CC BY
30
DOI: 10.23868/202104010
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕГЕНЕРАТОРНОГО ПОТЕНЦИАЛА ПРОИЗВОДНЫХ КРОВИ НА КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ЭПИТЕЛИЯ РОГОВИЦЫ
А.М. Суббот, С.В. Труфанов, Н.П. Шахбазян Поступила: 07.10.2020
_ Принята к печати: 25.03.2021
Научно-исследовательский институт глазных болезней, Москва, Россия опублик0вана on-line: 15.04.2021
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE REGENERATORY POTENTIAL OF BLOOD DERIVATIVES ON A CELL MODEL OF CORNEAL EPITHELIUM DAMAGE
A.M. Subbot, S.V. Trufanov, N.P. Shakhbazyan
Research Institute of Eye Diseases, Moscow, Russia
e-mail: [email protected]
Проблема восстановления эпителиального слоя после различных модификаций кератопластики представляет большой фундаментальный интерес. В связи с этим разрабатываются новые способы индукции регенерации, и одним из перспективных подходов в этой области является применение аутологич-ных производных крови, обладающих высоким регенераторным потенциалом.
Цель исследования: сравнить влияние трех производных крови (сыворотки; плазмы, обогащенной тромбоцитами; плазмы, обогащенной факторами роста), применяемых для стимуляции регенераторных процессов на глазной поверхности, на пролиферацию и миграцию клеток роговичного эпителия in vitro.
Исследование проводили на клетках эпителия роговицы человека 3 пассажа. Для подтверждения роговичной принадлежности клетки типировали на характерные цитокератины. Динамику миграции оценивали в тесте на заживление раны монослоя, пролиферацию — по результатам формазанового теста.
Наибольшее стимулирующее действие на пролиферацию клеток оказывала плазма, обогащенная факторами роста. Значимых различий между группами в скорости заживления раны монослоя зафиксировано не было. Выявлено, что по сравнению с контролем все стимуляторы сдвигают фенотип клеток в сторону эпителиоподобного фенотипа.
В результате проведенного исследования было показано, что все три типа апробированных производных крови являются промоутерами реэпителизации роговицы. Использование препаратов, полученных из крови, может положительно влиять на процессы эпителизации при персистирующих эпителиальных дефектах роговицы, что требует дальнейшего изучения.
Ключевые слова: аутологичная сыворотка, обогащенная тромбоцитами плазма, клеточная культура, эпителий роговицы, персистирующий эпителиальный дефект.
Введение
В зарубежной литературе термином персистирующий эпителиальный дефект роговицы (ПЭД) обычно называют стойкие, не заживающие после двух недель стандартной терапии поражения эпителия роговицы [1-4]. ПЭД, как самостоятельный клинический диагноз, в литературе обсуждается крайне редко, хотя сопровождает другие патологические состояния роговицы. Зачастую эпителиальный дефект возникает на поверхности трансплантированной роговицы, где баланс регуляторных молекул особенно неустойчивый, поэтому именно в этих случаях важно максимально быстро восстановить целостность роговицы и предотвратить развитие помутнения.
В нормальных условиях, после повреждения, если подлежащая базальная мембрана остается незатронутой, эпителиальный слой роговицы регенерирует в течение примерно 7 дней [5, 6]. Однако при повреждающем воздействии на базальную мембрану эпителиальный слой будет регенерировать гораздо дольше, и срок восстановления может составить 6-8 недель [6-8].
Такое длительное существование эпителиального дефекта влечет за собой фиброзирование подлежащего
The problem of the restoration of the epithelial layer after various modifications of keratoplasty is of great fundamental interest. In this regard, new methods of induction of regeneration are being developed; one of the promising approaches in this area is the use of autologous blood derivatives with a high regenerative potential.
Objective: to compare the effect of 3 blood derivatives serum, platelet-rich plasma and plasma rich growth factors on the culture of corneal epithelial cells.
The study was carried out on cells of the epithelium of the human cornea of passage 3. To confirm corneal affiliation, cells were typed for characteristic cytokeratins. The dynamics of migration was assessed in the test for wound healing of the monolayer. Proliferation was assessed by the results of the formazan test.
