CC BY
12
УДК 581.143.6:638.111
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННЫХ ГОРМОНОВ В ЗАВЯЗЯХ ПШЕНИЦЫ И ОДУВАНЧИКА В ПЕРИОД АКТИВНОСТИ ЯЙЦЕКЛЕТКИ
М.А. Гусаковская, А.Н. Блинцов, А.Ф. Лебедева
(кафедра физиологии растений; e-mail: [email protected])
По мнению многих исследователей, уникальное положение цветковых в царстве растений, подобное положению млекопитающих в царстве животных, обусловлено прежде всего уникальной системой репродукции, включающей четыре интегрированных один в другой органа: зародышевый мешок, семяпочка, завязь, цветок. Зрелый зародышевый мешок содержит три группы клеток: яйцевой аппарат (яйцеклетка и синергиды), центральная клетка и антиподальный аппарат (антиподы). При этом как синергиды, так и антиподы могут быть редуцированы частично или полностью. Необходимыми элементами зародышевого мешка являются яйцеклетка и центральная клетка. По окончании созревания зародышевого мешка яйцеклетка переходит в состояние относительного покоя, вывести из которого ее может, по-видимому, лишь внешний по отношению к ней сигнал. Метаболически наиболее активной становится центральная клетка.
Период репродуктивного процесса цветковых от момента выхода яйцеклетки из состояния покоя до момента начала ее первого деления играет в репродуктивном процессе цветковых исключительно важную роль, поскольку в нем происходят два центральных события этого процесса: оплодотворение центральной клетки и оплодотворение яйцеклетки. Первое инициирует начало эндоспермогенеза, второе — начало эмбриогенеза. Уникальная структура зародышевого мешка, таким образом, связана с его уникальной функцией — обеспечение двух оплодотворений и развития эндосперма и зародыша.
Указанный период удобно назвать периодом активности яйцеклетки. В его начале яйцеклетка есть одна из клеток зародышевого мешка, в его конце она есть одноклеточный проэмбрио.
На морфологическом уровне признаком начала периода активности яйцеклетки можно считать образование лузы — щелевидного межклеточного ком-партмента зародышевого мешка между яйцеклеткой и центральной клеткой, в котором оказываются два спермия перед началом двух оплодотворений. К общим закономерностям в последующих событиях можно отнести:
1) одновременное начало оплодотворения центральной клетки и яйцеклетки;
2) более раннее окончание оплодотворения центральной клетки и более позднее окончание оплодотворения яйцеклетки;
3) более раннее начало эндоспермогенеза (деление ядра оплодотворенной центральной клетки) и более позднее начало эмбриогенеза (деление ядра оплодотворенной яйцеклетки);
4) более быстрый темп ядерных или клеточных делений в развивающемся эндосперме и более медленный темп клеточных делений в развивающемся зародыше;
5) отсутствие в эндосперме признаков дифференциации тканей и органов, аналогичных наблюдаемым в зародыше.
Вследствие описанных закономерностей к моменту окончания периода активности яйцеклетки, когда последняя находится в состоянии одноклеточного проэмбрио, эндосперм находится в состоянии сравнительно недифференцированной массы, представленной, в общем случае, одноядерными и многоядерными клетками.
Согласно классическим представлениям, на ранних этапах эмбриогенеза эндосперм выполняет трофическую функцию по отношению к зародышу. Согласно современным представлениям, эта его функция — не единственная и, скорее всего, не первичная (в филогенетическом отношении).
Описанный ход репродуктивного процесса характерен для цветковых, называемых амфимиктами. Амфимиктом является, например, пшеница (Triti-cum aestivum).
У цветковых, называемых апомиктами, оплодотворение яйцеклетки может отсутствовать. Тем не менее апомиктическая яйцеклетка, как и амфимик-тическая яйцеклетка, выходит из состояния покоя, приступает к делению, формирует нормальный зародыш, и репродуктивный процесс протекает далее и заканчивается так же как и у амфимиктов. Неясно, существуют ли облигатные апомикты, размножающиеся только амфимиктически. Большинство известных апомиктов являются факультативными, они способны размножаться как апомиктически, так и амфимиктически. К немногим изученным в данном отношении цветковым, у которых пока не обнаружено достоверных случаев амфимиксиса, принадлежит, например, одуванчик (Taraxacum officinale).
Вопрос об источнике и природе сигнала, побуждающего яйцеклетку выйти из состояния покоя и продолжить развитие в зародыш без оплодотворения, быш поставлен Хаберландгом (Haberlandt, 1921). Наблюдая случаи деления яйцеклетки у некоторых апомиктов после укола иголкой завязи, Хаберландт высказал три гипотезы:
1) сигнал, побуждающий яйцеклетку к делению, по отношению к семяпочке является экзогенным, приходящим в нее из завязи по проводящим пучкам;
2) сигнал этот носит гормональный характер;
3) рассматриваемый гормон специфичен; его продуцирует клетка или клетки завязи, подвергающиеся некрозу.
Среди открытых позже шести групп веществ, выполняющих роль фитогормонов (ауксины, цито-кинины, гиббереллины, абсцизины, этилен, брасси-ны), специфического некрогормона обнаружить не удалось, в связи с чем теория Хаберландта была отклонена.
На сегодня существует множество фактов, позволяющих утверждать, что репродуктивный процесс находится под контролем гормональной системы растительного организма. Однако о принципах работы этой системы и о взаимодействии составляющих ее экзогенных и эндогенных подсистем в последовательности "растение ^ цветок ^ завязь ^ ^ семяпочка ^ зародышевый мешок ^ ..." известно очень мало.
