CC BY
8
Vickrey Т. M., Buren М. S., Howell H. E. — Analyt. Lett., Wolf W. R. — Ibid., 1976, v. 48, p. 1717-1720.
1978, v. A-II, p. 1075—1095. Wong P. T. S., Chau Y. K., Luxon P. S. — Nature, 1975,
Walter R. A., De Jonghe, Chakraborti D. et al. — Analyt. v. 253, p. 263—264.
Chern., 1980, V. 52, p. 1974—1977. Поступила 30.05.83
За рубежом
УДК 614.7в:в61.715.61-074:543.544
А. Я• Хесина, Г. А. Смирнов, И. А. Хитрово, Л. В. Кривошеева, М. Кертес, А. Хорват, Т. Вагнер, М. Сабадош
СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ В ЗАГРЯЗНЕНИЯХ ВОЗДУХА И ПОЧВЫ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ МЕТОДАМИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ СПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИИ В ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
ВОНЦ АМН СССР, Москва; Государственный институт гигиены ВНР, Будапешт
Настоящее исследование является непосредственным продолжением и развитием совместных работ ВОНЦ АМН СССР и Государственного института гигиены (ГИГ) ВНР (А. Я. Хесина и соавт.) по созданию методов определения и изучению поли-цнклических ароматических углеводородов (ПАУ), в частности канцерогенных и мутагенных (Л. М. Ша-бад), в загрязнениях окружающей среды. Исследования проводятся с целью профилактики рака.
Методы, применяемые для определения ряда ПАУ (анализ по квазилинейчатым спектрам лю-
минесценции и спектрам УФ-поглощения, П. П. Ди-кун; Т. А. Теплицкая; А. Я. Хесина и соавт.) обладают недостаточно высокой чувствительностью, крайне трудоемки и (в варианте, используемом в ВНР) недостаточно селективны. Нами отмечалась необходимость дальнейшего усовершенствования методов определения ПАУ в экстрактах сложного состава, в частности при анализе загрязнений окружающей среды (А. Я. Хесина и соавт., 1979). Решению этого вопроса и посвящена данная работа.
Таблица 1
Параметры ПАУ для количественного определения по спектрам люминесценции в условиях селективного возбуждения
при 77 °К
№ ПАУ »•„• нм Аналитическая Флуоресценция, фосфоресценция (длина воли, ям) Аналитическая
1 Фенантрен 255, 294 255 347, 357, 364, 383 347, 364
2 Пирен 275, 310, 326, 338 338 372, 377, 382, 288, 392
3 Флуорантен 288 , 325, 344 , 362, 542*, 559, 587 362 406, 414, 436 436, 542*
4 Бенз (а) антрацен 281, 292, 302, 334, 344 292 384,5, 405, 410 384,5
5 Хризен 262, 272, 296, 310 272 361, 373, 390, 410, 499*, 507, 537, 371. 499»
544, 557
6 БП 272 , 286 , 298, 350 , 368 , 380 298 403, 408,5, 427 403
7 Бенз (е) пирен 320, 334 334 376,5, 388, 396, 409, 537*. 548, 388. 537*
575, 589, 604
8 Перилен 371, 384, 415, 420 420 444, 451, 473, 477 444, 451
9 Бенз (в) флуорантен 260, 296, 304, 353 304 392, 402, 421, 425, 428, 526«, 538, 567 392,402,526*
10 Бенз (к) флуорантен 254, 278, 310, 368, 381 310 402, 412, 428, 430 403
11 Бенз (g, h, i) перилен 292, 303, 349, 365 303 406,4, 415,6, 419.5, 422,6, 431,1, 445,6 406,4, 419,5
12 Дибенз (a, h) антра- 394,2, 414,8, 415,6, 422, 548*. 602 394,2, 548*
цен 293, 301, 323, 336, 352 301
13 Днбенз (а, с) антрацен 280, 291 291 375,2, 386,2, 397, 410, 420 375,2
14 Бенз (г, s, t) пентафен 286, 298, 316, 333, 356, 374 398 431,7, 446,6, 458,5, 489,5 431,7
15 Инденопирен 307, 318, 362, 378 362 463, 471, 480 463
16 Коронен 295, 307, 326, 338, 342. 348 307 430,8-432,6. 443,8-444,6, 562* 443,8, 562*
Примечание. Звездочка—длина волны в спектре фосфоресценции.