Plasma rich growth factors had the greatest stimulating effect on cell proliferation. There were no significant differences between groups in the rate of wound healing of the monolayer. It was found that, in comparison with the control, all stimulants shift the morphological phenotype of cells to a more mature side.
As a result of the study, it was shown that all 3 types of tested blood derivatives are promoters of corneal re-epithelialization. The use of drugs obtained from blood can positively influence the processes of epithelialization in persistent epithelial corneal defects, which requires further study.
Keywords: autologous serum, platelet-rich plasma, cell culture, corneal epithelium, persistent epithelial defect.
слоя — стромы, т. к. разрыв базальной мембраны приводит к повышенному проникновению в нее факторов, стимулирующих миофибробластогенез: в первую очередь трансформирующего фактора роста бета (ТЭР-р) и тромбоцитарного фактора роста (РОЭР), продуцируемых клетками глазной поверхности [9-11].
При травмировании эпителия высвобождаются воспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли альфа (Т1\1Р-а) и интерлейкин-1 (11_-1), которые прямо или косвенно могут вызывать апоптоз керато-цитов и увеличение их синтетической активности, что, по принципу обратной связи, стимулирует пролиферацию и миграцию эпителиальных клеток [6, 12, 13].
Кроме того, эти провоспалительные факторы способствуют синтезу протеаз, участвующих в ремоделирова-нии стромы и базальной мембраны [14-17].
Таким образом, воспалительные состояния могут приводить к ПЭД, нарушая соотношение и последовательность фаз процесса регенерации.
Доступным и перспективным источником факторов роста, цитокинов и компонентов матрикса является периферическая кровь, поэтому использование глазных
капель, полученных из крови и ее компонентов, для лечения заболеваний глазной поверхности становится все более востребованным в последние годы. Подобная стимуляция регенерации может дать положительный эффект и в лечении ПЭД роговицы, т. к. фибронектин и альбумин, содержащиеся в крови, могут помочь в восстановлении поврежденной базальной мембраны, а факторы роста «подстегнуть» клетки ростковой зоны лимба к делению и созреванию.
Наиболее технологически простая субстанция, получаемая из крови, это сыворотка. Препараты, на основе тромбоцитов, также успешно используются для заживления ран различной локализации, в том числе на глазной поверхности [18]. Обогащенная тромбоцитами плазма, плазма, обогащенная факторами роста и лизат тромбоцитов — особенно востребованы в настоящее время. Все эти субстанции показывают терапевтическую эффективность, несмотря на различия по цитокиновому составу [19, 20]. Как правило, в публикациях приводят данные о более быстром заживлении роговицы in vivo и in vitro при использовании препаратов из тромбоцитов, по сравнению с другими производными крови. Отсутствие в настоящее время стандартного протокола получения и использования таких продуктов из крови затрудняет его массовое применение в клинической практике [21-23].
Публикации, посвященные сравнению влияния различных производных крови на роговичные клетки in vitro являются единичными [24]. В то время как на других клетках из других источников, как первичных, так и имморта-лизованных, такие сравнительные исследования активно ведутся и за рубежом и в России [25-27].
Цель исследования: сравнить влияние трех производных крови (сыворотки; плазмы, обогащенной тромбоцитами; плазмы, обогащенной факторами роста), применяемых, для стимуляции регенераторных процессов на глазной поверхности, на пролиферацию и миграцию клеток роговичного эпителия in vitro.
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Сравнительный анализ регенераторного потенциала 3 стимуляторов (сыворотки; плазмы, обогащенной тромбоцитами; плазмы, обогащенной факторами роста) проводили на культуре клеток роговичного эпителия по результатам их влияния на пролиферацию и миграцию клеток.
Производные крови получали из образцов крови, взятой из локтевой вены здорового донора после подписания информированного согласия.
Для оценки пролиферации и миграции в ростовую среду добавляли исследуемые стимуляторы — сыворотку, обогащенную тромбоцитами плазму или плазму, обогащенную факторами роста (10% от объема ростовой среды), в контрольную группу — только ростовую среду. Пробы для всех вариантов культивирования ставили в триплетах.
