CC BY
130УДК 582.61:57.082.261
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СПОСОБОВ АСЕПТИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO РАСТЕНИЙ MELITTIS SARMATICA KLOK.
Е.В. САХВОН1, О.А. КУДРЯШОВА2, И.Ф. ВАЙНОВСКАЯ3, А.А. ВОЛОТОВИЧ1
'Полесский государственный университет, г. Пинск, Республика Беларусь 2Республиканский лесной селекционно-семеноводческий центр, Минский район, Республика Беларусь 3ГНУ «Центральный ботанический сад НАНБеларуси», г. Минск, Республика Беларусь
Введение. В настоящее время одна из наиболее острых экологических проблем в мире - стремительное сокращение ареалов распространения и полное исчезновение видов растений. Усиливается сокращение биологического разнообразия, а также возможность устойчивого использования природных биологических ресурсов [1, с. 53; 2, с.2]. Исключительно актуальной становится проблема сохранения видового разнообразия растительного мира. На сегодняшний день 70% дикорастущих растений нашей страны находятся под угрозой исчезновения. За последние 150 лет под влиянием комплекса антропогенных факторов из состава флоры Республики Беларусь выпало 46 видов аборигенных сосудистых растений [3, с.173].
Культивирование растений в условиях in vitro представляет собой альтернативный, перспективный способ сохранения генофонда высших растений. Биотехнологические методы, основанные на клональном микроразмножении растений, играют важную роль в сохранении видового разнообразия. Такие методы позволяют быстро размножать и сохранять редкие и исчезающие виды, возвращать их в естественные условия обитания, в короткие сроки получать биомассу растений для нужд промышленности [4, с.68; 5, с.184]. В качестве исходного материала для асептического введения и стабилизации in vitro используют различные части растений: стеблевые сегменты, эпи-и гипокотили, ткани зародыша и семена. При работе с редкими и исчезающими видами предпочтительно использовать семенной материал, поскольку это позволяет на максимальном уровне сохранить естественную популяцию. Однако у многих редких видов растений возникает проблема глубокого покоя семян, преодолеть которую возможно в условиях in vitro, и значительно сократить срок вывода семян из состояния покоя [6, с.3].
Кадило сарматское - многолетнее самоопыляемое травянистое растение семейства Lamiaceae L [7, с. 221]. В диком виде распространено в Средней и Атлантической Европе, на западе европейской части России [8, с.87]. Это ценное лекарственное, пряное, декоративное и медоносное растение [9, 3152; 10, с.154; 11, с.56]. Широкий спектр хозяйственно полезных свойств определяется его богатым химическим составом [12, с. 114]. Во многом это служит предпосылкой тому, что уже не один десяток лет кадило сарматское находится в статусе редкого растения для территории нашей страны [7, с.221; 13, с.79]. На данный момент оно входит в Список редких и находящихся под угрозой исчезновения на территории Республики Беларусь видов диких животных и дикорастущих растений, включенных в Красную книгу Республики Беларусь 2014 года: 3 категория природоохранной значимости [14, с.189].
Кадило сарматское обладает аутохорией. Семена сразу же после созревания выпадают из чашечек, они имеют недоразвитый зародыш и при хранении быстро теряют всхожесть. Это затрудняет выращивание растения, однако наиболее эффективным способом репродукции кадила в культуре на сегодняшний момент остается генеративный [11, с.56; 15, с.66].
В настоящее время имеются данные о микроклональном размножении Melittis sarmatica в условиях in vitro. Авторы исследуют как эффективность размножения кадила микрочеренками, так и культивирование каллусной ткани этого растения [16, с.264; 17, с.420; 18, с. 770; 19, с.18]. Учитывая ограниченные природные запасы кадила и сложность его размножения семенами, а также скудные данные по асептическому введению и размножению кадила in vitro, целью наших исследований явилось изучение и сравнение разных способов асептического введения in vitro растений кадила сарматского (Melittis sarmatica Klok.), с использованием семян и черенков с пазушными почками.
