAATAAGGGTTCTCATGGTAT 24 7430,9)

BaVNTR23 BaVNTR23F ROX-TTTAGAAACGTTATCACGCTTA 22 6708,4)

(ЫС003995 3974824-3975020) BaVNTR23R GTAATACGTATGGTTCATTCCC 22 6700,4)

BaVNTR17 BaVNTR17F TAMRA-TAGGTAAACAAATTTTCGTAATC 23 7045,7)

(ЫС003981 85403-85787) BaVNTR17R GATCGTACAACAGCAATTATCAT 23 7015,6)

BaVNTR32 BaVNTR32F ROX-AACTGGATCCAGGAGATTATA 21 6478,3)

(ЫС003995 1378983-1379559) BaVNTR32R GAAACAAGAGCAAACCCAAT 20 6121,1)

уггЛ vrrЛF FAM-CACAACTACCACCGATGGCACA 22 6642,4)

(ЫС003995 4549439-4549752) vrrЛR GCGCGTTTCGTTTGATTCATAC 22 6707,4)

\rrB1F TAMRA-ATAGGTGGTTTTCCGCAAGTTATTC 25 7678,0)

(ЫС003995 4971393-4971621) \rrB1R GATGAGTTTGATAAAGAATAGCCTGTG 27 8402,5)

CG3 CG3F ROX-TGTCGTTTTACTTCTCTCTCCAATAC 26 7813,1)

(ЫС003995 2730643-2730800) CG3R AGTCATTGTTCTGTATAAAGGGCAT 25 7711,1)

pXO1-aat pXO1-aatF FAM-CAATTTATTAACGATCAGATTAAGTTCA 28 8569,7)

(ЫС003980 149273-149398) pXO1-aatR TCTAGAATTAGTTGCTTCATAATGGC 26 7975,2)

рХ02а рХ02-о^Р TAMRA-TCATCCTCTTTTAAGTCTTGGGT 23 6986,6)

(ЫС003981 74965-75105) рХ02^ GTGTGATGAACTCCGACGACA 21 6455,2)

\rrB2F FAM-CACAGGCTATTCTTTATCAAACTCATC 27 8153,4)

(ЫС003995 4971267-4971419) \rrB2R CCCAAGGTGAAGATTGTTGTTGA 23 7118,7)

уггС1 УГГСШ GAAGCAAGAAAGTGATGTAGTGGAC 25 7828,2)

(ЫС003995 4930818-4931397) \rrC1R FAM-CATTTCCTCAAGTGCTACAGGTTC 24 7278,8)

уггС2 \rrC2F ROX-CCAGAAGAAGTGGAACCTGTAGCAC 25 7709,1)

(ЫС003995 4930322-4930853) vrrC2R GTCTTTCCATTAATCGCGCTCTATC 25 7533,9)

Праймеры для амплификации локусов, содержащих однонуклеотидные полиморфизмы

Л£г001 ЛBr001F CAAGCGGAACCAAATTTAATCTTT 24 7319,8)

ЛBr001R TTCACCGTACGTCATTGTATAATACG 26 7920,2)

Л^г002 ЛBr002F AACGATACCTAAAATCGATAAAG 23 7057,7)

ЛBr002R GGCAGAAGGAGCAAGTAATGTT 22 6872,5)

Л.Br003 ЛBr003F GCTACTGTCATTGTATAAAAACCTCCTTT 29 8801,8)

ЛBr003R CGCTTGCCAAGCTTTTTTTC 20 6024,9)

Л^г004 ЛBr004F CCGATACCAGTAAACGACGACAT 23 7010,6)

ЛBr004R CTGGAATTGGTGGAGCTATGGA 22 6870,5)

л^тб ЛBr006F CCGGAAATTGCTATTAGAACGAA 23 7080,7)

ЛBr006R TCCCAATCTAGCGTTTTTAAGTTCA 25 7582,0)

Л^г007 ЛBr007F TTGGTAACGAGACGATAAACTGAATAA 27 8364,5)

