CC BY
2
JOURNAL MEDICAL UNIVERSITY
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Научная статья
УДК 617.55-007.43-089.844
doi: https://doi.Org//10.19163/1994-9480-2023-20-3-148-152
Сравнительное изучение методов модернизации герниопротезов как матрицы для культивирования фибробластов
И.С. Иванов н, А.А. Ушанов, Е.С. Мишина, В.А. Плотников, А.Р. Бобкова, К.С. Толкачев
Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия
Аннотация. Цель исследования - провести сравнительное изучение методов модернизации герниопротезов как матрицы для культивирования фибробластов. Материалы и методы. В условиях эксперимента было выполнено нанесение на поверхность сетчатых герниоэндопротезов вещества поликапролактона по оригинальной методике, предложенной В.В. Берещенко и коллективом соавторов (2019 г). В качестве объекта изучения был выбран поливинилиденфторидный гер-ниоэндопротез «Унифлекс Стандартный» (ООО «Линтекс», Санкт-Петербург, Россия). После нанесения полимера выполняли обработку низкотемпературной плазмой с характеристиками: частота - 5 кГц, напряжение импульса - 10 кВ, плотность мощности - 2 Вт/см2, время экспозиции - 5 минут. После этого выполнялась стерилизация образцов с помощью рентгеновского излучения с мощностью 150 кВ и экспозицией 3 мин. Нанесение клеток осуществлялось путем внесения образцов в среду DMEM с культурой фибробластов на 5 дней. Полученные образцы изучали при помощи сканирующей электронной микроскопии. Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического критерия Манна - Уитни в программе Statistica 10 (Dell Software Company, Round Rock, Texas, United States of America). Результаты. Полученные данные свидетельствуют об успешном прикреплении фибробластов на поверхность модифицированных герниопротезов. Выводы. Описанный процесс модификации герниопротеза может применяться с целью улучшения его свойств в ходе течения процессов репарации соединительной ткани in vivo.
Ключевые слова: грыжи, герниопротезирование, низкотемпературная плазма, поликапролактон, дермальные аутофибробласты
ORIGINAL RESEARCHES Original article
doi: https://doi.org//10.19163/1994-9480-2023-20-3-148-152
Comparative study of methods for the modernization of mesh prostheses as a matrix for the cultivation of fibroblasts
I.S. Ivanov H, A.A. Ushanov, E.S. Mishina, V.A. Plotnikov, A.R. Bobkova, K.S. Tolkachev
Kursk State Medical University, Kursk, Russia
Abstract. Objective: conduct a comparative study of methods for the modernization of mesh prostheses as a matrix for the cultivation of fibroblasts. Materials and methods: In the experiment conditions, polycaprolactone substance was applied to the surface of mesh hernioendoprostheses according to the original method proposed by V. V. Bereshchenko and a team of co-authors (2019). The polyvinylidene fluoride "Uniflex Standard" prosthesis (Lintex LLC, St. Petersburg, Russia) was chosen as the object of study. After applying the polymer, low-temperature plasma treatment was performed with the characteristics: frequency - 5 kHz, pulse voltage - 10 kV, power density - 2 W/cm2, exposure time - 5 minutes. After that, the samples were sterilized using X-ray radiation with a power of 150 kV and an exposure of 3 min. The application of cells was carried out by introducing samples into a DMEM medium with fibroblast culture for 5 days. The obtained samples were studied using scanning electron microscopy. Statistical processing was performed using the nonparametric Mann-Whitney test in the Statistica 10 program (Dell Software Company, Round Rock, Texas, United States of America). Results: The data obtained indicate the successful attachment of fibroblasts to the surface of modified hernioprostheses. Conclusions: The described process of hernioprosthesis modification can be used to improve its properties during the course of connective tissue repair processes in vivo.