Показано, что при воспроизведении растений в культуре ход морфогенеза (эмбриоидогенез, эмбриогенез, органогенез, гистогенез) зависит от присутствующих в культивирующей среде гормонов (статус) и их пропорций (баланс), в частности от пропорции "ауксины/цитокинины" (Батыгина, 1987). Объединяя статус и баланс в понятие "гормональный ключ", можно сказать, что он открывает тот или иной путь морфогенеза in vitro. Возникает естественный вопрос: не открывает ли гормональный ключ путь эмбриогенеза in vivo и не он ли определяет путь репродукции (амфимиктический, апомиктический)? Не является ли справедливой вторая гипотеза теории Хаберландта? Чтобы ответить на эти вопросы, нужны факты. И прежде всего — данные о статусе и балансе гормонов в завязи, семяпочке и зародышевом мешке в период активности яйцеклетки.
Получению указанных данных препятствуют две трудности. Во-первых, чем меньше орган, тем труднее определять его гормональный статус и баланс. Современные методы позволяют определить наличие фитогормона при большом его количестве, в большой массе материала и с большой ошибкой. Во-вторых, период активности яйцеклетки сравнительно краток. Получение достаточного количества материала, который можно было бы с достаточной вероятностью отнести именно к этому периоду, — отдельная и трудоемкая проблема. Xian Sheng Zhang
и O'Neill (1993) показали, что в завязи Phalaenopsis shillerana после попадания пыльцы на рыльце начинается ауксин-зависимый синтез этилена. Но здесь речь идет о периоде на порядок более длительном, чем обычный период активности яйцеклетки (например, у пшеницы и одуванчика).
До первых наших работ (Гусаковская и др., 1998) данных о том, какие именно гормоны присутствуют в завязи в период активности яйцеклетки, в каких количествах, как они распределены в ней и меняется ли это распределение, не было. Для того чтобы получить эти данные, нами была предложена, разработана и тестирована модификация метода ELISA — в сущности, новый (дифференциальный) метод иммуноферментного анализа. Метод позволил снять часть трудностей, а также повысить разрешимость и точность.
Настоящая работа посвящена изложению и обсуждению полученных нами в 1998—2005 гг. данных о распределении и изменении распределения активной и связанной форм ауксинов, цитокининов и абсцизинов в завязях пшеницы и одуванчика в период активности яйцеклетки. Распределение устанавливали по четырем пространственным областям, изменение распределения — по трем временным стадиям. За области были приняты семяпочка и апикальная, медиальная и базальная области завязи (за вычетом семяпочки), полученные двумя ее поперечными сечениями. За временные стадии были приняты начало, середина и конец периода активности яйцеклетки, определяемые морфологически соответственно по: 1) наличию лузы и отсутствию признаков деления центральной клетки; 2) наличию многоядерного или многоклеточного эндосперма и отсутствию признаков деления яйцеклетки; 3) наличию признаков деления яйцеклетки.
Материал и методы
В качестве объектов исследования были выбраны амфимиктический вид Triticum aestivum L. (пшеница) и апомиктический вид Taraxacum officinale Web. (одуванчик).
Пшеница. Семена пшеницы сорта Саратовская 29 подвергали отбору на однородность, засевали и выращивали в теплице при температуре 18—20° днем и 14—16° ночью при продолжительности светового дня 16—18 ч. В колосьях во время пыления брали колоски из средней части, в колоске — два нижних цветка. Отобранные цветки по внешнему виду делили на три группы: 1) со зрелыми, но еще не раскрывшимися пыльниками; 2) с раскрывшимися пыльниками, но без признаков увядания цветка; 3) с признаками увядания цветка. Предполагали, что группы соответствуют трем стадиям периода активности яйцеклетки. Завязи отделяли от цветков и выделяли из них семяпочки. Выборочный морфологический контроль зародышевых мешков, проведенный по стандартной методике (Пирс,
1956; Паушева, 1974; Куперман и др., 1978) подтвердил сделанное предположение.
После выделения семяпочки оставшуюся часть завязи рассекали двумя поперечными разрезами по границе выделенной семяпочки, получая три части: базальную, прилегающую к цветоложу; апикальную, прилегающую к основанию столбика; медиальную, остающуюся после отделения указанных частей.
Говоря о поперечных сечениях, мы имеем в виду их ортогональность главной оси завязи. Фундаментальная роль этой оси в организации морфо-физиологических процессов, протекающих в завязи, хорошо известна. Мы предполагали, что в период активности яйцеклетки вдоль главной оси существуют гормональные градиенты и что мы сможем их обнаружить.
Одуванчик. Материал брали на делянке Ботанического сада МГУ, отбирая корзинки с нераспустившимися цветками. Из корзинки вырезали средний кольцевой трапециевидный сегмент. Цветки распределяли по высоте на три группы: 6—7, 7—8 и 8—9 мм. После отделения завязей в группах оставляли завязи с длиной 0,7—0,8, 0,8—0,9 и 0,9—1,0 мм соответственно. Предполагали, что полученные группы соответствуют трем стадиям периода активности яйцеклетки. Выборочный морфологический контроль подтвердил это предположение.
После выделения семяпочки оставшуюся часть завязи делили по процедуре, подобной вышеописанной.
По характеру основного действия фитогормо-ны можно разложить на три класса и условно назвать их ускоряющими (ауксины, цитокинины, гиб-береллины), тормозящими (абсцизины, этилен) и дифференцирующими (брассины) (Либберт, 1976). Мы ограничились определением в отобранном материале свободной и связанной форм двух ускоряющих (ауксины, цитокинины) и одного тормозящего (абсцизины) гормонов.