ЛBr007R GCCTTGGATTGGCGATTG 18 5561,6)

Л£Г008 ЛBr008F TTCGCAACTACGCTATACGTTTTAGAT 27 8224,4)

ЛBr008R CAAACGGTGAAAAAGTTACAAATATACG 28 8646,7)

л^тя ЛBr009F GGCAATCGGCCACTGTTT 18 5490,6)

ЛBr009R GGGTTTCTACTGTGTATGTTGTTAATAAAAAG 32 9923,5)

B.Br001 BBr001F TGCATGCTTCTTCTTACAGAGTAGTTAAT 29 8872,8)

BBr001R CGGTCATAAAAGAAATCGGTACAA 24 7402,9)

B.Br002 BBr002F TGTTGCACCTTCTGTGTTCGTT 22 6689,4)

BBr002R GTAGTGGCTTCACCGAATGGA 21 6486,3)

60

60

B.Br003 BBr003F CATTTATTCGCATAGAAGCAGATGA 25 (7689,1)

BBr003R TGTGCCATCAAATAACTCTTTCTCAA 26 (7864,2)

B.Br004 BBr004F GAAGTTAAGTATCAACCAGCAGAAGAAA 28 (8671,7)

BBr004R CCGCCGCCTTGAGCTT 16 (4809,1)

A/B.Br001 ABBr001F GAAGGTCTCCAATTTGGATTTAAAAT 26 (8008,3)

ABBr001R CGTGTGAACCTTTCGGTAAATAGTC 25 (7672,0) Последовательности олигонуклеотидных зондов, использованных для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов,

использованных с системой SNaPshot Multiplex Kit

ABBr001 ABBr001_pr AAAAAAAAAACCGATAATTTTCACAAAGCCGCTATCT 37 (11310,5)

ABr001 ABr001_pr AAAAAAAAAAAAAAAAATTTCCCTTTATCATCGACT-TCAA 40 (12224,1)

ABr002 ABr002_pr AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATAAAGCGACTGC-CGCCCA 40 (12360,2)

ABr003 ABr003_pr AAAAAAAAAAAAAAAAAGGAATTTAGATTTTCGTGTC-GAATTAAG 44 (13997,2)

ABr004 ABr004_pr AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCCGTCATACTTTG-GAATG 40 (12372,2)

ABr006 ABr006_pr AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTTCATCATACCCATG-CAC 39 (11971,9)

ABr007 ABr007_pr AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTGGTAGTATTC-GAGCTGAAT 42 (13109,7)

ABr008 ABr008_pr AAAAAAAAAAAAAAACGCTATACGTTTTAGATGGAGA-TAATTCTTC 46 (14213,4)

ABr009 ABr009_pr AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTATATTAACTGCG-GATGATGCAAG 46 (14338,5)

BBr001 BBr001_pr AAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTTCGGATATGATAC- 50 (15427,2)

CGATACCTTCTTATC

BBr002 BBr002_pr AAAAAAAAAAAAAAAGGAGAAGTTGCAAAAGGAA-CAG 37 (11588,7)

BBr003 BBr003_pr AAAAAAAAAAAAAAACATAGAAGCAGATGAGCTTA-CATATCC 42 (12974,6)

BBr004 BBr004_pr AAAAAAAAAAAAAAAAAAATGAAGATAATGACAAACG-GGATG 42 (13120,7)

50

Stern отличался от всех исследованных штаммов по числу повторов в локусе BaVNTR23, а штаммы 55 ВНИИВВиМ и СТИ-1 имели единственное различие по локусу pXO1aat.

Результаты амплификации локусов pXO2at и BaVNTR16, локализующихся на плазмиде капсулоо-бразования pXO2, были отрицательны у всех вакцинных штаммов, что связано с одной из важнейших характеристик этих штаммов — отсутствием данной плазмиды.

