CC BY
34
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 4 - P. 164-169
УДК: 618.14-091.8:616-092.9:618.2/.4 DOI: 10.24411/1609-2163-2018-16174
СРАВНИТЕЛЬНЫЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СТАНОВЛЕНИЯ МИОМЕТРИЯ РОГОВ И ШЕЙКИ МАТКИ КРЫС В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ
Ю.В. ГРИГОРЬЕВА*, Г.Н. СУВОРОВА*, С.Н. ЮХИМЕЦ**, О.Н. ТУЛАЕВА*, С.Н. ЧЕМИДРОНОВ*,
Ю.В. МЯКИШЕВА*
*Самарский государственный медицинский университет, ул. Чапаевская, д. 227, Самара, 443001, Россия **Университет Св. Иосифа в Танзании, ПЯ11007, г. Дар Эс Салаам, Танзания
Аннотация. Цель исследования - уточнить морфологические аспекты постнатального гистогенеза миометрия рогов и шейки матки у белых беспородных крыс.
Материалы и методы исследования. В работе использованы методы электронной микроскопии, иммуногистохимии с применением набора моноклональных антител к гладкомышечному актину и гену пролиферации ki-67. Исследования проведены на 55 белых беспородных крысах: новорожденных, 7-и, 10-и, 14-и, 30-и, 45- дневных, 3-х, 4,5, 6- месячных и в возрасте 1 года и 2 лет.
Результаты и их обсуждение. Процесс пролиферации гладких миоцитов определяется в течение 1-1,5 месяцев после рождения животных и способствует формированию миометрия стенки матки. По окончанию подсосного периода в миометрии матки крыс заметен активный рост его слоев. Он сохраняется в миометрии рогов до 4,5 месяца, а в шейке до 6 месяцев и приводит к формированию цервикального сфинктера. Также в течение всего периода постнатального онтогенеза на основе детерминации осуществляется специфическая дифференцировка гладких миоцитов и их интеграция в функциональный синцитий. Процессы возрастной инволюции проявляются увеличением частоты апоптоза миоцитов и далее уменьшением толщины стенки.
Выводы. В постнатальном онтогенезе крыс миометрий является динамичной оболочкой стенки матки, где выраженность закономерно протекающих процессов гистогенеза на разных этапах пост-натального онтогенеза гетерохронна.
Ключевые слова: матка, гистогенез, миометрий, лейомиоциты, беспородные крысы
Введение. Известно, что окончательное формирование некоторых органов и систем органов в организме животных, в том числе и человека, завершается в разные сроки постнатального онтогенеза. К системе, где развитие максимально пролонгировано, в первую очередь, относится половая система [1,3,6]. Анализ литературы показывает, что постэмбриональному развитию матки посвящены немногочисленные исследования, но особенно малоизученными остаются процессы образования и формирования миометрия матки в разные возрастные периоды постнатального онтогенеза [2,4,9]. Изучение морфологических аспектов его становления позволяет понять механизмы развития ряда патологических состояний, возникающих при реализации маткой основной -детородной функции [5,10].
Цель исследования - уточнить морфологические аспекты постнатального гистогенеза миометрия рогов и шейки матки у белых беспородных крыс.
Материалы и методы исследования. Исследование проведено на 55 белых беспород-
ных крысах, разделенных на группы: новорожденных крысят, крысят в возрасте недели, 10 суток, 14 суток, 1 месяца после рождения, далее в возрасте 1,5 месяцев, 3 месяцев, 4,5 месяцев, 6 месяцев и в возрасте 1 года и 2 лет. В каждой группе было по 5 наблюдений. Животные содержались в виварии института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ, уход за ними осуществляли по нормам и правилам обращения с лабораторными животными, в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), с правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 №267) и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 104679-ГД от 01.12.1999г. На проведение исследования получено разрешение комитета по биоэтике при СамГМУ (протокол №176 от 03.08.2016 г.).