Основным действием ауксинов принято считать ускорение процесса роста клеток, цитокининов — ускорение процесса их деления, абсцизинов — торможение обоих процессов. Тройку "ауксины, цитокинины, абсцизины", таким образом, можно рассматривать как подходящую в первом приближении модель для анализа работы системы гормональной регуляции репродуктивного процесса в период активности яйцеклетки, если, конечно, такая система существует. Мы предполагали, что нам удастся получить доказательства ее существования.
Концентрацию гормонов мы определяли разработанным нами дифференциальным методом им-муноферментного анализа. При работе, например, с цитокининами этот метод обладает следующими достоинствами:
1) отсутствие сильного влияния макрокомпонентов растительных экстрактов на результаты определения;
2) отсутствие метаболизации исходных форм цитокининов;
3) высокая специфичность определения в присутствии сахаров, характерных для растительных экстрактов;
4) специфичность по отношению к зеатину и зеатинрибозиду, существенно превышающая специфичность по отношению к дигидрозеатину и изопентениладенину;
5) способность работать на фоне помех в виде О- и 7М-глюкозидов;
6) гарантированная при работе на линейных участках калибровочных кривых, чувствительность по зеатинрибозиду в диапазоне (3,0—5,0) х 10-11 М при относительной ошибке, не превышающей 12%.
Аналогичными достоинствами метод обладает и при определении концентрации абсцизинов и цитокининов. С меньшей или большей подробностью он описан в ряде работ, указанных в списке литературы (Гусаковская и др., 1998; Гусаков-ская, Блинцов и др., 2000; Блинцов, Гусаковская, 2000; Гусаковская, Блинцов, 2001а; Гусаковская, Блинцов, 2001б; Гусаковская, Блинцов, 2001в; Гусаковская, Блинцов, 2001г; Блинцов и др., 2001; Гусаковская, Блинцов, 2002; Блинцов, Гусаковская, 2002; Гусаковская, Блинцов, 2003а; Гусаковская, Блинцов, 2003б; Блинцов, Гусаковская, 2004; Гусаковская, Блинцов, 2004а; Гусаковская, Блинцов и др., 2004; Гусаковская, Блинцов, 2004б; Гусаков-ская, Блинцов, 2005; Блинцов и др., 2005; Гусаковская, Блинцов, 2006а; Гусаковская, Блинцов, 2006б; Блинцов, Гусаковская, 2006).
Результаты и обсуждение
В период активности яйцеклетки у пшеницы и одуванчика завязь и ее подсистемы (в частности, семяпочка и зародышевый мешок) полностью сформированы, активно делящихся клеток здесь нет (за исключением антипод), основными процессами являются процессы роста клеток. Поэтому, возможно, уровень концентрации связанных ауксинов в завязи и ее областях заметно превышает уровни концентрации связанных цитокининов и абсцизинов.
Связанные абсцизины распределены в завязи по областям и стадиям почти равномерно. Их сравнительно мало. Заметно более высокий уровень концентрации характерен для свободных абсцизинов. Причем в распределении последних наблюдается хорошо выраженное убывание вдоль главной оси (от базальной области к апикальной).
Отсутствие в завязи пшеницы областей с концентрацией свободных абсцизинов на уровне 3,0 говорит, возможно, о том, что примерно такой уровень является пороговым для перехода абсцизинов из связанного состояния в свободное. Если так, то отсутствие в завязи одуванчика областей с концентрацией свободных абсцизинов на уровне 2,0 естественно интерпретировать аналогичным образом.
Таблица 1
Распределение связанных и свободных абсцизинов по областям и стадиям
Область Концентрация связанных абсцизинов Концентрация свободных абсцизинов
стадия стадия
1 2 3 1 2 3
Пшеница
0. Завязь 2,6 ±0,5 2,4 ± 0,4 2,7 ± 0,6 10,4 ± 1,8 9,2 ± 1,7 4,5 ± 0,8
1. Базальная 2,1 ±0,4 2,7 ± 0,6 2,5 ± 0,5 9,6 ± 1,7 10,1 ± 2,1 9,3 ± 1,7
2. Медиальная 2,4 ±0,5 2,6 ± 0,6 2,3 ± 0,4 12,7 ± 2,4 9,1 ±2,1 2,9 ± 0,5
3. Семяпочка 2,5 ±0,5 2,3 ± 0,5 2,7 ± 0,6 11,8 ± 2,6 8,3 ± 1,7 3,2 ± 0,7
4. Апикальная 2,3 ±0,5 2,1 ±0,4 2,7 ± 0,6 3,8 ± 0,7 3,2 ± 0,6 2,8 ± 0,6
Одуванчик
0. Завязь 1,4 ± 0,4 1,6 ± 0,5 1,8 ± 0,6 8,4 ± 1,7 9,6 ± 2,0 6,3 ± 1,1
1. Базальная 1,1 ± 0,4 1,8 ± 0,6 1,4 ± 0,5 10,4 ± 1,9 10,1 ± 1,8 9,8 ± 1,8
2. Медиальная 1,5 ± 0,4 1,3 ± 0,4 1,8 ± 0,5 10,8 ± 2,1 11,3 ± 2,0 6,7 ± 1,2
3. Семяпочка 1,2 ± 0,4 1,5 ± 0,5 1,7 ± 0,6 9,4 ± 1,7 10,7 ± 1,9 5,2 ± 0,9
4. Апикальная 1,4 ± 0,5 1,7 ± 0,5 1,8 ± 0,6 4,8 ± 0,8 4,6 ± 0,8 4,5 ± 0,9
Численный элемент аЪ8ц (табл. 2) можно интерпретировать как вероятность перехода молекулы свободных абсцизинов из связанного состояния в свободное в 1-й области на _|-й стадии. В связи с этим отметим два обстоятельства:
1) при (1, 1) < (1, ]) < < (4, 3) у пшеницы 0,84 > > аЪ8щ > 0,51, у одуванчика
0.90 > аЪ^ > 0,71;
2) с возрастанием тех же
1, ) аЪ8у имеет тенденцию к убыванию; иными словами, с продвижением по главной оси и с продвижением по времени вероятность перехода связанных абсцизинов в свободные, вообще говоря, снижается.