Получение сыворотки крови: 9 мл цельной крови забирали в пробирку без антикоагулянта. Сыворотку собирали после свертывания крови в течение 2 ч. при комнатной температуре и последующего центрифугирования в режиме 1000 g, 15 мин. (центрифуга фирмы ELMI CM-6M, Латвия).
Получение плазмы, обогащенной тромбоцитами: кровь забирали в пробирку с 3,8% цитратом натрия (VACUETTE, Greiner Bio-One, Австрия), центрифугировали (центрифуга фирмы ELMI CM-6M, Латвия) при 900 g в течение 5 мин., собирали плазму и снова центрифугировали при 1 500 g в течение 10 мин. Верхние
2/3 супернатанта убирали, оставляя нижнюю треть — плазму, обогащенную тромбоцитами.
Получение плазмы, обогащенной факторами роста: в пробирку с плазмой, обогащенной тромбоцитами, добавляли хлорид кальция (активация) до концентрации 22,8 мМ, инкубировали при 37 °С в течение 2 ч. и далее инактивировали комплемент нагреванием до 56 °C в течение 30 мин.
Подсчет тромбоцитов в цельной крови и обогащенной тромбоцитами плазме проводили в камере Горяева после лизиса эритроцитов 1% раствором оксалата аммония (Biochem, Франция) и на автоматическом гематологическом анализаторе ADVIA 2120 ( Siemens, Healthcare Diagnostics Inc., США) на базе Межклинической КДЛ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.
Получение культуры клеток эпителия роговицы
Первичную культуру клеток эпителия роговицы человека получали эксплантным методом из кадаверного материала — корнео-склерального кольца, не востребованного в ходе кератопластики. Поверхность культураль-ного пластика была покрыта фибронектином 1 мкг/см2 (Биолот, РФ). Клетки выращивали в бессывороточной среде K-SFM (Gibco, США) в стандартных условиях (37 °C, 5% CO2, влажность 100%), среду меняли 1 раз в 2-3 дня, по достижении конфлюэнтного монослоя клетки пассировали раствором 0,05% трипсина и ЭДТА (Gibco, США). В исследовании были использованы клетки 3 пассажа.
Для подтверждения роговичной принадлежности клетки типировали на характерные цитокератины (CK) 3 и 19 и одновременно окрашивали на белок-маркер пролиферации Ki67. Двухступенчатое иммуноцитохими-ческое окрашивание проводили в чашках Петри с центральным отверстием для микроскопии (SPL, Корея) антителами к СК3 — Cytokeratin-3 antibody (clone AE5, ab77869, Abcam, ^ША) и СК19 — Cytokeratin 19 antibody (clone 4E8, MA5-15884, ThermoFisher, США) в разведении 1:200; вторичные антитела Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594 (Invitrogen, США) использовали в разведении 1:1000. Маркер пролиферации Ki67 выявляли с помощью поликлональных антител (AB9260, Chemicon, США) в разведении 1:200, вторичные антитела Cy2 (ab6940, Abcam, ^ША) применяли в разведении 1:100. Ядра клеток докрашивали Hoechst 33342 (^vitragen^!^ ) в концентрации 1мкг/мл.
Оценка пролиферации клеток
Пролиферацию оценивали формазановым тестом в одноступенчатой модификации (MTS): клетки высевали с плотностью 1х103 кл/см2 в лунки 96-луночного планшета за 1 сут. до тестирования, Стимулятор добавляли в концентрации 10% от объема ростовой среды. Анализ проводили через 24 и 48 ч. В лунки добавляли реагент CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, США) и измеряли коэффициент пропускания на фотометре Muliscan-FC (Thermo Fisher Scientific, США) при длине волны 490 нм. Количество живых клеток в лунке было пропорционально значению оптической плотности.