Методика и объекты исследования. Объектом исследования стали растения кадила сарматского (Melittis sarmatica Klok.j, интродуцированные в Центральном ботаническом саду НАН Беларуси в условиях открытого грунта.
Для асептического введения в культуру in vitro использовали свежесобранные семена и черенки с пазушными почками растений.
Семена стерилизовали 0,1% раствором нитрата серебра при продолжительности экспозиции 5 и 10 минут. После стерилизации семена трехкратно промывали в стерильной бидистиллированной воде в течение 30 минут. Затем выкладывали в стерильные стеклянные емкости объемом 250 мл на стерильные бумажные фильтры, смоченные стерильной бидистиллированной водой с добавлением гормонов по схеме:
1. 0 мг/л 6-БАП и 0 мг/л ЭБ (контроль)
2. 0,1 мг/л 6-БАП
3. 0,5 мг/л 6-БАП
4. 1,0 мг/л 6-БАП
5. 0,1 мг/л ЭБ
6. 0,5 мг/л ЭБ
7. 1,0 мг/л ЭБ
8. 0,5 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ЭБ
Емкости с семенами помещали на стеллажи световой установки культурального помещения биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве ПолесГУ при температуре +25оС, фотопериоде день/ночь - 16/8ч, освещенности 6000 лк, относительной влажности воздуха 70%. Учет общего количества стерильных всходов проводили дважды: через четыре и через восемь недель культивирования. Количество семян в каждом из восьми вариантов опыта, в среднем, составило 30 штук. Повторность трехкратная.
Стерильные взошедшие семена, полученные после стерилизации 0,1% раствором AgNO3 были высажены на агаризованную питательную среду на микро-, макро- солевой основе среды МС [20, с.23], содержащую тиамин (0,2 мг/л), пиридоксин (0,8 мг/л), мезоинозит (100 мг/л) и сахарозу (1%), 9 г/л агар-агара, при рН 5,7. Перед высадкой на агаризованную, питательную среду у проростка отсекали гипокотиль практически полностью, оставляя только несколько миллиметров. Учет общего количества стерильных регенерантов проводили через четыре недели культивирования на стеллажах световой установки культурального помещения биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве ПолесГУ при температуре +25оС, фотопериоде день/ночь - 16/8ч, освещенности 6000 лк, относительной влажности воздуха 70%.
При использовании черенков для получения асептической культуры срезы были запарафиниро-ваны, что исключило проникновение стерилизующего агента внутрь сосудистого цилиндра и предотвратило значительную интоксикацию ткани. Перед стерилизацией растительный материал был тщательно отмыт хозяйственным мылом, а затем промыт дистиллированной водой. Далее черенки подвергались предварительной обработке 0,01% раствором перманганата калия (время экспозиции 3 минуты) и 70% этиловым спиртом (время экспозиции 20 секунд). В качестве основного стерилизующего агента был использован 0,1% раствор диацида. Изучали эффективность действия этого вещества при разном времени экспозиции (3, 5, 7 и 10 минут). После стерилизации черенки пятикратно промывали стерильной дистиллированной водой. Концы стебля, покрытые парафином, отрезали и черенки высаживали в пробирки с агаризованной питательной средой, содержащей половинный состав микро-, макро- солевой основы по Мурасиге и Скугу (МС) [20, с.23], тиамин (0,2 мг/л), пиридоксин (0,8 мг/л), мезоинозит (100 мг/л) и сахарозу (1%), 9 г/л агар-агара, при рН 5,7. Пробирки с черенками помещали на стеллажи световой установки культурального помещения при температуре +25оС, фотопериоде день/ночь - 16/8ч, освещенности 6000 лк, относительной влажности воздуха 70%.
Результаты и их обсуждение. При получении асептической культуры in vitro немаловажная роль в процессе стерилизации принадлежит подбору стерилизующих соединений, эффективности их концентраций и продолжительности времени обработки с целью освобождения от инфекции и получения высокого выхода жизнеспособных, регенерирующих эксплантов. Для стерилизации материала используют различные стерилизующие соединения с различной концентрацией и временем экспозиции [21, с.19].