В работе использованы методы световой микроскопии с окрашиванием срезов гематоксилином и эозином, иммуногистохимии с при-
менением набора моноклональных антител к гладкомышечному актину и гену пролиферации ki-67. Материал фиксировали в забуферен-ном формалине, проводку осуществляли в гистологическом процессоре замкнутого типа с вакуумом Leica ASP300, заливали в парафин «Histomix» фирмы Bio Optica. Срезы толщиной 4 мкм готовили на роторном микротоме. Им-муногистохимическое типирование осуществляли с использованием антител фирмы DACO. Постановку иммуногистохимической реакции проводили с применением одношаговой системы визуализации BioGenex (OD 630-XAK) Super Sensitive one-step Polymer - HRP Kit/DAB. Для электронной трансмиссионной микроскопии материал фиксировали в глутаровом альдегиде и заливали в эпон-аралдитовую смесь, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Для установления прицельного участка исследования сначала готовили полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм и далее ультратонкие срезы толщиной 200-500 нм. Срезы просматривали на электронном микроскопе JEOL JEM-1400 PLUS.
Для морфометрического исследования использовали компьютерную программу обработки и анализа изображений ImageJ v1.50i. Статистическую обработку данных проводили в программе IBM SPSS Statistics v24. Статистический анализ включал проверку на соответствие данных нормальному распределению, расчет описательных статистик и определение достоверности различий с использованием непараметрических критериев.
Результаты и их обсуждение. К моменту рождения животного эндометрий его матки выстлан дифференцирующимся эпителием, который в рогах, теле и проксимальной части цервикального канала представлен однослойным призматическим, а в его дистальной части - многослойным неороговевающим. Как известно, уровень дифференцировки эпителия напрямую влияет на развитие подлежащих структур [8]. Под базальной мембраной эпителиального пласта эндометрия определяются рыхло расположенные клетки, характеризующиеся полиморфизмом. Ультраструктурный уровень исследования позволяет установить, что клетки, расположенные в тесной близости к эпителию относятся к фибробластическому дифферону, секретирующему компоненты межклеточного вещества соединительной ткани собственной пластинки слизистой оболоч-
ки. В более глубоких слоях стенки матки клетки дифференцируются в премиобласты, формирующие в последующем мышечную оболочку.
В течение второй недели постнатального развития крыс в этих удаленных от эпителиального пласта клетках заметно накопление компонентов сократительного аппарата, что позволяет говорить о наличии миобластов в формирующейся средней оболочке всех отделов матки.
К месячному возрасту крысы, и по окончанию подсосного периода процессы гистогенеза и дифференцировки тканевых элементов в мио-метрии матки также не завершаются. При световой микроскопии, без использования специфических методов окраски, миометрий выглядит как слой компактно расположенных клеток с ба-зофильно окрашенной цитоплазмой (рис. 1).
При анализе средних значений толщины миометрия, видно, что значительный его рост со стороны шейки матки начинается от момента рождения и продолжается до 6 месяца постнатального онтогенеза (рис. 3). Мы считаем, что данный темп роста миометрия, пропорционален росту самого биологического объекта. Однако развития мышечной оболочки в шейке матки значительно заметнее, чем в рогах, что, вероятно, обусловлено формированием сфинктерного аппарата.
Иммуногистохимическое исследование гена пролиферации Ы-67 в гладкомышечных клетках шейки матки свидетельствует о его положительной экспрессии. Несмотря на то, что мито-тический индекс у клеток миометрия матки, в том числе и будущего цервикального сфинктера после рождения животного постепенно снижается (1 неделя - 2,68±0,65%; 2 неделя -1,58±0,48%; 1 месяц - 0,7±0,14%; 1,5 месяца -0,08±0,04%), в этот период происходит увеличение толщины мышечной оболочки стенки матки. В последующем, при увеличении возраста крысы, проявлений положительной экспрессии гена пролиферации не наблюдается.
При применении антител к а-актину (а-БЫЛ) в миометрии к концу 1 месяца жизни животного четко определяется слоистость. Полученные данные не противоречат литературным данным [6]. Стоит отметить, что положительная экспрессия вещества до подсосного периода выявляется в цитоплазме клеток неравномерно, а в виде мелкой зернистости.