SNP-анализ не выявил различий в 7 локу-сах: A.Br004, A.Br006, A.Br007, A.Br009, B.Br001, B.Br002, A/B.Br001. Значения индекса вариабельности для оставшихся 5 локусов, по аналогии с вариабельностью VNTR-локусов, находились в диапазоне от 0,12 до 0,4. Комбинации всех исследованных SNP формировали 4 паттерна, полностью соотносящихся с VNTR-профилями.

Ранее штаммы B. anthracis 55 ВНИИВВиМ и B. anthracis СТИ-1 были отнесены к одному генотипу по 18 вариабельным локусам хромосомной локализации [5], однако расширенный протокол исследования 28 локусов сибиреязвенного микроба позволил дифференцировать их. При сравнительном филогенетическом анализе эти штаммы формировали отдельную группу, которая не включала третий вакцинный штамм, B. anthracis 34F2 Stern (см. рисунок).

Применение расширенного протокола генотипи-рования B. anthracis имеет, на наш взгляд, большое практическое значение и перспективы, в частности при оценке качества лабораторной работы с этим возбудителем и дополнительной проверке в случае поло-

жительного лабораторного диагноза сибирской язвы. Так, данный подход позволил нам установить факт внутрилабораторной контаминации возбудителем сибирской язвы в одной из региональных лабораторий, где до начала диагностических исследований для проверки качества питательных сред с нарушениями применялась споровая лиофилизированная культура вакцинного штамма B. anthracis 55 ВНИИВВиМ. Споры данного штамма привели к контаминации полевого материала, в процессе исследования которого местными специалистами было сделано ошибочное заключение о выделении возбудителя сибирской язвы с развертыванием соответствующих противоэпидемических и профилактических мероприятий.

В заключение работы хотелось бы обратить внимание на тот факт, что все исследуемые штаммы, кроме вакцинного B. anthracis СТИ-1, по SNP-профилю не относились к трем основным генетическим линиям и

Рис. Дендрограмма, иллюстрирующая степень родства исследованных штаммов, построенная на основании матрицы попарных аллельных профилей методом невзвешенного попарного арифметического среднего (UPGMA) с использованием программного комплекса Вюпитег^ V. 6.0.

Таблица 2 Результаты MLVA- и УЛР-типирования (указан размер ампликона в п.о. 0 — отсутствие ампликона при исследовании образца)

Локус Штамм

СТИ-1 55 ВНИИВВиМ Stern 34F2 И-9

SNP

VNTR

A.Br001 A.Br002 A.Br003 A.Br004 A.Br006 A.Br007 A.Br008

A.Br009

B.Br001 B.Br002 B.Br003 B.Br004 A/B.Br001 vrrA vrrBl vrrB2 vrrCl vrrC2 CG3 pX01aat pX02at BaVNTR12 BaVNTR16 BaVNTR17 BaVNTR19 BaVNTR23 BaVNTR32 BaVNTR35

T G A T A T G A T G G T A

310 232 159 615 603 157 129 0

117

0 0

96 199 519 114

T G A T A T G A T G A C A

310 232 159 615 603 157 126 0

117

0 0

96 199 519 114

T A G T A T T A T G G C A

310 232 159

582 527 162 129

0

117

0 0

93 187

583 120

C A G T A T T A T G G C A

310 232 159

582 527 162 129 138 117 264

0

93 199

583 120

12 клональным подгруппам, которые были выделены ранее на основании SNP-типирования обширной коллекции (более 1000 образцов) штаммов B. anthracis, изолированных на разных континентах [14]. Данная коллекция не включала штаммы, выделенные на территории Российской Федерации и бывших республик СССР. Очевидна необходимость применения расширенного протокола генотипирования для дальнейшего молекулярно-генетического изучения популяции возбудителя сибирской язвы на данных территориях, поскольку это может иметь как научно-фундаментальное (уточнение и дополнение существующей модели эволюции и мировой диссеминации B. anthracis), так и прикладное (изучение вспышек, подтверждение лабораторного диагноза, расследование потенциально возможных случаев биологического терроризма и др.) значение.