Рис. 1. Спектрограммы флуоресценции (Лфл), возбуждения (Хв) и фосфоресценции (Яфос) 15
ПАУ в н-октане при 77 °К.
Q
Рис. 2. Спектрограммы флуоресценции в н-ок-тане при 77 "К фракций после тонкослойной хроматографии экстракта из почвы и эталонных растворов определяемых ПАУ в концентрации
10-'г/мл. а: 1 — пирен (Я.^338 нм), II — фракция № 1 экстракта (Я.в338 нм): б: / - БП <ХВ298 нм), // — фракция А'г 2 экстракта (А.в 298 нм).
Задачами исследования являлись модификация методов спектрального определения ряда ПАУ по квазилинейчатым спектрам люминесценции для повышения их селективности и чувствительности (с этой целью спектрометрический метод заменен спектрофлуориметрическим с использованием селективного возбуждения); разработка варианта методики определения ПАУ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии под давлением. Эта методика применяется в ВНР вместо спектрометрической, обладающей недостаточной чувствительностью и селективностью; проведение параллельных исследований проб с целью интеркалиб-рации обоих методов.
Определение многих ПАУ не может быть проведено на спектрометре при возбуждении люминесценции светом ртутно-кварцевой лампы вследствие несовпадения длины волны групп интенсивных линий в спектре ртути с максимумами в спектре УФ-поглощения этих соединений.
В последние годы все более широкое распространение получают спектрофлуориметры — приборы с двумя монохроматорами. Такие приборы позволяют регистрировать спектры люминесценции при возбуждении светом с фиксированной длиной волны и спектры возбуждения люминесценции при фиксировании длины волны в спектре люминесценции. Положение максимумов в спектре возбуждения совпадает по длине волны с максимумом в спектре УФ-поглощения данного соединения. Спектрофлуориметры типа Перкин — Эльмер — Хитачи (например, MPF-44B) дают возможность получить как спектры люминесценции, в том числе флуоресценции и фосфоресценции, при температуре жидкого азота (77 °К), так и спектры возбуждения люминесценции при низкой температуре. Использование спектров возбуждения позволило ряду исследователей (Ф. Я. Ровинский и соавт.; Fritz) повысить селективность определения ПАУ и надежность их идентификации.
В ВОНЦ АМН СССР были изучены при температуре жидкого азота квазилинейчатые спектры воз-
Таблица 2
Результаты параллельных исследований загрязнения воздуха и почвы, проведенных в ВОНЦ АМН СССР (А) и ГИГ ВНР (Б)
Метод отбора проб воздуха (ВНР) Концентрация БП в воздухе, мкг/100 ы1 Концентрация БП в почве, мкг/кг
А в А Г в
В центре жилого массива города 0,37 0,36
В зоне предприятий алюминиевой промышленности 0,64 4,9 18,1 0,61 4,7 19,0
В зоне отдыха Контрольный образец почвы с добавлением БП: 10 мкг/кг 50 мкг/кг Менее 0,02 0,015 10.4 53.5 13,5 45,7
буждения, люминесценции, а также флуоресценции и фосфоресценции 16 ПАУ, наиболее часто исследуемых при оценке загрязнения среды и изучении источников загрязнения. Установлены оптимальные условия возбуждения люминесценции — длина волны (X) возбуждающего света при записи спектров люминесценции и длина волны наиболее интенсивных линий в спектрах флуоресценции и фосфоресценции, применяемых в качестве аналитических (табл. 1). Изучение спектров возбуждения показало, что для исследованных ПАУ можно повысить чувствительность в несколько десятков раз, используя для возбуждения оптимальные условия (см. табл. 1) взамен возбуждения фильтрованным светом ртутно-кварцевой лампы, позволяющим возбуждать лишь группами ртутных линий с длиной волны 313 и 365 нм. Спектрограммы возбуждения, флуоресценции, а для некоторых ПАУ фосфоресценции при 77 °К представлены на рис. 1, где А. указана в нанометрах.