Поскольку основное физиологическое действие абс-цизины осуществляют, находясь в свободном (активном) состоянии, естественно обратить внимание на относительное количество свободных абс-цизинов, т.е. на распределение по областям и стадиям отношения аЪв = свободные абс-цизины/(связанные + свободные абсцизины).
Таблица 2
Распределение относительного содержания аЬБ свободных абсцизинов по областям и стадиям
Таблица 3
Распределение связанных и свободных ауксинов по областям и стадиям
Область Стадия
1 2 3
Пшеница
0. Завязь 0,80 0,79 0,62
1. Базальная 0,82 0,79 0,78
2. Медиальная 0,84 0,78 0,56
3. Семяпочка 0,82 0,78 0,54
4. Апикальная 0,62 0,60 0,51
Одуванчик
0. Завязь 0,86 0,86 0,78
1. Базальная 0,90 0,85 0,87
2. Медиальная 0,88 0,90 0,79
3. Семяпочка 0,89 0,88 0,75
4. Апикальная 0,77 0,73 0,71
Область Концентрация связанных ауксинов Концентрация свободных ауксинов
стадия стадия
1 2 3 1 2 3
Пшеница
0. Завязь 11,2 ±2,3 11,3 ± 2,0 12,5 ± 2,3 8,2 ± 1,5 2,3 ± 0,5 5,1 ± 0,9
1. Базальная 12,7 ± 2,4 13,2 ±2,5 13,6 ± 2,6 9,1 ± 1,8 6,9 ± 1,4 7,8 ± 1,5
2. Медиальная 9,7 ± 1,8 10,5 ± 1,9 10,8 ± 2,0 6,7 ± 1,3 1,8 ± 0,4 3,7 ± 0,6
3. Семяпочка 9,4 ± 1,9 9,8 ± 2,0 10,1 ± 2,0 6,3 ± 1,0 1,5 ± 0,3 3,0 ± 0,5
4. Апикальная 8,7 ± 1,7 9,0 ± 1,8 9,4 ± 1,9 5,5 ± 1,0 4,1 ± 0,8 4,9 ± 0,9
Одуванчик
0. Завязь 14,7 ± 2,9 13,9 ± 2,7 15,2 ±3,1 10,3 ± 2,1 5,2 ± 0,9 7,4 ± 1,3
1. Базальная 15,1 ± 3,0 15,6 ± 3,1 16,6 ± 3,2 11,7 ± 2,3 8,1 ± 1,6 9,4 ± 1,9
2. Медиальная 13,6 ± 2,7 14,1 ± 2,8 14,5 ± 2,9 8,1 ± 1,5 3,7 ± 0,7 6,1 ± 1,1
3. Семяпочка 12,9 ± 3,0 13,4 ±2,7 13,9 ± 2,8 7,8 ± 1,5 3,2 ± 0,6 5,5 ± 1,0
4. Апикальная 11,4 ±2,2 12,1 ± 2,3 13,0 ± 2,5 6,3 ± 1,2 5,8 ± 1,1 6,0 ± 1,2
Переходя к распределению по областям и стадиям отношения aux = свободные ауксины/(связанные + свободные ауксины), получаем следующую картину:
Таблица 4
Распределение относительного содержания аих-свободных ауксинов по областям и стадиям
Область Стадия Область Стадия
1 2 3 1 2 3
Пшеница Одуванчик
0. Завязь 0,58 0,83 0,71 0. Завязь 0,59 0,73 0,67
1. Базальная 0,58 0,66 0,63 1. Базальная 0,56 0,66 0,64
2. Медиальная 0,59 0,85 0,74 2. Медиальная 0,63 0,79 0,70
3. Семяпочка 0,60 0,87 0,77 3. Семяпочка 0,62 0,81 0,72
4. Апикальная 0,61 0,69 0,66 4. Апикальная 0,64 0,68 0,68
При (1, 1) < (i, j) < (3, 2) auxjj возрастает как по i, так и по j, как у пшеницы, так и у одуванчика. При этом у пшеницы aux возрастает на 0,29, от 0,58 до 0,87, а у одуванчика — на 0,25, от 0,56 до 0,81. Близость первых трех чисел к трем последним, возможно, не случайна и отражает какую-то общую закономерность, не зависящую или слабо зависящую от специфики вида.
Исходя из сказанного выше о соотношении процессов роста и деления клеток в завязи в период активности яйцеклетки, кажется логичным предположить, что при тех же i, j absij должно вести себя столь же закономерно и убывать как по i, так и по j, как у пшеницы, так и у одуванчика. Если эта закономерность в abs не просматривается столь явно, как в aux, то, возможно, это связано с большими ошибками. Действительно, уровень концентрации связанных абсцизинов, как мы отмечали, заметно меньше уровня концентрации связанных ауксинов и, следовательно, относительные ошибки определения abs должны быть больше относительных ошибок определения aux.