Стерилизующие соединения по степени их дезинфицирующего действия условно можно разделить на несколько групп: соединения, обладающие сильным дезинфицирующим действием - соединения, содержащие ртуть (сулема, диацид, азотнокислая ртуть); соединения, обладающие
средним дезинфицирующим действием - содержащие в своем составе активный хлор (гипохлори-ты натрия, калия, кальция, хлорамин); соединения, обладающие слабым дезинфицирующим действием - перекись водорода и перманганат калия с присущими им окислительными свойствами [22, с.47].
В результате пятиминутной экспозиции в 0,1% растворе AgNO3 стерильными оказались 92,2% семян (таблица 1).
Таблица 1 - Процент всхожести и стерильности семян кадила сарматского после обработки 0,1% раствором AgNO3
Время обработки AgNO3 Всхожесть, % Стерильность, %
5 минут 1,0 92,2
10 минут 2,0 98,0
При увеличении времени экспозиции до 10 минут, процент стерильных семян увеличился до 98,0%. Процент взошедших семян при пятиминутной обработке 0,1% раствором AgNO3 составил 1%, а при 10-минутной обработке - 2%, от общего количества семян в восьми вариантах опыта. Увеличение времени экспозиции семян в 0,1% растворе AgNO3 до 10 минут привело к двухкратному увеличению количества взошедших, стерильных семян (таблица 1).
Наиболее высокие показатели по стерилизации и всходам семян кадила сарматского наблюдались в вариантах опыта с 0,5-1,0 мг/л 6-БАП (2,1-6,0%), а также при сочетании 0,5 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ЭБ (3,1-4,8%), в зависимости от концентрации фитогормонов и времени экспозиции в 0,1% растворе AgNO3 (таблица 2). В присутствии 0,1-1,0 мг/л ЭБ количество взошедших, стерильных семян составило 1%.
Экспланты, полученные из стерильных проростков высаживали на агаризованную питательную среду без фитогормонов и осуществляли учет количества стерильных регенерантов через четыре недели культивирования на стеллажах световой установки. Все регенеранты, полученные из семян, проходивших стерилизацию в 0,1% растворе AgNO3 на протяжении 5 минут, оказались инфицированы. Количество стерильных, жизнеспособных растений, полученных из семян, проходивших стерилизацию в 0,1% растворе AgNO3 на протяжении 10 минут, составило 93%.
Таблица 2 - Влияние времени экспозиции семян в 0,1% растворе AgNO3 и концентрации гормонов на всхожесть и контаминацию семян кадила сарматского
Концентрация гормонов,мг/л Время экспозиции в 0,1% растворе AgNO3, мин
5 10
Наличие контаминации, % Количество взошедших, стерильных семян, % Наличие контаминации, % Количество взошедших, стерильных семян, %
- 7,3 0 7,2 0
6-БАП 0,1 9,4 0 - 0
6-БАП 0,5 7,3 2,1 - 3,6
6-БАП 1,0 7,3 2,1 - 6,0
ЭБ 0,1 10,4 0 - 1,2
ЭБ 0,5 5,2 0 9,4 0
ЭБ 1,0 5,2 1,0 - 0
6-БАП 0,5 +ЭБ 0,5 10,4 3,1 - 4,8
Примечание: 6-БАП - 6-бензиламинопурин; ЭБ - 24-эпибрассинолид.
При использовании черенков кадила сарматского в качестве исходного материала для асептического введения в культуру in vitro показано, что время стерилизации влияло не только на стерильность исходного материала, но и на его жизнеспособность (таблица 3). Так, при стерилизации черенков 0,1% раствором диацида в течение 3 минут не было получено стерильных растений. С 24
увеличением времени обработки 0,1% раствором диацида возрастало количество стерильных черенков и при 10 минутной экспозиции достигло 100%. Однако большинство черенков оказывались нежизнеспособны, а оставшиеся живыми черенки слабо регенерировали и не образовывали корней.