Сведения об авторах:

Афанасьев Максим Владимирович — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. отдела эпидемиологии ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, 664047 Иркутск, Трилиссера, 78, e-mail: [email protected];

Кравец Е. В. — канд. биол. наук, науч. сотр. отдела зоонозных инфекций ФКУЗ Иркутский научно-

исследовательский противочумный институт Роспот-ребнадзора, e-mail: [email protected];

Дугаржапова З. Ф. — канд. мед. наук, науч. сотр. отдела зоонозных инфекций ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, e-mail: [email protected];

Такайшвили В. Е. — лаборант-исследователь отдела зоонозных инфекций ФКУЗ Иркутский науч-но-исследовательский противочумный институт Роспот-ребнадзора, e-mail: [email protected];

Половинкина В. С. — науч. сотр. биохимического отдела ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, e-mail: sun-set@ list.ru;

Балахонов С. В. — д-р мед. наук, проф., дир. ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, e-mail: [email protected]

ЛИТЕРАТУРА

11—5.

1. БакуловИ.А., ГавриловВ.А. Ветеринария. 1995; 5:

2. ГинсбургН.Н. Живые вакцины. М.; 1969.

3. Еременко Е.И., Кейм П., Прайс Л.Б. и др. В кн.: Генная диагностика особо опасных инфекций: Материалы научно-практической конференции (21—22 ноября 2000 г., Саратов). Саратов; 2006: 33—6.

4. ЕременкоЕИ.,РязановаА.Г.,ЦыганковаО.И. и др. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012; 2: 26—9.

5. Кузнецовский А.В., Мигова Л.В., Федоров Ю.Н. и др. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2009; 4: 13—7.

6. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., ред. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. М.: Медицина; Шико; 2009.

7. AikembayevA.M., LukhnovaL., Temiraliyeva G. et al. Emerg. Infect. Dis. 2010; 16(5): 789—96.

8. Gierczynski R., JackubczakA., LagielskiM. Pol. J. Microbiol. 2009; 58(1): 3—7.

9. HoffmasterA.R. et al. Emerg. Infect. Dis. 2002; 8(10).

10. Keim P., Price L.B., KlevytskaA.M., Smith K.L., Schupp J.M. et al. J. Bacteriol. 2000; 182: 2928—36.

11. Keim P., Van ErtM. N., Pearson T. et al. Wagner Infect. Genet. Evol. 2004; 4: 205—13.

12. SelanderR. K., CaugantD. A., OchmanH. et al. Appl. Environ. Microbiol. 1986; 51: 873—84.

13. Sterne M. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1988; 192(2): 141.

14. Van ErtM.N., Easterday W.R., Huynh L.Y. et al. PLoS One. 2007; 2(5): e461. doi:10.1371/journal.pone.0000461.

15. Zinser G. Evolutionary relationships and mutation rate estimates in Bacillus anthracis. Flagstaff: Northern Arizona University; 2002.

Поступила 17.04.13

COMPARATIVE MULTILOCUS VNTR- AND SNP-ANALYSIS OF BACILLUS ANTHRACIS VACCINE STRAINS

M. V. Afanasev, E. V. Kravets, Z. F. Dugarzhapova, V. E. Takaishvili, V. S. Polovinkina, S. V. Balakhonov

Irkutsk Anti-plague Research Institute, Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Irkutsk

Comparative VNTR- and SNP-genotype analysis of four Bacillus anthracis strains (three vaccinal and one virulent) was carried out using modern molecular-genetic typing methods. It is established that these strains formed four SNP patterns completely corresponding to the VNTR-profiles. It was demonstrated that all strains tested except vaccinal B. anthracis STI-1 could not belong by SNP-profile to three global genetic lines of the anthrax agent extended in the world. Key words: Bacillus anthracis; genotyping; VNTR-analysis; SNP-analysis; anthrax epidemiology; anthrax vaccine