Таблица 5
Распределение связанных и свободных цитокининов по областям и стадиям
Область Концентрация связанных цитокининов Концентрация свободных цитокининов
стадия стадия
1 2 3 1 2 3
Пшеница
0. Завязь 0,3 ± 0,1 1,9 ± 0,4 0,8 ± 0,2 1,7 ± 0,3 1,3 ± 0,2 5,0 ± 0,9
1. Базальная 1,1 ± 0,2 1,7 ± 0,3 1,3 ± 0,2 1,0 ± 0,2 2,1 ± 0,5 3,6 ± 0,7
2. Медиальная 0,5 ± 0,1 1,4 ±0,2 1,2 ±0,2 1,4 ±0,3 1,6 ± 0,3 5,8 ± 0,9
3. Семяпочка 1,4 ±0,2 1,3 ± 0,2 0,5 ± 0,1 0,2 ±0,1 0,7 ± 0,2 1,2 ± 0,2
4. Апикальная 0,8 ± 0,2 1,4 ±0,2 0,7 ± 0,2 0,6 ± 0,2 1,2 ±0,2 2,7 ± 0,5
Одуванчик
0. Завязь 2,2 ±0,4 6,7 ± 1,2 3,4 ±0,6 3,2 ±0,6 5,5 ± 1,0 8,9 ± 1,6
1. Базальная 3,2 ±0,3 5,0 ± 0,9 2,7 ± 0,5 2,8 ± 0,6 7,3 ± 1,4 8,9 ± 1,8
2. Медиальная 2,0 ± 0,4 6,2 ± 1,2 3,7 ± 0,6 2,5 ± 0,6 5,0 ± 0,9 7,5 ± 1,4
3. Семяпочка 8,0 ± 1,4 4,3 ± 0,7 1,6 ± 0,3 3,8 ± 0,7 6,8 ± 1,4 9,7 ± 1,8
4. Апикальная 3,7 ± 0,7 5,0 ± 1,0 2,6 ± 0,6 2,4 ± 0,6 5,2 ± 1,0 8,5 ± 1,6
Здесь закономерности, подобные отмеченным для ауксинов и абсцизинов, не просматриваются. Не просматриваются они и в картине распределения по областям и стадиям отношения су1 = свободные цито-кинины/(связанные + свободные цитокинины).
Та б л и ц а 6
Распределение относительного содержания су1-свободных цитокининов по областям и стадиям
Область Стадия Область Стадия
1 2 3 1 2 3
Пшеница Одуванчик
0. Завязь 0,85 0,41 0,85 0. Завязь 0,59 0,79 0,62
1. Базальная 0,47 0,51 0,73 1. Базальная 0,47 0,60 0,77
2. Медиальная 0,74 0,53 0,83 2. Медиальная 0,54 0,45 0,67
3. Семяпочка 0,13 0,34 0,71 3. Семяпочка 0,32 0,61 0,86
4. Апикальная 0,45 0,46 0,80 4. Апикальная 0,40 0,51 0,77
Вернемся к абсцизинам и ауксинам.
Таблица 7
Превышение À(abs) = abs - min(abs) относительного содержания свободных абсцизинов над минимумом
Область Стадия
1 2 3
Пшеница
0. Завязь 0,29 0,28 0,11
1. Базальная 0,23 0,28 0,27
2. Медиальная 0,31 0,27 0,05
3. Семяпочка 0,31 0,27 0,03
4. Апикальная 0,11 0,09 0
Одуванчик
0. Завязь 0,15 0,15 0,07
1. Базальная 0,19 0,19 0,16
2. Медиальная 0,18 0,17 0,08
3. Семяпочка 0,18 0,14 0,04
4. Апикальная 0,06 0,02 0
Факт, что при переходе от семяпочки и медиальной области к апикальной области происходит уменьшение А(аЪз) втрое, говорит, возможно, о том, что клетки-мишени абс-цизинового сигнала лежат не в апикальной области.
Таблица 8
Превышение À(aux) = aux — min(aux)
относительного содержания свободных ауксинов над минимумом
Область Стадия
1 2 3
Пшеница
0. Завязь 0 0,25 0,13
1. Базальная 0 0,08 0,05
2. Медиальная 0,01 0,27 0,19
3. Семяпочка 0,02 0,29 0,16
4. Апикальная 0,03 0,11 0,08
Одуванчик
0. Завязь 0,03 0,17 0,11
1. Базальная 0 0,10 0,08
2. Медиальная 0,06 0,23 0,16
3. Семяпочка 0,07 0,25 0,14
4. Апикальная 0,08 0,12 0,12
Данные табл. 8 позволяют предположить, что по крайней мере на стадиях 2, 3 клетки-мишени ауксинового сигнала лежат в медиальной области или в семяпочке.
Обращает на себя внимание достижение относительным содержанием свободных ауксинов минимума в одной области (1 = базальная) и на одной стадии (1 = начало периода активности яйцеклетки). Относительное содержание свободных абсцизинов тоже достигает минимума в одной области (4 = апикальная) и на одной стадии (3 = конец периода активности яйцеклетки). По-видимому, это — общая закономерность, поскольку и относительное содержание свободных цитокининов достигает минимума в одной области (3 = семяпочка) и на одной стадии (1 = начало периода активности яйцеклетки).