Таблица 3 - Влияние времени стерилизации черенков кадила сарматского 0,1% раствором диацида на их стерильность, жизнеспособность и укореняемость in vitro
Время стерилизации 0,1% диацидом, мин. Стерильность материала, % Частота некроза, % Укоренившиеся черенки, %
3 0,0 100,0 0,0
5 10,4 82,7 8,5
7 72,6 37,3 28,7
10 100,0 92,1 0,0
Наилучшие результаты были получены при 7 минутной обработке 0,1% раствором диацида, но и в данном случае только 28,7% регенерантов после четырех недель культивирования образовывали корни.
Хотя процесс образования корней в условиях in vitro у растений семейства Lamiaceae (роды Lavandula, Salvia) напрямую зависит от присутствия в среде культивирования ауксинов [23, с. 599; 24, с. 80], растения Melittis sarmatica в условиях in vitro не нуждаются в добавлении гормонов, стимулирующих корнеобразование. При добавлении в среду культивирования индолилмасляной кислоты в концентрации 0,25-1,00 мг/л количество корней у регенерантов кадила сарматского уменьшается в 1,2-1,5 раз, по сравнению с безгормональным контролем [4, с.71]. Схожий эффект наблюдается и у Salvia officinalis L. [25, с. 31], также представителя семейства Lamiaceae.
Заключение. При асептическом введении в культуру in vitro семян кадила сарматского, с использованием 0,1% раствора AgNO3 в качестве стерилизующего агента на протяжении 5 или 10 минут, стерильность семян составила 92,2% и 98,0%, соответственно, а всхожесть - 1% и 2%, соответственно.
Наиболее высокие показатели по стерильности и всхожести семян наблюдались при сочетания 6-БАП и ЭБ в концентрациях по 0,5 мг/л (всхожесть составила 3-5%), а также при добавлении в среду только 0,5-1,0 мг/л 6-БАП (всхожесть составила 2-6%), или только 0,1-1,0 мг/л ЭБ (всхожесть составила 1-2%).
Экспланты из визуально стерильных проростков семян, полученных при стерилизации 0,1%-ным раствором AgNO3 на протяжении 5 минут, оказались инфицированы через четыре недели культивирования после пересадки в агаризованную питательную среду. Количество стерильных, жизнеспособных растений, полученных из семян, проходивших стерилизацию в 0,1% растворе AgNO3 на протяжении 10 минут, составило 93%.
При стерилизации черенков кадила сарматского в 0,1% растворе диацида в течение 3-10 минут количество стерильных черенков увеличивалось прямо пропорционально от 0 до 100%. С увеличением времени экспозиции материала в 0,1% растворе диацида большинство черенков оказались нежизнеспособными, а оставшиеся живыми черенки слабо регенерировали и не образовывали корней.
Наиболее высокие результаты по регенерации (62,7%) и укореняемости (28,7%) стерильных черенков были получены при семиминутной обработке 0,1% раствором диацида.
Авторы выражают искреннюю благодарность академику НАН Беларуси, доктору химических наук, профессору Владимиру Александровичу Хрипачу за любезно предоставленный для исследований 24-эпибрассинолид, произведенный на базе лаборатории химии стероидов ГНУ «Институт биоорганической химии НАН Беларуси».
ЛИТЕРАТУРА
1. Edison, S. Biodiversity of Tropical Tuber Crops in India / S. Edison [et al.] // National Biodiversity Authority Chennai, TamilNadu, India, 2006. - 60 p.
2. Gurib-Fakim, A. Medicinal plants: traditions of yesterday and drugs of tomorrow / А. Gurib-Fakim // Molecular Aspects of Medicine. - 2006. - vol. 27. - P. 1-93.
3. Об установлении списков редких и находящихся под угрозой исчезновения на территории Республики Беларусь видов диких животных и дикорастущих растений, включаемых в Красную книгу Республики Беларусь - Постановление Министерства природных ресурсов и охраны окружающей среды Республики Беларусь, 9 июня 2014 г., № 26 // Нац. реестр правовых актов Респ. Беларусь. - 2014. - № 28. - С. 173-189.