Keywords: hernia, mesh prosthesis, low-temperature plasma, polycaprolactone, dermal autofibroblasts
Проблема вентральных грыж остается одной из самых актуальных в абдоминальной хирургии. Согласно данным литературы, во всей человеческой популяции от данной патологии страдают от 3,9 до 4,5 % [1]. В связи с этим не прекращается поиск как способов профилактики, так и лечения грыж. В наше время «золотым стандартом» лечения грыж передней
брюшной стенки является герниоэндопротезирование сетчатым герниопротезом [2]. Однако имплантация синтетических материалов связана с риском развития ряда экссудативных осложнений, например, сером. Кроме того, научное сообщество пришло к выводу, что сама по себе имплантация сетчатого протеза не является единственно достаточным средством лечения,
© Иванов И.С., Ушанов А.А., Мишина Е.С., Плотников В.А., Бобкова А.Р., Толкачев К.С., 2023 © Ivanov I.S., Ushanov A.A., Mishina E.S., Plotnikov V.A., Bobkova A.R., Tolkachev K.S., 2023
так как эта патология является лишь одни из проявлений дисколлагенозных состояний [3]. В случае же послеоперационных вентральных грыж имеются научные данные о несостоятельности самой соединительной ткани в области дефекта, что также ставит под вопрос полноценность и законченность исключительно хирургического лечения [4]. С этой целью предпринимаются попытки как системного, так и местного улучшения результатов оперативного вмешательства. Одним из примеров такого подхода является усовершенствование самого имплантируемого протеза с помощью модификации его поверхности и применения клеточных технологий [5]. Имплантации клеточного материала при герниопластиках (в том числе фибробластов) базируются на многочисленных научных работах, позволяющих судить как об эффективности такого метода модифицирования оперативного вмешательства, так и о перспективности всего направления в целом. Позитивные данные получены при использовании стромальных клеток, полученных из подкожно-жировой клетчатки, костного мозга, фетальной ткани, эмбрионального материала и некоторых других субстанций [6]. Множество данных получено и при попытках улучшения поверхностных свойств герниопротезов и при обработке их низкотемпературной плазмой. Обработку производили уже улучшенных герниопротезов с помощью нанесения поликапролактона на поверхность им-плантов [7, 8]. Поликапролактон является полимером с гидрофобными свойствами, однако фибробла-сты могут успешно закрепляться на его поверхности, особенно с учетом последующей модификации его поверхности [9].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить способность фибробластов к прикреплению на поверхность покрытого поликапролактоном сетчатого протеза.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование выполнялось на базе лаборатории морфологии и клеточных технологий НИИ Экспериментальной медицины ФГБОУ ВО «Курского государственного медицинского университета» в период с июня по декабрь 2022 года. Объектом исследования выбран сетчатый полимерный эндопротез «Унифлекс стандартный» (поливинилиденфторидная мононить диаметром 0,12 мм, толщина сетки 0,5 мм, поверхностная плотность 0,73 г/м2, объемная пористость около 90 %) производства ООО «Линтекс» (Санкт-Петербург, Россия). Во 2-й группе наблюдения в асептических условиях на материал сетки наносился 10%-й раствор поликапролактона в хлороформе согласно методике, описанной В.В. Берещенко и соавторами (2019 г.) [10].
JOURNAL = OF VOLGOGRAD STATE MEDICAL UNIVERSITY
В 3-й группе наблюдения следующим этапом модификации была обработка сеток низкотемпературной плазмой с характеристиками: частота - 5 кГц, напряжение импульса - 10 кВ, плотность мощности -2 Вт/см2, время экспозиции - 5 минут. Так как заданные характеристики не обеспечивают стерильность, выполнялась последующая стерилизация образцов с помощью рентгеновского излучения с мощностью 150 кВ и экспозицией 3 мин.
Во всех группах наблюдения на сетчатый протез наносились дермальные аутофибробласты, выделенные методом теплого трипсина из кожи лабораторного животного. С этой целью образцы помещались в среду DMEM + пенициллин + L-глутамат с культивированными в ней дермальными аутофи-бробластами в количестве 1,5 х 105 клеток. Период инкубации фибробластов вместе с протезом составлял 5 дней. С целью определения факта прикрепления и количественного подсчета фибро-бластов на модифицированных герниопротезах выполняли сканирующую электронную микроскопию полученных образцов при помощи сканирующего электронного микроскопа JEOL 6610LV (JEOL, Япония).