Таблица 9
Превышение A(cyt) = cyt — min(cyt) относительного содержания свободных цитокининов над минимумом
Область Стадия
1 2 3
Пшеница
0. Завязь 0,72 0,28 0,53
1. Базальная 0,33 0,38 0,41
2. Медиальная 0,61 0,40 0,51
3. Семяпочка 0 0,21 0,39
4. Апикальная 0,32 0,14 0,48
Одуванчик
0. Завязь 0,27 0,47 0,30
1. Базальная 0,40 0,47 0,46
2. Медиальная 0,18 0,13 0,35
3. Семяпочка 0 0,29 0,54
4. Апикальная 0,08 0,19 0,45
Предположив существование порогового уровня для перехода абсцизинов из связанного состояния в свободное, логично представить, что подобные уровни существуют для ауксинов и цитокини-нов. С этими уровнями на первый взгляд логично связать уровни гормональных шумов. Кажется весьма вероятным, что клетки-мишени гормонального сигнала в виде активного гормона должны уметь защищаться от шумов и работать на фоне помех. Результат репродуктивного процесса слишком важен, чтобы система гормональной регуляции этого процесса могла обойтись без подсистем протекции, фильтрации и коррекции. В связи с этим не может не обратить на себя внимание жесткое удержание среднего значения abs в базальной и медиальной областях завязи и в семяпочке пшени-
цы на уровне 0,83 ± 1 — на стадии 1 и на уровне 0,78 ± 1 — на стадии 2. У одуванчика в тех же областях среднее значение abs удерживается на уровне 0,89 ± 1 — на стадии 1 и на уровне 0,88 ± 3 — на стадии 2, т.е. на постоянном уровне или уровне, близком к постоянному. Складывается впечатление, что ни деление антипод, ни деление ядер эндосперма в изменении abs до начала деления оплодотворенной или неоплодотворенной яйцеклетки заметно не сказывается.
Напомним, что абсцизовая кислота (АБК) — единственный фитогормон, способный выступать антагонистом по отношению ко всем другим фи-тогормонам (Дерфлинг, 1985). Однако торможение или блокировка действия других гормонов, по-видимому, не является единственной функцией АБК, о чем косвенно свидетельствует, например, связь абсцизинов с гиббереллинами через их предполагаемого общего предшественника — мевало-новую кислоту. Отсюда — особая роль АБК, ее присутствие во всех тканях и органах во все периоды жизни растения, ее сложный характер взаимодействия с другими гормонами и широкий спектр морфофизиологической экспрессии. Особо отметим участие АБК в процессах протекции и адаптации, инициируемых при стрессах и изменениях экологических условий (Кефели и др., 1989).
Исследуя условия, способствующие индукции in vitro гаплоидного гиногенеза в культурах цветков, завязей и семяпочек пшеницы, мы обнаружили, что одним из таких условий является отсутствие в среде культивации свободных цитокининов. Добавка последних уменьшала и без того малую вероятность индукции (Гусаковская, Мохаммад Али Наджар, 1994). Мы обнаружили также, что безгормональная среда необходима для индукции гино-генеза. Но для его продолжения необходима добавка свободных цитокининов. Эти наблюдения согласуются со следующими данными.
Таблица 10
Изменение A(abs), A(aux), A(cyt) в семяпочке
Семяпочка Стадия
1 2 3
Пшеница
A(abs) 0,31 0,27 0,03
A(aux) 0,02 0,29 0,19
A(cyt) 0 0,21 0,58
Одуванчик
A(abs) 0,18 0,17 0,04
A(aux) 0,07 0,26 0,17
A(cyt) 0 0,29 0,54
Таблица 11
Изменение abs, aux, cyt в семяпочке
На стадии 1 семяпочка содержит минимум ускоряющих гормонов и максимум тормозящего гормона. Это можно рассматривать как гормональную характеристику стадии 1, равно пригодную для выделения этой стадии в периоде активности яйцеклетки как у пшеницы, так и у одуванчика. Данные табл. 10 показывают, что аналогичные характеристики могут быть предложены для выделения стадий 2 и 3. Существуют, следовательно, независящие от типа репродукции гормональные критерии, позволяющие разложить период активности яйцеклетки на три стадии, каждая из которых имеет в репродукции вполне определенный, содержательный смысл.
То что мы говорим о гормональных превышениях Л, несущественно. Возвращаясь к относительным количествам свободных гормонов, получаем аналогичную картину.
Стадии 1, 2, 3 можно характеризовать максимальными значениями abs, aux, cyt соответственно. Однако характеристика abs стадии 1, 2 в пределах ошибок не различает.
Во времени abs, aux и cyt в семяпочке одуванчика меняются по характеру сходно с тем, как они меняются в семяпочке пшеницы. Постоянный на стадиях 1, 2 abs на стадии 3 "сваливается" до минимума; aux меняется "треугольно", сначала возрастая, затем убывая; cyt монотонно возрастает.
На первый
Семяпочка Стадия
1 2 3
Пшеница
A(abs) 0,82 0,78 0,54
A(aux) 0,60 0,87 0,77
A(cyt) 0,13 0,34 0,71
Одуванчик
A(abs) 0,89 0,88 0,75
A(aux) 0,63 0,79 0,70
A(cyt) 0,32 0,61 0,86
Таблица 12
Изменение abs, aux, cyt в медиальной области завязи
Медиальная Стадия
область 1 2 3
Пшеница
abs 0,84 0,78 0,56
aux 0,59 0,85 0,74
cyt 0,74 0,53 0,83
Одуванчик
abs 0,88 0,90 0,79
aux 0,62 0,81 0,72
cyt 0,54 0,45 0,67
нося его к границе Таблица 13
между семяпочкой и Изменение abs, aux, cyt
медиальной областью, на границе семяпочки
получаем следующую и медиальной области
картину (табл. 13).
