CC BY-ND
22
50
ЗНиСО mm n>I (286)
УДК 612.7
СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ ПРОТИВОЛЕЙШМАНИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА, ПОЛУЧЕННЫЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ IN VITRO
Ю.К. Кузнецова
Институт медицинской паразитологии, тропических и трансмиссивных заболеваний им. Е.И. Марциновского Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, Россия
Представлены результаты экспериментальных исследований противолейшманиальной активности некоторых антибактериальных препаратов российского производства. Предварительные данные показывают эффективность доксициклина, цефтриаксона, цефотаксима в малых дозах и могут представлять терапевтическую альтернативу в лечении кожного лейшманиоза. Ключевые слова: паразитарные болезни, возбудители лейшманиоза, лекарственная терапия лейшманиоза, L. major, зоонозный кожный лейшманиоз, исследования in vitro.
Yu.K. Kuznetsova □ COMPARATIVE DATA OF ANTILEISHMANIAL ACTIVITY OF ANTIBACTERIAL DRUGS OF DOMESTIC PRODUCTION OBTAINED IN EXPERIMENTAL STUDIES IN VITRO □ Martsinovsky Institute of Medical Parasitology, Tropical and transmission diseases of the First Sechenov Moscow State Medical University under Ministry of Health of the Russion Federation, Moscow, Russia.
The results of experimental studies of antileishmanial activity of certain local antibacterial drugs are presented. Preliminary data show the effectiveness of doxycycline, ceftriaxone, cefotaxime in small doses and may be a therapeutic alternative in the treatment of cutaneous leishmaniasis.
Key words: parasitic diseases, causative agents of leishmaniasis, leishmaniasis drug therapy, L. major, zoonotic cutaneous leishmaniasis, studies in vitro.
В Российской Федерации с 2011 по 2014 год было зарегистрировано 23 случая лейшманиоза. Завозные случаи лейшманиоза зарегистрированы из Азербайджана, Армении, Грузии, Кыргызстана, Таджикистана, Узбекистана [2]. По данным ФМС России, в 2008 году на миграционный учет было поставлено около 9 миллионов иностранных граждан, в основном из стран СНГ. По некоторым оценкам, общая численность работающих в России иностранцев достигает 10—12 миллионов человек, включая нелегальную составляющую [5], что создает эпидемиологическую напряженность в стране по завозу, диагностике и лекарственной терапии лейшманиоза.
На сегодняшний день не существует ни одного эффективного способа или средства лечения для всех видов и синдромов лейшманиоза. Кроме того, существующие методы лечения, как правило, не приводят к паразитологическо-му излечению, и рецидивы в условиях иммуно-супрессии (например, ВИЧ) являются новым фокусом для дальнейших исследований [8].
В 2013 году некоторые европейские рекомендации по управлению кожным лейшманио-зом предложили новый, видо-направленный, подход в терапии [3, 4]. Данный подход стал возможен благодаря более доступным методам молекулярной диагностики видов [7]. Рекомендации ВОЗ от 2010 года были в первую очередь ориентированы на эндемичные страны, а не на туристов [6, 7]. Европейские рекомендации лечения лейшманиоза и методические рекомендации «LeishMan» [4] использовали Оксфордскую систему классификации доказательств, предложив ранжированное лечение Leishmania major, Leishmania tropica, Leishmania (V) pana-mensis, Leishmania (V) guyanensis, (V) Leishma-nia braziliensis и Leishmania mexicana и т. д.
В своих рекомендациях они учитывают степень тяжести инфекции (например, риск распространения на слизистую оболочку, размер, количество, расположение повреждений) и, в зависимости от этого, рекомендуют наблюдение или местную терапию для простого
кожного леишманиоза и пероральную или парентеральную системную терапию при осложненном кожном лейшманиозе [9, 10].
По этим причинам разработка новых терапевтических стратегий борьбы с кожным лейшманиозом остается приоритетной задачей здравоохранения.
Цель исследований - изучение противо-лейшманиальной активности антибактериальных препаратов российского производства в экспериментальных исследованиях in vitro.
Материалы и методы. Нами проведены экспериментальные исследования действия препаратов доксициклин, клафоран (цефотаксим), цеф-триаксон, меглумина антимонат (глюкантим) на L. major in vitro. Препаратом контроля выступил глюкантим. По данным некоторых исследований [4, 6], циклины показывали некоторую эффективность в лечении кожного лейшманиоза. Опубликованные данные противолейшманиальной активности остальных препаратов, принятых для исследований в данной работе, отсутствуют.