Ввиду небольших размеров выборки в экспериментальных группах исследования при выполнении расчетов было принято решение в качестве основной методики определения уровня статистической значимости отличий использовать непараметрический критерий Манна - Уитни. В качестве программной среды использовали программу Statistica 10 (производитель Dell Software Company, Round Rock, Texas, United States of America).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате полученных исследований было выявлено, что после культивирования дермальных аутофибробластов в течение 5 суток происходит их прикрепление к нитям эндопротеза. В группе с использованием герниопротеза «Унифлекс стандартный» на нитях синтетического материала визуализировались единичные клетки округлой или овальной формы. Большая часть клеток прикреплялась ко дну флакона, приобретая характерную распластанную форму с большим количеством отростков (рис. А).
В группе «Унифлекс стандартный» с последующей обработкой поликапролактоном вокруг нитей протеза визуализировались группы фибробластов. Большая часть клеток имели распластанную или вытянутую форму, что свидетельствует о прочности прикрепления к материалу (рис. Б, Д). Важно, что клеточный рост определялся как вокруг мест переплетения, так и между прямыми нитями.
МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА MEDICAL UNIVERSITY
Рис. Микрофотография при электронной микроскопии поверхности сетчатого эндопротеза «Унифлекс стандартный». СЭМ: А — без предварительной обработки протеза (ув. х200 х 10~6); Б — с обработкой поликапролактоном (ув. х250 х 10~6); В — с обработкой поликапролактон + низкотемпературная плазма (ув. . х400 х 106); Г — с обработкой поликапролактоном (ув. х500 х 10б; Д — с обработкой
поликапролактон + низкотемпературная плазма (ув. х400 х 10б)
JOURNAL MEDICAL UNIVERSITY
В группе «Унифлекс стандартный» с обработкой поликапролактон + низкотемпературная плазма также определялось прикрепление фибробластов к герниопротезу. При этом клетки преимущественно располагались поодиночке, имели округлую форму и локализовались только на прямых нитях, а в местах плетения отсутствовали (рис. В, Г). С учетом достаточно упорядоченного клеточного «рисунка» можно предположить, что клетки плотно фиксировались в местах насечек, полученных в результате обработки низкотемпературной плазмой. Такой способ обработки
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Оба способа обработки синтетического материала сетки стимулируют хорошее прикрепление и пролиферацию фибробластов. Однако выбор метода модернизации должен быть определен в зависимости от конкретной хирургической цели и условий оперативного вмешательства.
Капельное нанесение поликапролактона позволяет увеличить потенциальную поверхность колонизации фибробластами поверхности модифицированного импланта. Применение клеточных технологий в комбинации с усовершенствованием поверхности сетки, приводящей к улучшению тканевой реакции на нее, является логичным продолжением развития человеческих знаний в этой области. Обработка плазмой поверхности полимера позволяет нивелировать его гидрофобность и сделать доступной поверхность для клеточной колонизации. Фибробласты обладают способностью к прикреплению к модифицированной с помощью поликапролактона поверхности сетчатого герниопротеза.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Helgstrand F. National results after ventral hernia repair. Danish medical journal. 2016;63(7):B5258.
2. Quiroga-Centeno A.C. et al. Systematic review and meta-analysis of risk factors for Mesh infection following Abdominal Wall Hernia Repair Surgery. The American Journal of Surgery. 2022;224(1PtA):239-246. doi: 10.1016/j. amjsurg.2021.12.024.
3. Лазаренко В.А., Иванов С.В., Иванов И.С. и др. Биопсия кожи как метод определения показаний к превентивному эндопротезированию передней брюшной стенки.
синтетического материала подходит для исключительно стерильных условий, так как данные насечки могут служить местом локализации не только клеток соединительной ткани, но и бактерий.