Величина cyt на границе семяпочки и медиальной области растет у пшеницы и одуванчика в одинаковых пределах. Однако рост этот несколько различен. У пшеницы он начинается в переходе "стадия 2 ^ стадия 3", а у одуванчика — в переходе "стадия 1 ^ ^ стадия 2". Можно сказать, что на границе семяпочки cyt у пшеницы начинает возрастать позже, чем у одуванчика. (Позже в смысле не абсолютного, а относительного времени, масштабированного продолжительностью периода активности яйцеклетки и отсчитываемого от начала этого периода.)
Таблица 14
Пространственно-временное распределение cyt в системе "медиальная область—семяпочка"
Медиальная область/семяпочка—граница Стадия
1 2 3
Пшеница
abs 0,83 0,78 0,55
aux 0,60 0,86 0,75
cyt 0,43 0,43 0,77
Одуванчик
abs 0,89 0,89 0,77
aux 0,61 0,80 0,71
cyt 0,43 0,53 0,77
Область Пшеница Одуванчик
стадия стадия
1 2 3 1 2 3
Медиальная 0,74 0,53 0,83 0,54 0,45 067
Граница 0,43 0,43 0,77 0,43 0,53 0,77
Семяпочка 0,13 0,34 0,71 0,32 0,61 0,86
взгляд характер изменения abs, aux и cyt в медиальной области должен быть близок к таковому в семяпочке. Это действительно так в отношении abs и aux. Однако характер изменения cyt в медиальной области иной, "треугольный": сначала cyt убывает, затем — возрастает.
Беря среднее арифметическое табл. 11 и 12 и от-
Как мы говорили, на сегодня существует множество фактов, позволяющих утверждать, что репродуктивный процесс у цветковых вне периода активности яйцеклетки находится под контролем гормональной системы растительного организма. Полученные нами данные не оставляют сомнений в том, что он не прерывается и в период активности яйцеклетки. В работе системы контроля, действующей на уровне завязи, у пшеницы и одуванчика есть общие закономерности. Похоже, что одним из условий нормального протекания репродуктивного процесса является монотонное возрастание в семяпочке относительного количества cyt свободных цитокининов.
При движении от периферии медиальной области внутрь семяпочки cyt у пшеницы убывает на всех стадиях. У одуванчика это убывание имеет место только на стадии 1. На стадиях 2 и 3 cyt, напротив, растет. Однако в семяпочке одуванчика cyt монотонно растет, как и в семяпочке пшени-
цы. Это означает, по-видимому, что система гормонального контроля, действующая в завязи пшеницы и одуванчика, достигает в данном случае одинакового результата несколько разными путями.
Характер изменения еу1 в базальной и медиальной областях сходен с характером изменения еу1 на границе медиальной области и семяпочки. В пределах ошибок можно сказать, что у пшеницы он начинается в переходе "стадия 2 ^ стадия 3", а у одуванчика — в переходе "стадия 1 ^ стадия 2".
Таблица 15
Изменение abs, aux, cyt в базальной области завязи
Базальная Стадия
область 1 2 3
Пшеница
abs 0,82 0,79 0,78
aux 0,58 0,66 0,63
cyt 0,47 0,51 0,73
Одуванчик
abs 0,90 0,85 0,87
aux 0,56 0,66 0,64
cyt 0,47 0,60 0,77
Таблица 16
Изменение abs, aux, cyt в апикальной области завязи
Апикальная Стадия
область 1 2 3
Пшеница
abs 0,62 0,60 0,51
aux 0,61 0,69 0,66
cyt 0,45 0,46 0,80
Одуванчик
abs 0,77 0,73 0,71
aux 0,64 0,68 0,68
cyt 0,40 0,51 0,77
Почему изменение cyt в медиальной области носит иной характер — неясно. Но, как бы там ни было, в этой области и в семяпочке изменение cyt у пшеницы и одуванчика становится сходным.
Меньше вопросов рождает характер изменения aux. Слабо выраженная в базальной и апикальной областях "треугольность" этого изменения становится более выраженной в медиальной области и семяпочке. Нечто подобное, по-видимому, происходит и с характером изменения abs.
В итоге можно сделать следующие выводы:
1) существует система гормональной регуляции репродуктивного процесса, действующая в завязи в период активности яйцеклетки;
2) эта регуляция обнаруживает как общие, так и разные закономерности для пшеницы и одуванчика;
3) не исключено, что специфика апо-миксиса связана со спецификой работы указанной системы у апомиктов, подобных одуванчику.
* * *
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 06—04—48140).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Батыгина Т.Б. 1987. Хлебное зерно: Атлас. Л.
Блинцов А.Н., Гусаковская М.А., Ермаков И. П. 2001. Новый микрометод дифференциального количественного определения зеатина и зеа-тинрибозида // Прикл. биохим. и микробиол. 36. № 4. 462—468.
Блинцов А.Н., Гусаковская М.А., Ермаков И . П . 2000. О дифференциальном определении основных природных форм цитокининов иммунофер-ментным методом // Прикл. биохим. и микробиол. 37. № 4. 494—499.
Блинцов А.Н., Гусаковская М.А., Бобков а А.Ф. 2001. Новый подход к решению проблемы дифференциального количественного определения зеатина и зеатинрибозида // Докл. РАН. 377. № 1. 111—115.
Блинцов А.Н., Гусаковская М.А. 2002. Иммуноферментный метод определения зеатина и зеа-тинрибозида // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 4. 3—8.
Блинцов А.Н., Гусаковская М.А. 2004. Иммунохимический подход к проблеме дифференциального определения природных форм абсцизовой кислоты // Биохимия. 69. Вып. 10. 1353—1364.
Блинцов А.Н., Гусаковская М.А., Власова Т.А., Полесская О.Г., Каширина Е.И., Алехина Н.Д. 2005. Новые возможности в изучении динамики абсцизовой кислоты // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 6—12.