Для проведения лабораторных исследований использовалась культура L. major, находившаяся на хранении в криобанке Института медицинской паразитологии, трансмиссивных и тропических болезней им. Е.И. Марциновского, полученная от больного человека или животного путем аспирации из очага инфекции в начале 2000-х годов в Туркменистане.
С целью повышения урожайности культуры использовалась двухфазная среда. В качестве твердой фазы был взят кровяной агар NNN (Novy-Neal-Nicolle). Ее состав: агар-агар - 14,0 г, хлористый натрий - 6 г, дистиллированная вода - 900 мл. Жидкой фазой служила смесь среды 199 и 0,5 % раствора гидролизата лакталь-бумина. Лейшманий выращивают в темноте при оптимальной для роста промастигот температуре 22-25 °С. Для исследований отбиралась культура в возрасте с 5 по 10-12 дни. Число паразитов в 1мл культуры варьирует от 1 х 10 до 30-50 х 10 . Таким образом, в одной колбе можно получить 1,5-2,5 млрд промасти-гот за несколько дней. Культуры лейшманий на
январь ни (ж) зНиСО
51
^^ кровяных средах поддерживали без применения антибиотиков.
Для исследований противолейшманиальной активности изучаемых лекарственных препаратов готовили стерильную среду следующего состава: '^Е. дефибринированная кровь кролика - 1 объем, 6,3%-й раствор хлористого натрия - 1 объем, дистиллированная вода - 1 объем. Полученную среду центрифугировали, отсасывали жидкую фазу и хранили ее на холоде. Перед исследованием два объема среды смешивали с 1 объемом свежей кроличьей сыворотки. Затем рассчитывали объем среды для конкретного исследования.
В контрольные пробирки разлили чистую среду. В опытные пробирки вносили среду, в которую предварительно была добавлена сус6пензия промастигот лейшманий из расчета 1 х 106 мл, и тщательно размешивали. Смесь разливали по мини-пробиркам в объеме 0,47 мл, затем в каждую опытную пробирку вносили двукратные разведения испытуемых веществ в объеме 0,03 мл.
Через 5 дней инкубации при 22-25 °С в темноте содержимое пробирок исследовали в свежем и окрашенном мазке и таким образом определяли минимальную концентрацию препарата, полностью подавляющую рост промастигот [1].
Исследовались лекарственные средства цефо-таксим (клафоран), цефтриаксон, доксициклин, глюкантим в различных концентрациях, каждая из которых отличалась от предыдущей в два раза, с разницей между минимальными и максимальными концентрациями в 10 раз. Цефотаксим (кла-форан), цефтриаксон и доксициклин применялись в форме порошка. Их разводили питательной средой «Среда 199 с солями Хэнкса и с глутамином» в различных концентрациях по 4 мини-пробирки на каждую концентрацию.
Максимальное количество доксициклина, которое брали в первые 4 мини-пробирки, составляло по 0,006 г в 0,03 мл среды; минимальное количество этого препарата для последних 4 мини-пробирок - по 0,0006 г. Соответственно цефтри-аксона - 0,09 г и 0,009 г, цефотаксима (клафора-на) - 0,075 г и 0,0075 г. Разведение порошков лекарственных препаратов проводилось по индивидуальной инструкции к каждому из препаратов; использовались рекомендации для внутримышечного введения. Эти разведения были взяты как минимальные концентрации веществ для проведения опытов на культуре лейшманий.
Глюкантим - жидкость, поэтому во взвесь с лейшманиями объемом 0,47 мл добавляли от 0,03 мл до 0,12 мл, также по 4 пробирки каждого объема. В пересчете на граммы в 0,03 мл глюкантима сухого вещества - 0,009 г, в 0,12 мл - 0,036 г.
В контрольные 4 мини-пробирки добавлялось по 0,3 мл вышеназванной питательной среды.
Для исследования была взята культура L. major в возрасте 8 дней. Перед началом исследования среднеарифметическое количество лейш-маний в 1 поле зрения было равно 72, а в пересчете на 1 мл культуры - 28 000 000 промастигот. Подсчет паразитов производился с помощью камеры Горяева по формуле: Х х 50 х 1 000, где Х -суммарное число промастигот пяти квадрантов, просмотренных по диагонали. Данная серия опытов повторялась трижды. За «0» было принято считать состояние культуры, при котором все увиденные паразиты более чем в 5 квадрантах были абсолютно неподвижны.