При морфометрии клеток фибробластов, прикрепленных на нитях герниопротеза, было показано достоверное увеличение их количества после обработки поликапролактоном в 3,3 раза и в 3,4 раза с обработкой поликапролактон + низкотемпературная плазма по сравнению с группой «Унифлекс стандартный» (табл.).
Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2020;4:46-53. doi: 10.21626/vestnik/2020-4/06.
4. Thankam F.G., Palanikumar G., Fitzgibbons R.J., Agrawal D.K. Molecular mechanisms and potential therapeutic targets in incisional hernia. Journal of Surgical Research. 2019;236:134-143. doi: 10.1016/j.jss.2018.11.037.
5. Dydak K., Junka A., Nowacki G. et al. In Vitro Cytotoxicity, Colonisation by Fibroblasts and Antimicrobial Properties of Surgical Meshes Coated with Bacterial Cellulose. International journal of molecular sciences. 2022;23(9):4835. doi: 10.3390/ijms23094835.
6. Petter-Puchner A.H., Fortelny R.H., Gruber-Blum S. et al. The future of stem cell therapy in hernia and abdominal wall repair. Hernia. 2015;19(1):25-31. doi: 10.1007/ s10029-014-1288-7.
7. Stastna E., Castkova K., Rahel J. Influence of hydroxyapatite nanoparticles and surface plasma treatment on bioactivity of polycaprolactone nanofibers. Polymers. 2020;12(9):1877. doi: 10.3390/polym12091877.
8. Bolbasov E.N., Antonova L.V., Matveeva V.G. et al. Effect of radio frequency discharge plasma on surface properties and biocompatibility of polycaprolactone matrices. Biomeditsinskaia khimiia. 2016;62(1):56-63. doi: 10.18097/PBMC20166201056.
9. Турчин В.В., Солопов М.В., Жихарев Д.В. и др. Адгезия и жизнеспособность фетальных фибробластов человека, культивируемых на 3-печатном матриксе из полипро-лактона. Вестник неотложной и восстановительной хирургии. 2020;5(1):134-143. EDN: AVAUBO.
10. Берещенко В.В., Надыров Э.А., Лызиков А.Н. и др. Модифицированный полипропиленовый эндопротез для герниопластики: экспериментальная оценка эффективности его применения. Проблемы здоровья и экологии. 2019; 1(59):107-112.
Количественные показатели прикрепленных на нитях герниопротеза фибробластов
Экспериментальная группа Количество клеток на поверхности нитей протеза
«Унифлекс Стандартный» 1,5 X 104 ± 105,9
«Унифлекс Стандартный» с обработкой ноликанролактоном 4,9 X 104 ± 376,3*
«Унифлекс Стандартный» с обработкой поликапролактон + низкотемпературная плазма 5,1 X 104 ± 544,9*
*p < 0,01 по сравнению с грунной «Унифлекс стандартный».
REFERENCES
1. Helgstrand F. National results after ventral hernia repair. Danish medical journal. 2016;63(7):B5258.
2. Quiroga-Centeno A.C. et al. Systematic review and meta-analysis of risk factors for Mesh infection following Abdominal Wall Hernia Repair Surgery. The American Journal of Surgery. 2022;224(1PtA):239-246. doi: 10.1016/j. amjsurg.2021.12.024.
3. Lazarenko V.A., Ivanov S.V., Ivanov I.S., et al. Skin biopsy as a method of determining indications for preventive anterior abdominal wall replacement. Kurskii nauchno-prakticheskii vestnik "Chelovek i ego zdorov'e" = Kursk scientific and practical bulletin "Man and his health". 2020;4:46-53. (In Russ.) doi: 10.21626/vestnik/2020-4/06.
4. Thankam F.G., Palanikumar G., Fitzgibbons R.J., Agrawal D.K. Molecular mechanisms and potential therapeutic targets in incisional hernia. Journal of Surgical Research. 2019;236:134-143. doi: 10.1016/j.jss.2018.11.037.