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 4 - P. 164-169
Рис. 1. Дистальный отдел матки крысы через месяц после рождения. Клетки миометрия сохраняют выраженную базофилию. Обозначения: 1 - влагалище; 2 - шейка матки и ее тело; 3 - рога матки; 4 - просвет мочевого пузыря. Окраска: гематоксилином и эозином. Увел. Об. 10Х
Рис. 2. Участок шейки матка крысы через месяц после рождения. 1 - миометрий тела матки крыс. 2 - мышечная оболочка мочевого пузыря. Метод ИГХ на а-гладкомышечный актин. Увел. 200Х
Рис. 3. Динамика изменений толщины миометрия матки белых беспородных крыс в постнатально онтогенезе в зависимости от отдела
Таблица 1
Сравнительная характеристика средних значений толщины слоев миометрия в зависимости от возраста крысы
Локализация С зок
14 суток 1 месяц 1,5 месяца 3 месяца 4,5 месяца 6 месяцев 1 год 2 года
(Л) (В) (С) (D) (Е) (Р) (С) (И)
Среднее (мкм) Среднее (мкм) Среднее (мкм) Среднее (мкм) Среднее (мкм) Среднее (мкм) Среднее (мкм) Среднее (мкм)
Шейка Внутренний слой 52.34 186.08 Л 200.74 Л 288.88 ABC 419.36 ЛВСВ 534.74 ЛВСВЕИ 510.76 ЛВСВЕИ 400.05 ЛВСВ
Средний слой 20.53 21.32 21.65 75.60 ABC 112.24 ЛВСВ 277.75 ЛВСВЕИ 237.89 ЛВСВЕИ 138.55 ЛВСВ
Наружный слой 25.52 25.48 73.03 ЛВВЕИ 45.04 AB 44.91 ЛВ 78.19 ЛВВЕИ 73.97 ЛВВЕИ 57.35 ЛВВЕ
Рога Внутренний слой 42.19 50.58 Л 81.07 ЛВ 83.65 AB 86.15 ЛВ 87.94 ЛВ 85.20 ЛВ 79.64 ЛВ
Средний слой 14.95 21.64 Л 26.11 Л 28.05 AB 62.87 ЛВСВИ 82.84 ЛВСВЕСИ 59.50 ЛВСВИ 37.65 ЛВСВ
Наружный слой 32.32 46.38 Л 48.44 Л 51.22 A 54.65 ЛВ 68.03 ЛВСВЕИ 61.20 ЛВСВИ 47.77 Л
Примечание: Результаты основаны на двусторонних критериях в предположении равенства дисперсий. Для каждой значимой пары ключ меньшей категории появляется в категории с большим средним. Уровень значимости для букв верхнего регистра (Л, B, С): .051
Анализ толщины слоев миометрия матки также позволил выявить ряд особенностей его развития (табл. 1). Так, в шейке матки крысы рост общей толщины миометрия происходит преимущественно за счет внутреннего слоя, где формируется цервикальный круговой сфинктер. С 3 месяца онтогенеза, параллельно росту внутреннего слоя миометрия, отмечается увеличение толщины его сосудистого слоя. При этом утолщение миометрия с увеличением возраста животного выявляется во всех возрастных группах, кроме периода от 6 месяцев до 1 года, изменения показателей которых не являются статистически значимыми.
В рогах матки крысы внутренний слой миометрия начинает активный рост с момента окончания подсосного периода до 1,5 месяцев, а далее остается практически неизмененным (табл. 1). Рост сосудистого слоя мио-метрия рогов отличается нестабильной динамикой. Именно этот слой принимает самое активное участие в динамике изменений толщины миометрия рогов в период с 3-х-4,5 месяцев и до 2-х лет, пик роста которого приходится на 6 месяцев постнатального онтогенеза крысы. Стати-
стически значимыми также в основном являются изменения показателей с 4,5 месяцев и до 2-х лет.
Наружный слой миометрия, как шейки матки, так и ее рогов остается практическим неизменным на протяжении всего постнатального онтогенеза.
Известно, что половая зрелость у крыс наступает к 4-4,5 месяцам постнатального онтогенеза. Однако, как видно из гистограммы 1, с 4,5 месяцев до полугода, несмотря на снижение темпов роста самого биологического объекта, продолжает активно формироваться миомет-рий шейки матки. Все это говорит об активном ходе формообразовательных процессов. По данным ряда зарубежных исследователей, формирование шейки матки у человека также пролонгировано в развитии по сравнению с другими отделами матки [1,7].
Ультраструктурное изучение миоцитов миометрия крыс показывает, что от момента их рождения и с увеличением возраста, в цитоплазме клеток происходит накопление компонентов сократительного аппарата, а также перемещение последних с периферии цитоплазмы клетки ближе к ядру, что становится заметно к окончанию подсосного периода. Все это приводит к дифференцировке миоцитов в светлые или темные, и свидетельствует о становлении их контрактильной функции. Данные изменения свидетельствуют о том, что с 1-1,5 месяцев крысы увеличение толщины миометрия происходит за счет внутриклеточной гипертрофии, а не за счет пролиферации.