Результаты исследования. Спустя 5 дней культура во всех мини-пробирках просматривалась в камере Горяева, подсчитывалось количество паразитов в каждом из пяти квадрантов, расположенных по диагонали, и вычислялось среднеарифметическое значение на 1 квадрант. В про-
бирках с доксициклином наблюдавшихся паразитов было менее 10 в 1 поле зрения, при этом все без исключения были неподвижны уже при минимальном (0,0006 г) количестве вещества.
В пробирках с цефтриаксоном живая культура также не визуализировалась, однако неподвижных промастигот было уже несколько меньше, обычно до 5 в одном поле зрения, при минимальной концентрации вещества (0,009 г). Однако в пробирках с цефотаксимом культура оставалась подвижной вплоть до количества 0,03 г, при котором лейшманий было 1-2 в поле зрения, и они оставались неподвижными; в более высоких концентрациях лейшмании если и встречались, то их было не более 2 в поле зрения, и они были неподвижны.
Действие глюкантима (как в минимальных, так и в максимальных дозировках) в опыте не проявило лейшманиястатического действия, т. е. все промастиготы (среднеарифметическое число паразитов на 1 квадрант при минимальной концентрации - 7,5, при максимальной - 2,5) в препарате продолжали активно совершать характерные поступательные движения. В контрольных пробирках в каждом просмотренном квадранте промасти-гот наблюдалось более 20, при этом все одноклеточные жгутиковые организмы активно двигались.
Выводы. Все испытуемые препараты обладают в разной степени выраженности противо-лейшманиальной активностью. Препараты докси-циклин, цефтриаксон проявили выраженную про-тиволейшманиальную активность при минимальных концентрациях 0,0006 г и 0,009 г соответственно, в то время как цефотаксим оказал цидный эффект лишь в количестве 0,03 г на 0,5 мл взвеси культуры. Глюкантим в данной серии опытов не оказал лейшманиястатического действия.
Доксициклин, цефтриаксон и цефотаксим отобраны для продолжения исследований in vivo для изучения возможных осложнений и побочных их действий на модельных животных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Роспотребнадзор: Официальный сайт. [Электронный ресурс]. Режим доступа: www.rospotrebnadzor.ru (дата обращения: 01.11.2016).
2. ФМС России: Официальный сайт. [Электронный ресурс]. Режим доступа: fms.gov.ru (дата обращения: 01.11.2016).
3. Blum J. et al. Leishman recommendations for treatment of cutaneous and mucosal leishmaniasis in travelers / J. Blum, P. Buffet, L. Visser // J. Travel. Med. 2014. № 21. P. 116-129.
4. Eiras D. et al.Cutaneous leishmaniasis: current treatment practices in the USA for returning travelers / D. Eiras, L. Kirkman, H. Murray // Curr .Treat Options Infec.t Dis. 2015. № 7. P. 52-62.
5. Hodiamont C. et al. Species-directed therapy for leishmaniasis in returning travellers: a comprehensive guide/ C. Hodiamont, P. Kager, A. Bart // PLoS. Negl. Trop. Dis. 2014. № 8. P. 2832-2840.
6. Khairulin F. et al. Treatment of cutaneous leishmaniasis with me-thacycline and doxycycline (vibramycin) / F. Khairulin, M. Ere-shov, Kh. Khuseiinova // Vestn. Dermatol. Venerol. 1989. № 3. P. 62-68.
7. Masmoudi A. et al. Doxycycline for the treatment of cutaneous leishmaniasis/ A. Masmoudi, A. Dammak, H. Chaaben [et al.] //Dermatology Online Jornal. 2008. №14(8).
8. Van der Auwera G. et al. Species typing in dermal leishmaniasis/ G.Van der Auwera, J. Dujardin // Clin. Microbiol. Rev. 2015. № 28. P. 265-294.
9. World Health Organization. 2010. Control of the leishmaniases. Report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases. Geneva, Switzerland. 22-26 March 2010 // WHO. Technical Report Series. 2010. № 949. P. 1-186.
10. World Health Organization. 2004. Scientific working group report on leishmaniasis. Geneva, Switzerland. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www/who/int/tdrold/publications/ publications/swg_leish.htm (дата обращения: 01.11.2016).
Контактная информация:
Кузнецова Юлия Константиновна, тел.:+7 (916)-171-39-39, е-mail: [email protected] Contact information:
Kuznetsova Yuliya, phone: +7 (916)-171-39-39, e-mail: [email protected]