4. B^czek, K. In vitro propagation of bastard balm (Melittis melissophyllum L.) / K. B^czek [et al.] // Herba Pol. - 2015. - Vol. 61(3). - Р. 67-76.
5. Сахвон, Е.В. Оздоровление растений Melittis sarmatica в культуре in vitro / Е.В. Сахвон, Т.И. Фоменко // Проблемы сохранения биологического разнообразия и использования биологических ресурсов: материалы III Междунар. Конф., посвяще. 110-летию со дня рожд. акад. Н.В. Смольско-го, Минск, 7-9 октября 2015 г.: в 2 ч. / Нац. акад. наук Беларуси [и др.]; редкол.: В.В. Титок [и др.]. - Минск : Конфидо, 2015. - С. 184-186.
6. Ветчинкина, Е.М. Биологические особенности культивирования in vitro семян и зародышей редких видов растений: автореф. дисс. ... канд. биол. наук: 03.02.01 / Е.М. Ветчинкина; ГБС им. Н.В. Цицина РАН. - М., 2010. - 170 с.
7. Гречаный, И.А. Большой иллюстрированный справочник лекарственных трав и растений / И.А. Гречаный. - Харьков : Книжный клуб «Клуб семейного досуга», 2015. - 544 с.
8. Природа Беларуси: энциклопедия. В 3 т. Т.3. Растения, грибы, животные / редкол.: В.Ю. Александров [и др..]. - Минск: Беларус. Энцыкл. !мя П.Броую, 2014. - 464 с.
9. Kaurinovic, B. Antioxidant аctivities of Melittis melissophyllum L. (Lamiaceae) / B. Kaurinovic [et al.] // Molecules. - 2011. - Vol. - 16, Р. 3152-3167.
10. Skrzypczak-Pietraszek, E. Chemical profile and seasonal variation of phenolic acid content in bastard balm (Melittis melissophyllum L., Lamiaceae) / E. Skrzypczak-Pietraszek, J. Pietraszek // Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. - July 2012. - vol. 66. - P. 154-161.
11. Центральный ботанический сад НАН Беларуси: сохранение, изучение и использование биоразнообразия мировой флоры / В. В. Титок [и др.] ; под ред. В. В. Титка, В. Н. Решетникова. -Минск : Беларус. навука, 2012. - 345 с.
12. Корзун О С. Лекарственные растения: пособие для студ. высш. учеб. завед. / О.С. Корзун, Н.А. Дуктова; под. ред. Н. Н. Пьянусова. - Горки БГСХ, 2013. - 262 с.
13. Лознухо, И.В. Особенности кадила сарматского (Melittis sarmatica Klok.) в условиях культуры / И.В. Лознухо, Т.К. Гавриленко, В.С. Линник // Пряно-ароматические и лекарственные растения: перспективы интродукции и использования: материалы Междунар. конф., Минск, 31 мая-2 июня 1999 г. / НАН Беларуси, ЦБС НАН Беларуси, Минсельхозпрод РБ, Концерн «Белбиофарм»; ред. В Н. Решетников. - Минск, 1999. - С. 79-80.
14. Красная книга Республики Беларусь: Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды дикорастущих растений / Мин-во природн. ресурсов и охраны окруж. среды РБ; редкол.: Л.И. Хо-ружик [и др.]. - Минск: Белорусская энциклопедия им. Петруся Бровки, 2005. - 456 с.
15. Кухарева, Л.В. Особенности размножения кадила сарматского (Melittis Sarmatica Klock.) при интродукции / Л.В. Кухарева, Т.М. Новичкова, А.В. Эльяшевич // Пряно-ароматические и лекарственные растения: перспективы интродукции и использования: материалы Междунар. Конф., Минск, 31 мая-2 июня 1999 г. / НАН Беларуси, ЦБС НАН Беларуси, Минсельхозпрод РБ, Концерн «Белбиофарм»; ред.. В.Н. Решетников. - Минск, 1999. - С. 66-67.