Гладкие миоциты образуют единую систему - ткань, в которой к этому времени сформиро-
ваны межклеточные контакты. Миоциты взаимодействуют друг с другом при помощи десмо-сом, нексусов и простых неспециализированных контактов. В целом, к 4,5-6 месяцам онтогенеза крысы, тканевый состав шейки матки принимает дефинитивное строение.
За период от 1 года до 2 лет постнатального онтогенеза крыс в клетках миометрия часто встречаемости клеток с морфологическими признаками апоптоза увеличивается, что может говорить о начале процессов инволюции, что, вероятно, и приводит к уменьшению толщины миометрия.
Выводы. В постнатальном онтогенезе крыс миометрий матки является динамичной оболочкой матки, в которой выраженность закономерно протекающих процессов гистогенеза на разных этапах постнатального развития неодинакова. Процесс пролиферации клеток наиболее активно происходит в течение 11,5 месяцев после рождения животных и способствует формированию оболочек стенки шейки матки. По окончанию подсосного периода в миометрии матки крыс заметен активный рост его слоев, который сохраняется до 4,5 месяцев постнатального онтогенеза. Процессы роста наиболее выражены в миометрии шейки до 6 месяцев, что приводит к образованию цер-викального сфинктера. Одновременно, в течение всего периода постнатального онтогенеза на основе детерминации осуществляется специфическая дифференцировка гладких миоци-тов и интеграция их в функциональный синцитий. Инволютивные процессы проявляются увеличением частоты апоптоза и далее уменьшением толщины миометрия.
COMPARATIVE MORPHOLOGICAL ASPECTS OF RATS' UTERUS NECK AND HORNS MYOMETRIUM
FORMATION IN POSTNATAL ONTOGENESIS
YU.V. GRIGORYEVA *, G.N. SUVOROVA *, S.N. IUKHIMETC**, O.N. TULAEVA*, S.N. CHEMIDRONOV*,
YU.V. MYAKISHEVA*
*Samara state medical university, Chapayevskaya St., 227, Samara, 443001, Russia **St. Joseph University in Tanzania, PO Box 11007, Dar Es Salaam, Tanzania
Abstract. The research purpose was to clarify the morphological aspects of the postnatal histogenesis of the myometrium of the antlers and cervix of the uterus in albino rats.
Methods: We have used the electron microscopy and immune-histochemistry with the application of a set of monoclonal antibodies to smooth muscle actin and ki-67 proliferation gene. The research was conducted on 55 white outbred rats at ages: newborn, seven days, ten days, 14 days, 30 days, 45 days, the 3rd, 4th, 5th, sixth - month and one and two years old.
Results: Process of smooth myocytes proliferation is defined within 1-1.5 months after the birth of animals and promotes the formation of uterus wall myometrium. Active growth of rats' uterus myometrium
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 4 - P. 164-169
layers is noticeable by the termination of the suckling period. It remains in myometrium of horns to 4.5 months, and in the neck till six months and leads to the formation of a cervical sphincter. Also during the whole period of postnatal ontogenesis by determining specific differentiation of smooth myocytes and their integration into a functional syncytium is carried out. Processes of an age involution are shown by increasing the frequency of a myocytes apoptosis and further decrease of the thickness of a wall.
Conclusions: In postnatal ontogenesis, the rats' myometrium is the active layer of uterus wall, where expression of naturally proceeding processes of histogenesis at different stages of postnatal ontogenesis is heterochronic.
Key words: uterus, histogenesis, myometrium, leiomyocytes, outbred rats.
Литература
1. Коновалов П.К., Овсянников Ф.А., Иванов Д.О., Митрофанова Л.Б. Морфологическое исследование миометрия в различные периоды развития и ремоделирования матки // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2014. Т. 13, № 2. С. 37-43.
References
1. Konovalov PK, Ovsyannikov FA, Ivanov DO, Mi-trofanova LB. Morfologicheskoe issledovanie miome-triya v razlichnye periody razvitiya i remodelirovaniya matki [Morphological study of oxytocics in various periods of development and remodeling of the uterus]. Voprosy ginekologii, akusherstva i perinatologii. 2014;13(2):37-43. Russian.
2. Малакшинова Л.М., Попов А.П. Гистометрия матки крольчих // Международный научно-исследовательский журнал. 2015. № 8-3. С. 28-30.