Методика фракционирования экстракта в тонком слое окиси алюминия смесью бензол — циклогек-сан (1:2), а также распределение ПАУ по фракциям описанк ранее (А. Я. Хесина и соавт., 1979).
При идентификации ПАУ наряду со спектрами возбуждения к люминесценции (см. табл. 1) может быть использован атлас квазилинейчатых спектров люминесценции (Т. А. Теплицкая и соавт.).
Каждую из полученных фракций анализируют качественно на присутствие в ней ПАУ из числа 16 определяемых (см. табл. 1). При поиске ПАУ устанавливают длину волны возбуждающего света, оптимальную для данного соединения, и записывают спектр флуоресценции (или фосфоресценции) в области аналитических линий искомого ПАУ (см. табл. 1).
При количественном анализе обнаруженных ПАУ записывают при оптимальных условиях спектр серии из трех растворов и графически определяют искомую концентрацию.
Чувствительность при анализе ПАУ — от IX X Ю-10 г на 1 мл фракции для бенз(а) пирена (БП),
W
пирена, перилена до МО-8 г/мл для ПАУ, определяемых по спектрам фосфоресценции (см. табл. 1). Погрешность не выше ±10%.
Следует отметить, что селективное возбуждение меняет картину спектра фракции и позволяет отчетливо выявить индивидуальные ПАУ. На рис. 2 в качестве примера приведены спектрограммы фракций, полученные при хроматографии экстракта из почвы, отобранной в центре Будапешта (совместное исследование ВОНЦ и ГИГ). Отчетливо проявляется во фракции № 1 структура спектра пирена (б) по сравнению со спектром эталонного раствора пирена (а) и во фракции № 2 — структура спектра БП (б) по сравнению со спектром его эталонного раствора (а).
Ряд ПАУ, имеющих интенсивную фосфоресценцию в видимой области спектра в условиях замороженных н-парафиновых растворов, целесообразно определять по спектрам фосфоресценции нли в целях самоконтроля (параллельно) по спектрам флуоресценции и фосфоресценции.
Параметры спектров возбуждения и люминесценции и условия оптимального возбуждения и люминесцентного анализа могут быть с успехом использованы также при анализе ПАУ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии под высоким давлением с применением флуориметра в качестве детектора.
В ГИГ ВНР разработана методика идентификации ПАУ и их количественного определения в экстрактах из загрязнений окружающей среды методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Экстракты предварительно подвергают двукратной хроматографии в тонком слое по следующей \ методике. Фракционирование проводят на пластинках размером 20x20 см2 в толстом (1 мм) слое силикагеля для выделения суммарной фракции ПАУ смесью бензол — ацетон (95:5). Фракцию ПАУ смывают бензолом с 5% ацетона и переводят в циклогексан, затем подвергают тонкослойной хроматографии на пластинках размером 20х Х20 см на смешанном слое (0,3—0,5 мм) силикагеля и ацетилцеллюлозы с 40% ацетата (2:1). Хроматография в этом слое осуществляется в системе этанол — толуол — дистиллированная вода (17:4:4). После завершения хроматографии в свете ртутно-кварцевой лампы с черным фильтром (область пропускания 280—380 нм) выделяют 6 люминесцирующих зон, каждая из которых содержит несколько ПАУ.
Фракции смывают с адсорбента 100 мл бензола с 5% ацетона, переводят в метанол и подвергают анализу на жидкостном хроматографе. Определение проводят на хроматографе типа «Вариан», колонки «микропак» Merk RP-18-10 мкм внутренним диаметром 4 мм длиной 25 см, наполненные реверс-фазой с диаметром частиц 10 мк. В колонку вводят 10 мкл исследуемой фракции. Элюэнт — метанол, скорость течения 120 мл/ч. Продолжительность анализа до 10 мин, время удерживания различных ПАУ постоянно, давление 50—60 атм.