Анализ миграции клеток
Для исследования влияния производных крови на миграцию был проведен тест на заживление раны монослоя: в клеточном пласте после достижения 100%
Рис. 1. Культура клеток роговичного эпителия: А — экспрессия цитокератина 19 (красный цвет) и Ю67 (зеленый цвет),
1-й пассаж; Б — экспрессия цитокератина 3 (красный цвет), 1-й пассаж; В — экспрессия цитокератина 19 (красный цвет) и Ю67
(зеленый цвет), 3-й пассаж. Флуоресцентная микроскопия
Рис. 2. Количество метаболически активных клеток роговичного эпителия после стимуляции 3 производными крови: сывороткой; плазмой, обогащенной факторами роста (ПОбФР); обогащенной тромбоцитами плазмой (ОбТП). Время инкубации: 24 ч., 48 ч. Оценка пролиферации формазановым тестом в одноступенчатой модификации
конфлюэнтности была нанесена дозированная «царапина» носиком пипетки. Динамику заживления раны монослоя оценивали через 6, 17 и 24 ч. после внесения стимуляторов.
Статистический анализ
Статистический анализ полученных результатов проводили с применением программного пакета GraphPad Prism 5. Достоверность различий оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни при уровне значимости р<0,05.
Результаты
С помощью иммуноцитохимии были обнаружены маркеры клеток роговицы эпителия — цитокератины (СК3, СК19) (рис. 1), что соответствует данным других авторов [28].
Количество метаболически активных клеток после воздействия стимуляторов, которое оценивали колориметрическим тестом, различалось между группами (рис. 2): количество клеток через 24 ч. инкубации с плазмой, обогащенной факторами роста, было наибольшим и статистически значимо отличалось от количества клеток в контроле (без добавления стимуляторов) и количества клеток, стимулированных сывороткой и обогащенной тромбоцитами плазмой. Через 48 ч. инкубации количество клеток увеличилось во всех группах. Наибольший прирост был зафиксирован в культуре клеток, инкубированных с плазмой, обогащенной факторами роста,
наименьший — в культуре клеток, стимулированных обогащенной тромбоцитами плазмой. Стимуляция сывороткой не привела к значимым отличиям показателей от контрольной группы.
Миграционный тест на зарастание раны монослоя не выявил значимых различий в скорости закрытия дефекта между группами. Вероятно, время наблюдения было недостаточно, чтобы эффект от количественного прироста клеток оказал влияние на эффективность закрытия «раны». Начало активной миграции в группах со стимуляторами было зафиксировано через 6 ч. Через 24 ч. во всех образцах эпителиоциты полностью заполнили оголенную поверхность (рис. 3). Размер, форма и распластанность клеток в зоне повреждения оказались значительно ближе к таким характеристикам для зрелых эпителиоцитов в культуре клеток, стимулированных производными крови, чем в контроле, где клетки имели более вытянутую и вере-теновидную форму. Это позволяет предположить, что в присутствии производных крови пласт эпителиоцитов будет лучше выполнять барьерную функцию.
Обсуждение
Препараты, использованные в настоящем исследовании, применяются в офтальмологии в качестве терапевтических агентов при заболеваниях глазной поверхности. Состав глазных капель на основе производных крови является схожим, однако есть и важные отличительные моменты, которые и могут обуславливать наблюдаемые в эксперименте различия.
Рис. 3. Динамика заживления раны эпителиального монослоя через 0, 6, 17 и 24 ч. после внесения стимуляторов — сыворотки; обогащенной тромбоцитами плазмы (ОбТП); плазмы, обогащенной факторами роста (ПОбФР) — в культуральную среду
Основным принципиальным моментом, отличающим один продукт от другого, является дегрануляция тромбоцитов, приводящая к высвобождению всего пула содержащихся в них биологически активных субстанций. В сыворотке этот процесс запускается самопроизвольно каскадом реакций. При наличии же антикоагулянта необходимо активировать процесс или разрушить тромбоциты с помощью процедуры замораживания-размораживания. В противном случае массивной дегрануляции тромбоцитов не происходит. В нашем случае для получения плазмы, обогащенной факторами роста, мы стимулировали их высвобождение из гранул тромбоцитов добавлением хлорида кальция. Вероятно, с этим связан наибольший эффект плазмы, обогащенной факторами роста, на пролиферацию эпителия — в составе этой композиции должна быть максимальная концентрация факторов роста, высвобождаемая в момент активации тромбоцитов. В то время как в обогащенной тромбоцитами плазме эти факторы изначально находятся в гранулах тромбоцитов и высвобождаются из них частями и в течение длительного времени, что также может быть востребовано в клинике, например в случае необходимости поддерживать высокую концентрацию стимулятора долгое время. Однако для выяснения этого феномена необходимы дополнительные исследования динамики высвобождения факторов роста из гранул тромбоцитов.