5. Dydak K., Junka A., Nowacki G. et al. In Vitro Cytotoxicity, Colonisation by Fibroblasts and Antimicrobial Properties of Surgical Meshes Coated with Bacterial Cellulose. International journal of molecular sciences. 2022;23(9):4835. doi: 10.3390/ijms23094835.
MEDICAL UNIVERSITY
6. Petter-Puchner A.H., Fortelny R.H., Gruber-Blum S. et al. The future of stem cell therapy in hernia and abdominal wall repair. Hernia. 2015;19(1):25-31. doi: 10.1007/ s10029-014-1288-7.
7. Stastna E., Castkova K., Rahel J. Influence of hydroxyapatite nanoparticles and surface plasma treatment on bioactivity of polycaprolactone nanofibers. Polymers. 2020;12(9):1877. doi: 10.3390/polym12091877.
8. Bolbasov E.N., Antonova L.V., Matveeva V.G. et al. Effect of radio frequency discharge plasma on surface properties and biocompatibility of polycaprolactone matrices. Biomeditsinskaia khimiia. 2016;62(1):56-63. doi: 10.18097/ PBMC201662010569.
9. Turchyn V.V., Solopov M.V., Zhiharev D.V. et al. Adhesion and viability of human fetal fibroblasts cultured on 3d printed polycaprolactone matrix. Vestnik neotlozhnoi i vosstanovitel'noi khirurgii = Bulletin of Emergency and Restorative Surgery. 2020;(1):134-143. (In Russ.).
10. Bereshchenko V.V., Nadyrov E.A., Lyzikov A.N. and others. Modified polypropylene endoprosthesis for hernioplasty: experimental evaluation of its effectiveness. Problemy zdorov'ya i ekologii = Health and ecology issues. 2019;1(59):107—112. (In Russ.).
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Информация об авторах
Илья Сергеевич Иванов - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой хирургических болезней № 1, Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия; и [email protected], https://orcid.org/0000-0003-4408-961X Александр Александрович Ушанов - аспирант кафедры хирургических болезней № 1, Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия; https://orcid.org/0000-0003-0876-0656
Екатерина Сергеевна Мишина - кандидат медицинских наук, доцент, доцент кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, заведующая лабораторией морфологии и клеточных технологий, Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия; https://orcid.org/ 0000-0003-3835-0594
Владислав Александрович Плотников - студент 4-го курса лечебного факультета, Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия
Александра Руслановна Бобкова - студентка 4-го курса лечебного факультета, Курский государственный медицинский университет Курск, Россия
Кирилл Сергеевич Толкачев - ординатор кафедры травматологии и ортопедии, Курский государственный медицинский университет Курск, Россия; https://orcid.org/0009-0008-3822-1817
Статья поступила в редакцию 27.03.2023; одобрена после рецензирования 21.06.2023; принята к публикации 14.08.2023.
Competing interests. The authors declare that they have no competing interests. Information about the authors
Ilya S. Ivanov - Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Surgical Diseases No. 1, Kursk State Medical University, Kursk, Russia; и [email protected], https://orcid.org/0000-0003-4408-961X
Alexander A. Ushanov - Postgraduate student of the Department of Surgical Diseases No. 1, Kursk State Medical University, Kursk, Russia; https://orcid.org/0000-0003-0876-0656
Ekaterina S. Mishina - Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Histology, Embryology, Cytology, Head of the Laboratory of Morphology and Cell Technologies, Kursk State Medical University, Kursk, Russia; https://orcid.org/0000-0003-3835-0594
Vladislav A. Plotnikov - 4th year student of the Faculty of Medicine, Kursk State Medical University, Kursk, Russia; почта Alexandra R. Bobkova - 4th year Medical Faculty student, Kursk State Medical University Kursk, Russia Kirill S. Tolkachev - Resident of the Department of Traumatology and Orthopedics, Kursk State Medical University Kursk, Russia; https://orcid.org/0009-0008-3822-1817
The article was submitted 27.03.2023; approved after reviewing 21.06.2023; accepted for publication 14.08.2023.