Детектирование осуществляется двумя детекторами, включенными последовательно, — УФ-по-глощения с постоянной длиной волны (254 нм) и флуоресцентного детектора. ПАУ идентифицируют по времени выхода на хроматограмме и отношению интенсивности сигналов на флуоресцентном и УФ-детекторах. Применение флуоресцентного детектора в ряде случаев повышает чувствительность и увеличивает надежность идентификации ПАУ. Чувствительность флуоресцентного детектора для исследованных ПАУ колеблется в пределах 0,05 X X Ю-9—10- Ю-8 г, что соответствует для пробы 10 мкл 0,5-Ю-8 —Ы0_0 г на 1 мл фракции; для УФ-детектора — 0,2-10"»—2- Ю"9 г (2-10~8 —2 х X Ю-7 г на 1 мл фракции). Погрешность не превышает ±10%.
Сравнение результатов, полученных обоими методами, проведено путем определения БП в воздухе вблизи предприятий алюминиевой промышленности, смешанных источников (жилого массива города, контрольные пробы — в зоне отдыха) в ВНР. Фильтры разрезали на две равные части, экстракцию, предварительную хроматографию и анализ проводили параллельно в ВОНЦ АМН СССР и ГИГ ВНР. Результаты представлены в табл. 2.
Отклонение от средних величин результатов, полученных разными методами (табл. 2), не превышает ±10%. При анализе ряда ПАУ наряду с БП в обоих случаях профиль ПАУ совпадает.
Сравнительные исследования почвы были проведены путем анализа параллельных образцов (по 20 г) практически не загрязненной БП (отбор на станции фонового мониторинга) почвы, в которые был дополнительно введен БП из расчета 10 и 50 мкг на 1 кг почвы. Отклонение от средних данных незначительно превышает ±10%, что связано с колебаниями концентраций БП в исходных параллельных образцах почвы.
Таким образом, предлагаемая методика определения ПАУ по низкотемпературным спектрам люминесценции при селективном возбуждении позволяет повысить чувствительность и надежность идентификации индивидуальных ПАУ в экстрактах сложного состава по сравнению с методами анализа по квазилинейчатым спектрам люминесценции с возбуждением фильтрованным светом ртутно-кварцевой лампы (А. Я. Хесина и соавт.). Метод жидкостной хроматографии под давлением имеет преимущества как по точности, так и по чувствительности по сравнению со спектрофотомет-рическим анализом (Кейез-Баг^ег и МогПп). Каждая из предлагаемых методик, а также их комбинация могут быть использованы для определения ПАУ в загрязнениях окружающей среды в зависимости от тех реактивов и оборудования, которые имеются в распоряжении исследователя.
Литература. Дикун П. П. — Ж- приклад, спектроскопии, 1967, т. 6, № 2, с. 202. Ровинский Ф. Я-, Алексеева Т. А., Теплицкая Т. А. —
Метеорол. и гидрол., 1979, № 6, с. 41—45.
Теплицкая Т. А. Квазилинейчатые спектры люминесценции как метод исследования сложных природных органических смесей. М., 1971.
Теплицкая Т. А., Алексеева Т. А., Вальдман М. М. Атлас квазилинейчатых спектров люминесценции ароматических молекул. М-, 1978.
Хесина А. ЯСмирнов Г. А., Шабад Л. М. и др. — Гиг. и сан., 1978, № 1, с. 44—47.
Хесина А. Я., Смирнов Г. А., Шабад Л. М. и др. —
Там же, 1979, № 6, с. 39—43. Шабад Л. М. О циркуляции канцерогенов в окружающей
среде. М., 1973. Fritz W. — Nahrung, 1979, Bd 23, S. 63—81. Kerles-Saringer Af., Morlin Z. — Atmosph. Environm., 1975, v. 8, p. 831—834.