Данные, полученные в нашем исследовании, сопоставимы с результатами работ Н.С. Сергеевой с соавт. (2014) и Е.Ю. Рогульской с соавт. (2014), тестировавших эффект тромбоцитарного лизата на клеточные культуры в сравнении с эмбриональной сывороткой [26, 27].
Однако следует отметить, что термоинактивация тромбоцитарного продукта в нашей работе не приводила
к потере его биологической активности, в то время как в исследовании Н.С. Сергеевой с соавт. (2014) лизат тромбоцитов переставал поддерживать пролиферацию в культуре клеток после нагревания до 56 °C в течение 30 мин. [26]. Возможно, наблюдаемые различия связаны с типом клеток, использованных в работе, или со способом активации тромбоцитов.
Несмотря на то, что к настоящему времени нет утвердившегося протокола получения препаратов крови на основе тромбоконцентратов и консенсуса по вопросу необходимости их «активации» перед применением, и, кроме того, устройства для получения обогащенной тромбоцитами плазмы сильно различаются по эффективности, есть немало работ, демонстрирующих высокую клиническую эффективность препаратов крови в лечении поражений роговицы различной этиологии. К. Kim с соавт. (2012) показали, что уровень EGF в обогащенной тромбоцитами плазме был значительно выше, чем в сыворотке, и скорость заживления эпителиального дефекта роговицы также была выше [29].
В исследовании S.López-Plandolit c соавт. (2010) закапывание плазмы, обогащенной факторами роста, при ПЭД привело к закрытию дефектов в 85% случаев [30]. M. Abu-Ameerh с соавт. (2018) зафиксировали полную реэпителизацию в течение 28 сут. в 70% случаев [31]. C. Huang с соавт. (2017) оценили эффективность двух коммерческих препаратов на основе лизата тромбоцитов и сравнили результаты с данными, полученными при применении других производных крови — сыворотки периферической крови человека и бычьей эмбриональной сыворотки [32]. Более высокие уровни эпителиального фактора роста (EGF), TGF-p и фибронектина были выявлены в препаратах тромбоцитов, а скорость заживления роговицы в исследованиях как in vitro, так и in vivo
была выше по сравнению с использованием других производных крови [32]. В отечественной литературе также есть многочисленные публикации об эффективности применения препаратов на основе тромбоцитов в офтальмологии. Н.В. Боровкова с соавт. (2020) использовали для ускорения эпителизации при ПЭД после кератопластики инстилляции лизата обогащенной тромбоцитами плазмы в качестве дополнения к основной традиционной терапии и у всех пациентов была отмечена полная эпителизация [33]. А.О. Лошкарева и Д.Ю. Майчук (2016) изучали эффективность еженедельных субконъюнктивальных инъекций обогащенной тромбоцитами плазмы в лечении стойких постгерпетических эпителиальных дефектов: полная эпителизация была достигнута у 54% пациентов, у 28% была отмечена положительная динамика с постепенной эпителизацией дефектов, а у 1% пациентов реакция на введение препарата отсутствовала [34].
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Shimazaki J., Saito H., Yang H.Y. et al. Persistent epithelial defect following penetrating keratoplasty: an adverse effect of diclofenac eyedrops. Cornea 1995; 14(6): 623-7.
2. Mc Culley J.P., Horowitz B., Husseini Z.M. et al. Topical fibronec-tin therapy of persistent corneal epithelial defects. Fibronectin Study Group. Transactions of the American Ophthalmological Society 1993; 91: 367-90.