3. Санькова И.В., Овсеенко Т.Е., Смирнова А.В. Возрастные особенности строения стенки матки // Морфология. 2006. Т. 129, № 4. С. 109.
2. Malakshinova LM, Popov AP. Gistometriya matki krol'chih [Gistometrija uterus krolchih]. Mejdunarodnyi nauchno-issledovatel'skii jurnal. 2015;8-3:28-30. Russian.
3. San'kova IV, Ovseenko TE, Smirnova AV. Vo-zrastnye osobennosti stroeniya stenki matki [Age structure of the wall of the uterus]. Morfologiya. 2006;129(4):109. Russian.
4. Туаева З.С., Тотоева О.Н., Тотоева З.Н. Гисто-топография мышечного слоя матки на протяжении постнатального онтогенеза // Журнал анатомии и гистопатологии. 2012. Т. 1, № 4. С. 49-54.
4. Tuaeva ZS, Totoeva ON, Totoeva ZN. Gistotopo-grafiya myshechnogo sloya matki na protyajenii postnatal'nogo ontogeneza [Gistotopografija muscular layer of the uterus during the postnatal ontogenesis]. Jurnal anatomii i gistopatologii. 2012;1(4):49-54. Russian.
5. Хасанов А.А., Бакирова И.А. Новые подходы к изучению нарушений сократительной деятельности матки в современном акушерстве // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2010. Т. 9, № 1. С. 51-56.
5. KHasanov AA, Bakirova IA. Novye podhody k izucheniyu narushenii sokratitel'noi deyatel'nosti matki v sovremennom akusherstve [New approaches to the study of the contractile uterine activity violations in modern obstetrics]. Voprosy ginekologii, akusherstva i perinatologii. 2010;9(1):51-6. Russian.
6. Brody J.R., Cunha G.R. Histologic, morphometric, and immunocytochemical analysis of myometrial development in rats and mice: I. Normal development // Am J Anat. 1989. Vol. 186, №1. Р. 1-20.
7. Cramer S.F., Oshri A., Heller D.S. A Study of Myometrial Growth and Development // J Pediatr Adolesc Gynecol. 2015. Vol. 28, №5. Р. 387-394. DOI: 10.1016/j.jpag.2014.12.002.
6. Brody JR, Cunha GR. Histologic, morphometric, and immunocytochemical analysis of myometrial development in rats and mice: I. Normal development. Am J Anat. 1989;186(1):1-20.
7. Cramer SF, Oshri A, Heller DS. A Study of Myo-metrial Growth and Development. J Pediatr Adolesc Gynecol. 2015;28(5):387-94.
DOI: 10.1016/j.jpag.2014.12.002.
8. Cunha G.R., Young P., Brody J.R. Role of uterine epithelium in the development of myometrial smooth muscle cells // Biol Reprod. 1989. Vol. 40, №4. Р. 861-871.
8. Cunha GR, Young P, Brody JR. Role of uterine epithelium in the development of myometrial smooth muscle cells. Biol Reprod. 1989;40(4):861-71.
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 4 - P. 164-169
9. Stepanov P.F., Sapozhnikov A.G.[Development of the uterine microcirculatory bed in postnatal ontogeny // Arkh Anat Gistol Embriol. 1987. Vol. 93, №7. Р. 22-33.
9. Stepanov PF, Sapozhnikov AG. Development of the uterine microcirculatory bed in postnatal ontogeny. Arkh Anat Gistol Embriol. 1987;93(7):22-33.
10. Sosa-Stanley J.N., Bhimji S.S. Anatomy, Pelvis, Uterus. 2017 Nov 15. StatPearls[Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2018 Jan-. Available from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books /NBK470297/
10. Sosa-Stanley JN, Bhimji SS. Anatomy, Pelvis, Uterus. 2017 Nov 15. StatPearls[Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2018 Jan-. Available from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ books/NBK470297/
Библиографическая ссылка:
Григорьева Ю.В., Суворова Г.Н., Юхимец С.Н., Тулаева О.Н., Чемидронов С.Н., Мякишева Ю.В. Сравнительные морфологические аспекты становления миометрия рогов и шейки матки крыс в постнатальном онтогенезе // Вестник новых медицинских технологий. 2018. №4. С. 164-169. Б01: 10.24411/1609-2163-2018-16174