16. Skrzypczak, E. The tissue culture and chemical analysis of Melittis melissophyllum L. / E. Skrzypczak, L. Skrzypczak // Acta Hort. - 1993, Р. 263-267.
17. Мазур, Т.В. Регуляция ростовых процессов каллусной культуры представителей семейства Lamiaceae / Т.В. Мазур [и др.] // Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры: материалы Междунар. конф., посвящ. 80-летию ЦБС НАН Беларуси, Минск,19-22 июня 2012 г.: в 2 ч. / НАН Беларуси, ЦБС НАН Беларуси; редкол.: В.В. Титок [и др.]. - Минск, 2012. - Ч.2. - С. 419-423.
18. Skrzypczak-Pietraszek, E. Polysaccharides from Melittis melissophyllum L. herb and callus / E. Skrzypczak-Pietraszek, A. Hensel // Pharmazie. - 2000. - Vol. 55. - Р. 768-771.
19. Бердичевец, Л.Г. Микроклональное размножение кадила сарматского / Л.Г. Бердичевец [и др.] // Ботанические сады: состояние и перспективы сохранения, изучения, использования биологического разнообразия растительного мира: тез. докл. Междунар. науч. конф. г. Минск, 30-31 мая 2002 г. / Центральный Ботанический сад НАН Беларуси. - Минск : БГПУ, 2002. - С. 18.
20. Trigiano, R.N. Plant Development and Biotechnology / R.N. Trigiano, D.J. Gray. - CRC Press LLC, 2005. - 358 р.
21. Цыренов, В.Ж. Основы биотехнологии: культивирование изолированных клеток и тканей растений Часть 2 / В.Ж. Цыренов // Восточно-сибирский ГТУ. Улан-Удэ. - 2003 - 276 с.
22. Калинин, Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений / Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир, В.В.. Сарнацкая // К.: Наук. Думка. - 1992. - 228с.
23. Skala, E. In vitro regeneration of Salvia nemorosa L. From shoot tips and leaf explants / E. Skala, H. Wysokinska // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. - 2004. - Vol. 6. - P. 596-602.
24. Andrade, L.B. The effect of growth regulators on shoot propagation and rooting of common lavender (Lavandula vera DC) / L.B. Andrade [et al.] // Plant Cell, Tissue Organ Cult. - 1999. - 56, Vol. 2. - P. 79-83.
25. Avato, А. Glandular hairs and essential oils in micropropagated plants of Salvia officinalis L. / P. Avato [et al.] // Plant Science. - 2005. - 169. - Р. 29-36.
COMPARATIVE ANALYSIS OF ADMINISTRATION ASEPTIC IN CULTURE IN VITRO PLANTS MELITTIS SARMATICA KLOK
E.V. SAKHVON, O.A. KUDRYASHOVA, I.F. VAYNOVSKAYA, А.А. VOLOTOVICH
Summary
There were developed the methods of sterilization and introduction in vitro of a rare aromatic plants of the Belarusian flora of Melittis sarmatica Klok. The seeds and cuttings with axillary buds were used as a material for introduction in vitro culture. As the main sterilizing agents there were used the 0.1% solution of silver nitrate and the 0.1% solution of the diacid. Influence of a 6-benzilaminopurin (6-BAP), 24-epibrassinolid (EB), their combinations and concentration on in vitro viability and germination of plant seeds Melittis sarmatica in vitro is studied. The highest rates on sterility and viability of seeds were observed at a combination 6-BAP and EB in concentration on 0.5 mg/l (viability of 3-5%), at addition on medium only of 0.5-1.0 mg/l 6-BAP (viability of 2-6%), or only of 0.1-1.0 mg/l of EB (viability of 12%). The most high influence on sterilization (72.6%), regeneration (62.7%) and rooting (28.7%) of sterile cuttings have been received at seven-minute processing of 0.1% solution of the diacid.
Key words: Melittis sarmatica, in vitro, sterilization, explant, silver nitrate, the diacid, benzylaminopurine, epibrassinolide.
Статья поступила 18 марта 2016г.