3. Erdem E., Yagmur M., Harbiyeli I. et al. Umbilical cord blood serum therapy for the management of persistent corneal epithelial defects. International journal of ophthalmology 2014; 7(5): 807-10.
4. Fu Y., Liu J., Tseng S.C. Ocular surface deficits contributing to persistent epithelial defect after penetrating keratoplasty. Cornea 2012; 31(7): 723-9.
5. Vaidyanathan U., Hopping G.C., Liu H.Y. et al. Persistent Corneal Epithelial Defects: A Review Article. Med. Hypothesis Discov. Innov. Ophthalmol. 2019; 8(3): 163-76.
6. Ljubimov A.V., Saghizadeh M. Progress in corneal wound healing. Prog. Retin. Eye Res. 2015; 49: 17-45.
7. Stramer B.M., Zieske J.D., Jung J.C. et al. Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: Implications for surgical outcomes. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003; 44: 4237-46.
8. Khodadoust A.A., Silverstein A.M., Kenyon D.R. et al. Adhesion of regenerating corneal epithelium. The role of basement membrane. Am.J. Ophthalmol. 1968; 65(3): 339-48.
9. Torricelli A.A.M., Singh V., Agrawal V. et al. Transmission electron microscopy analysis of epithelial basement membrane repair in rabbit corneas with haze. Invest. Ophth. Vis. Sci. 2013; 54: 4026-33.
10. Torricelli A.A.M., Singh V., Santhiago M.R. et al. The corneal epithelial basement membrane: Structure, function and disease. Invest. Ophth. Vis. Sci. 2013; 54: 6390-400.
11. Singh V., Jaini R., Torricelli A.A. et al. TGFp and PDGF-B signaling blockade inhibits myofibroblast development from both bone marrow-derived and keratocyte-derived precursor cells in vivo. Exp. Eye Res. 2014; 121: 35-40.
12. Wilson S.E., He Y.G., Weng J. et al. Epithelial injury induces kerato-cyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Exp. Eye Res. 1996; 62(4): 325-7.
13. Wilson S.E., Medeiros C.S., Santhiago M.R. et al. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after PRK and other corneal injuries. J. Refract. Surg. 2018; 34(1): 59-64.
14. Li D.Q., Lokeshwar B.L., Solomon A. et al. Regulation of MMP-9 production by human corneal epithelial cells. Exp. Eye Res. 2001; 73(4): 449-59.
15. Sivak J.M., Fini M.E. MMPs in the eye: emerging roles for matrix metalloproteinases in ocular physiology. Prog. Retin. Eye Res. 2002; 21(1): 1-14.
16. Wilson S.E., Mohan R.R., Ambrosio R.Jr. et al. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Prog. Retin. Eye Res. 2001; 20(5): 625-37.
17. Girard M.T., Matsubara M., Fini M.E. et al. Transforming growth factor-beta and interleukin-1 modulate metalloproteinase expression by corneal stromal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1991; 32(9): 2441-54.
18. Etulain J. Platelets in wound healing and regenerative medicine. Platelets 2018; 29(6): 556-68.
19. Lopez-Plandolit S., Morales M.C., Freire V. et al. Plasma rich in growth factors as a therapeutic agent for persistent corneal epithelial defects. Cornea 2010; 29(8): 843-8.
Накопление знаний о биологических эффектах препаратов тромбоцитов на различные клеточные культуры позволит в будущем подобрать оптимальные композиции таких препаратов, а также способы и частоту их применения для каждой нозологической формы.
Заключение
В представленной работе наибольшее стимулирующее действие на пролиферацию клеток из трех опробованных композиций оказала плазма, обогащенная факторами роста. Все стимуляторы приводили к тому, что клетки после обработки ими приобретали форму, характерную для эпителия, в отличии от контрольной группы. Таким образом, использование производных крови может положительно влиять на процессы эпителизации при ПЭД. Однако для выбора наиболее перспективного стимулятора необходимо проведение дополнительных исследований.