Поступила 30.05.83
УДК 613.633 + 614.7151:622.367.6
К. Колее
К ВОПРОСУ О ГИГИЕНИЧЕСКОМЗНАЧЕНИИ СУБМИКРОСКОПИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ АСБЕСТОВЫХ ПЫЛЕЙ В РАБОЧЕЙ И БЫТОВОЙ СРЕДЕ
Научный институт гигиены и профессиональных заболеваний, София, НРБ
Считается, что только асбестовые волокна длиной 5—8 мк в состоянии индуцировать легочные карциномы, плевральные и перитонеальные ме-зотелиомы (Wagner и соавт.; Maroudas и соавт.). В последние годы появилось значительное число сообщений о том, что и асбестовые волокна длиной менее 3 мк и даже 1 мк (Pott и соавт.) в состоянии привести к возникновению мезотелиом у людей и подопытных животных. Важна и еще не установлена причина увеличения частоты мезотелиом среди жителей крупных городов, никогда не находившихся в профессиональном контакте с асбестом (Meurman и соавт^ Ashcroft и Heppleston; Gilson). Все это создает проблемы при нормировании асбестовой пыли на промышленных предприятиях и в городах (Ф. М. Коган; Б. Никифоров и соавт.) и вызывает необходимость научных поисков механизма и выяснения характера их возникновения (Pylev; Pylev и Shabad).
В проведенных нами в 1969—1974 гг. исследованиях по оценке фиброгенности болгарского антофиллита с использованием асбестовых волокон около 1 мк установлено, что у некоторых животных, оставленных на выживание появляются метаплазия плеврального мезотелия и малигнизация некоторых мезотелиальных клеток. Это заставило нас поставить вопрос, имеют ли бластомогенный потенциал и активность асбестовые волокна, смолотые до степени полной изометричности волокон — до полной потери волокнистой структуры (Kolev). В данной работе представлены результаты наших экспериментальных исследований за период с 1977 по 1982 г.
Исследованы следующие виды асбеста: болгарский антофиллит, советский антофиллит, антофиллит (UICC) и крокидолит (UICC). Опыты проведены на 8 группах самок белых крыс линии Вистар (по 20 особей в группе) с начальной массой около 120 г, которые после однократного интраперито-неального и интраплеврального введения 50 мг асбестовой пыли в 1 мл физиологического раствора были оставлены на выживание. Крысы 4 групп получали раствор внутрибрюшинно и 4 групп — в плевральную полость. Пыль для эксперимента
получали, размельчая асбест 3 ч а агатовой шаровой мельнице с большими перерывами. Полученную пыль исследовали в лаборатории промышленных аэрозолей института посредством инфракрасной спектрофотометрии и электронной микроскопии. Дополнительно был проведен рентгено-структурный анализ исходной и полученной пыли.
Результаты исследований показали, что новообразования у подопытных животных наблюдались между 456-м и 683-м днем при продолжительности опыта 800 дней.
Забивали животных, явно потерявших признаки жизнеспособности. Новообразования исследовали патогистологическим, гистохимическим и электронно-микроскопическим способами.
Полученные результаты доказывают, что во всех случаях происходило образование мезотелиом с их гистологическими подвидами: саркоматозными, эпи-телиоидными, гигантоклеточными и смешанными.
Обращает на себя внимание, что у всех подопытных животных под воздействием изометрической ас-бестовой пыли (за исключением получавших интраплеврально болгарский асбест) развились мезотелиомы. Это еще раз подтверждает, что бла-стомогенная активность асбеста связана не только с его волокнистой структурой. Однако процент новообразований, возникших под действием изометрического асбеста ниже, в сравнении с процентом новообразований, обусловленных воздействием волокнистого асбеста. Второе — наличие сравнительно большого числа новообразований, развившихся при интраперитонеальном введении изомет-ричной асбестовой пыли, по сравнению с опухолями, появившимися в результате интраплеврального введения. Этот факт мы объясняем развившейся в течение многих лет толерантностью органов дыхания к воздействию поступающих в них с воздухом раздражающих агентов.
На данном этапе мы не можем дать ответ на вопрос, с чем связано появление мезотелиом при воздействии изометричного асбеста. Явно, что этиопатогенетический механизм их возникновения отличается от механизма, которым объяснялось развитие бластом под воздействием волокнистого