Блинцов А.Н., Гусаковская М.А. 2006. Метод иммуноферментного анализа для раздельного определения свободной и связанной форм абсцизовой кислоты // Физиол. раст. 53. № 3. 455—461.
Гусаковская М.А., Мохаммад Али Над-жар. 1994. Гиногенез в культуре неоплодотворенных завязей и семяпочек пшеницы // Бот. журн. 79. № 1. 70—79.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н., Ермаков И. П. 1998. О гормональной регуляции эмбриогенеза in vivo у растений // Докл. РАН. 363. № 2. 260—262.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н., Ермаков И . П . 2000а. Гормональная регуляция начала эмбриогенеза у амфимиктов и апомиктов // Докл. РАН. 375. № 2. 252—255.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н., Ермаков И . П . 2000б. О гормональной регуляции развития завязи пшениц Triticum aestivum // Докл. РАН. 370. № 5. 689—692.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 2001а. Об изменении распределения цитокининов в семяпочке и завязи Taraxacum officinale Web. на начальных этапах раннего эмбриогенеза // Биохимия. 66. Вып. 3. 378—385.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 2001б. Об участии цитокининов в индукции эмбриогенеза у амфимиктов и апомиктов // Докл. РАН. 378. № 2. 254—256.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 2001в. Динамика цитокининов в разных областях завязей Tri-ticum aestivum L. и Taraxacum officinale Web. в период подготовки яйцеклетки к делению // Докл. РАН. 381. № 4. 550-553.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 2001г. Возможные факторы индукции ранних этапов эмбриогенеза у покрытосеменных // Физиол. раст. 48. № 4. 491-497.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 2002. О содержании зеатина и зеатинрибозида в завязях Tri-ticum aestivum L. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 10-17.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 2003а. О гормональной регуляции момента начала эндоспер-могенеза у амфимиктического вида Triticum aestivum L. и апомиктического вида Taraxacum officinale Web. // Докл. РАН. 390. № 6. 828-833.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 20036. Цитокинины как возможные факторы индукции ранних этапов эмбриогенеза у Triticum aestivum L. и Taraxacum officinale Web. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 3. 7-11.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 2004а. Пространственно-временное распределение зеатина и зе-атинрибозида в период активности яйцеклетки в завязях растений с половым и апомиктическим типами репродукции // Физиол. раст. 51. № 2. 249-255.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 20046. Изменение распределения содержания зеатина и зеатинрибозида в завязях Triticum aestivum L. и Taraxacum officinale Web. в период подготовки яйцеклетки к делению // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 3-11.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н., Бобков а А. Ф . 2004. Новая стратегия в решении пробле-
мы дифференциального определения природных форм абсцизовой кислоты // Докл.РАН. 398. № 2. 252—264.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 2005. Пространственно-временное распределение свободной и связанной форм АБК в завязях Triticum aestivum L. и Taraxacum officinale Web. в начале эмбриогенеза // Докл. РАН. 403. № 1. 1—4.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 2006а. Новый микрометод ИФА для количественного дифференциального определения природных форм индолил-3-уксусной кислоты // Докл. РАН. 408. № 2. 265—267.
Гусаковская М.А., Блинцов А.Н. 20066. Пространственное и временное распределение свободной и связанной форм АБК в завязях пшеницы и одуванчика в период активности яйцеклетки // Физиол. раст. 53. № 3. С. 397—401.
Дерфлинг К. 1985. Гормоны растений. Системный подход. М.
Кефели В.И., Коф Э.М., Власов П.В., Кислин Е.Н. 1989. Природный ингибитор роста — абсцизовая кислота. М.
Куперман Ф.М., Мурашёв В.В., Ананьева Л . В . 1978. Методические указания по определению потенциальной и реальной продуктивности пшеницы. М.
Либберт Э. 1976. Физиология растений. М.
Паушева З.П. 1974. Практикум по цитологии растений. М.
Пирс Э. 1956. Гистология теоретическая и прикладная. М.
Haberlandt G. 1921. Wundhormone als Brreger von Zellteilungen // Beitr Allgem. 2. 1—53.
Xian Sheng Zhang, O'Neill S.D. 1993. Ovary and gametophyte development are coordinately regulated dy auxin and ethylene following pollination // Plant Cell. 37. N 5. 403—418.
Поступила в редакцию 20.12.06
COMPARISON ANALYSIS OF THE SPATIAL-TEMPORAL DISTRIBUTION
OF ENDOGENOUS HORMONES IN THE OVARIES
OF WHEAT AND DANDYLION IN THE PERIOD OF EGGS ACTIVITY
M.A. Gussakovskaya, A.N. Blintsov, A.F. Lebedeva
Data to the spatial-temporal distribution of the free and bounded forms of phytohormones (cytokinins, auxines, abcizines) in the ovaries of amphimictic species Triticum aestivum L. and apo-mictic species Taraxacum officinale Web. are obtained. The data attributed to the four domains of ovary and the three intervals comprising the period of eggs activity (from the moment of eggs aut relative rest to the moment of eggs in the first division). For the data securing was taken the free original modifications of ELISA. The modifications was worked up by us to the each phyto-hormones respectively. The comparative analysis of data permit argue that the basic events of the reproductive process which takes plays in the ovary in the period of eggs activity are under the endogenous hormonal control system. The distribution of free and bounded forms of phyto-hormones in the ovaries of the two species show just as common regularyties which probably are characteristic of amphimicts and apomicts both so the its spesial features. It is not improbable that the latters are bound by the specificity toward the type of reproduction.