20. Abu-Ameerh M.A., Jafar H.D., Hasan M.H. et al. Platelet lysate promotes re-eplthellallzatlon of persistent epithelial defects a pilot study. International ophthalmology 2018; 39(10): 1-8.
21. Tsubota K., Goto E., Shimmura S. et al. Treatment of persistent corneal epithelial defect by autologous serum application. Ophthalmology 1999; 106: 1984-9.
22. Liu L., Hartwig D., Harloff S. et al. An optimized protocol for the production of autologous serum eye drops. Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2005; 243(7): 706-14.
23. Dhurat R., Sukesh M. Principles and Methods of Preparation of Platelet-Rich Plasma: A Review and Author's Perspective. J. Cutan. Aes-thet. Surg. 2014; 7(4): 189-97.
24. Freire V., Andollo N., Etxebarria J. et al. In vitro effects of three blood derivatives on human corneal epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2012; 53(9): 5571-8.
25. Giusti I., D'Ascenzo S., Macchiarelli G. et al. In vitro evidence supporting applications of platelet derivatives in regenerative medicine. Blood Transfus. 2020; 18(2): 117-29.
26. Рогульская Е.Ю., Ревенко Е.Б., Петренко Ю.А. и др. Пролифе-ративно-дифференцировочный потенциал мультипотентных мезен-химальных стромальных клеток жировой ткани при культивировании в присутствии тромбоцитарного лизата. Гены & Клетки 2014; 9(2): 63-7. [Rogulska O.Yu., Revenko О.В., Petrenko Yu.A. et al. Proliferative and differentiation potential of adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate. Genes & Cells 2014; 9(2): 63-7].
27. Сергеева Н.С., Шанский Я.Д., Свиридова И.К. и др. Биологические эффекты тромбоцитарного лизата при добавлении в среду культивирования клеток человека. Гены & Клетки 2014; 9(1): 77-85. [Sergeeva N.S., Shanskiy Y.D., Sviridova I.K. et al. Biological effects of platelet lysate added to cultural medium of human cells. Genes & Cells 2014; 9(1): 77-85.]
28. Harkin D.G., Barnard Z., Gillies P. et al. Analysis of p63 and cytokera-tin expression in a cultivated limbal autograft used in the treatment of limbal stem cell deficiency. Br.J. Ophthalmol. 2004; 88(9): 1154-8.
29. Kim K.M., Shin Y.T., Kim H.K. Effect of autologous platelet-rich plasma on persistent corneal epithelial defect after infectious keratitis. Japanese journal of ophthalmology 2012; 56(6): 544-50.
30. Lopez-Plandolit S., Morales M.C., Freire V. et al. Plasma rich in growth factors as a therapeutic agent for persistent corneal epithelial defects. Cornea 2010; 29(8): 843-8.
31. Abu-Ameerh M.A., Jafar H.D., Hasan M.H. et al. Platelet lysate promotes re-epithelialization of persistent epithelial defects a pilot study. International ophthalmology 2019; 39(7): 1483-90.
32. Huang C.J., Sun Y.C., Christopher K. et al. Comparison of corneal epitheliotrophic capacities among human platelet lysates and other blood derivatives. PloS One 2017; 12(2): 1-16.
33. Боровкова Н.В., Филатова И.А., Ченцова Е.В. и др. Эффективность применения лизата богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) у пациентов с эрозией роговицы или посттравматическим рубцеванием тканей век. Российский офтальмологический журнал 2020; 13(3): 8-14. [Borovkova N.V., Filatova I.A., Chentsova E.V. et al. Efficacy of platelet-rich plasma lysate in patients with corneal erosion or post-traumatic scarring of the tissues of the eyelids. Russian Ophthalmological Journal 2020; 13(3): 8-14.]
34. Лошкарева А.О., Майчук Д.Ю. Применение богатой тромбоцитами плазмы у пациентов с хроническими эрозиями роговицы. Современные технологии в офтальмологии 2016; 4: 131-2. [Loshkareva A.O., Maychuk D.Yu. Use of Platelet-rich Plasma in Patients with Chronic Corneal Erosions. Modern Technologies in Ophthalmology 2016; 4: 131-2.]
