CC BY
60
УДК 541.136
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В НЕЙТРАЛЬНЫХ СРЕДАХ С ПОМОЩЬЮ МИКРООРГАНИЗМОВ
Escherichia coli и Enterobacter cloacae
М. Н. Наумова, М. О. Мещерякова, О. В. Турковская1, И. А. Казаринов и
Саратовский государственный университет имени Н. Г Чернышевского 410012, Россия, Саратов, ул. Астраханская, 83
1 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук 410049, Россия, Саратов, проспект Энтузиастов, 13
и E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 18.09.15 г.
Методом вращающегося дискового электрода изучено электрохимическое поведение редокс медиатора метиленового синего в биоэлектрохимической системе «глюкоза - клетки - медиатор - электрод» и показано, что метиленовый синий является обратимым окислительно-восстановительным медиатором и может быть применён при реализации микробного медиаторного анода на основе глюкозы и клеток Escherichia coli и Enterobacter cloacae.
Установлено, что лимитирующей стадией процесса биоэлектрохимического окисления глюкозы в нейтральных средах является диффузия восстановленной формы медиатора через клеточную мембрану микроорганизма. Показано, что величина его коэффициента диффузии через клеточную мембрану микроорганизмов E. coli составляет (4.5 ±0.2) • 10-7 см2/с, что в 3.5 раза выше величины коэффициента диффузии через клеточную мембрану микроорганизмов En. cloacae (1.3 ± 0.3) • 10-7 см2/с и, следовательно, клетки E. coli являются более эффективным биокатализатором процесса окисления глюкозы.
Ключевые слова: микробный электрокатализ, биоанод, медиатор, микроорганизмы, окисление, восстановление.
ICOMPARATIVE STUDYING OF KINETICS OF BIOELECTROCHEMICAL OXIDATION OF GLUCOSE IN NEUTRAL ENVIRONMENTS BY MEANS OF THE MICROORGANISMS
Escherichia coli and Enterobacter cloacae
M. N. Naumova, M. O. Meshcheryakova, O. V. Turkovskaya1, I. A. Kazarinov и
Saratov State University 83, Astrakhanskaya str., Saratov, 410012, Russia 1 The Russian Academy of Sciences'Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms
13, ave. Entuziastov, Saratov, 410049, Russia
и E-mail: [email protected] Received 18.09.15
The method of the rotating disk electrode studied electrochemical behavior redox mediator methylene blue in bioelectrochemical system «glucose - cell - mediator - electrode» and is shown that methylene blue is reversible oxidation-reduction a mediator and can be applicable at realization of the microbic media even anode on the basis of glucose and cell of Escherichia coli and Enterobacter cloacae.
It is established that the limiting stage of process of bioelectrochemical oxidation of glucose in neutral environments is diffusion reduce to condition a mediator through a cellular membrane of a microorganism. It is shown that the size of its coefficient of diffusion through a cellular membrane of microorganisms of E. coli makes (4.5 ± 0.2) • 107 cm2/s with that diffusion coefficient sizes through a cellular membrane of microorganisms of En. cloacae (1.3 ± 0.3) • 107 of cm2/s are 3.5 times higher with and, therefore, cell of E. coli are more effective biocatalyst the process of oxidation of glucose.
Key words: microbial electrocatalysis, bioanode, mediator, microorganisms, oxidation, reduction.
ВВЕДЕНИЕ
Сокращение зависимости от ископаемого топлива и снижение загрязнений - это основные тенденции, заставляющие человечество искать новые источники энергии. Обработка сточных вод - область, в которой две эти цели могут быть совмещены.
Проблема очистки сточных вод начиная со второй половины XX века является актуальной для всех
стран мира. С коллоидно-химической точки зрения сточные воды это гетерогенная смесь растворённых, коллоидных и взвешенных в воде примесей органического и неорганического характера. Органическое вещество, которое ныне идёт в отходы или теряется в процессах переработки сточных вод, богато энергией. Утилизация части этой энергии обеспечила бы новый источник электроэнергии. Либо мы могли бы освободить эту скрытую энергию в производствен-
© НАУМОВА М. Н., МЕЩЕРЯКОВА М. О., ТУРКОВСКАЯ О. В., КАЗАРИНОВ И. А., 2015
ных процессах, чтобы получить другие полезные химикаты, такие как биотопливо или индустриальные химикаты, что в настоящее время является актуальной проблемой.
Промышленные сточные воды, например, от отраслей пищевой промышленности и пивоваренных заводов, сельскохозяйственные сточные воды от животных ферм, являются идеальным сырьём для биообработки, поскольку они содержат высокие уровни легко деградируемого органического материала, что приводит к экономической выгоде, даже когда требуется подогревание жидкости. Кроме того, они уже имеют высокое содержание воды, что исключает необходимость её добавления. Такие сточные воды - потенциальные объекты переработки, из которых можно получать биоэнергию и биохимикаты. Восстановление энергии и ценных продуктов могло бы частично скомпенсировать стоимость обработки сточных вод и несколько уменьшить нашу зависимость от ископаемого топлива.
Есть несколько биологических стратегий обработки промышленных и сельскохозяйственных сточных вод. Три из этих стратегий приводят к выработке биоэнергии (электричество, метан, водород), а четвёртая - к ферментативному получению биохимикатов. Однако для внедрения каждой из этих технологий существуют научно-технические проблемы, важнейшей из которых является подбор соответствующих микробиологических систем.
Технологии с использованием микробных топливных элементов, которые могут конвертировать энергию, запасённую в химических связях органических соединений, в электрическую с помощью ферментативных реакций микроорганизмов, вызывают наибольший интерес в последние десятилетия [1].
Поэтому целью работы является сравнительное изучение биоэлектрохимического окисления глюкозы в нейтральных средах с помощью микроорганизмов Escherichia coli и Enterobacter cloacae, установление эффективности их работы в качестве биокатализаторов.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Штаммы Escherichia coli К-12 (IBPPM 204) и Enterobacter cloacae К-7 (IBPPM 476) получены из Коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН. Бактерии выращивались на твёрдой питательной среде LB с последующим пересевом на жидкую питательную среду LB [2]. Культивирование проводилось в конической колбе на круговой качалке при температуре 37°C в аэробных условиях. После двенадцатичасового культивирования биомасса трижды отмывалась центрифугирова-
нием (5000 об./мин, 5 минут) с последующим ресус-пензированием в фосфатном буфере.
Для проведения электрохимического эксперимента использовалась стеклянная герметичная трёх-электродная ячейка, снабжённая наружной стеклянной рубашкой для термостатирования. Эксперименты проводились в термостатических условиях при температуре 37°С с применением водяного термостата УТ-10. Ячейка была снабжена специальным отверстием со стеклянной трубкой для прокачивания через рабочий электролит аргона (марки А) с целью удаления из ячейки кислорода и создания анаэробных условий. Перед проведением экспериментов ячейка тщательно промывалась концентрированной серной кислотой (й = 1.393 г/см3) и дистиллированной водой.
Потенциометрические измерения проводились относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения (ЭВЛ-1М1), имевшего потенциал +0.201 В (н.в.э.). Электрод сравнения, погружённый в насыщенный раствор хлорида калия, соединялся с ячейкой через агар-агаровый мостик.
Вспомогательный электрод был выполнен из платиновой проволоки, скрученной в спираль, которая помещалась в отсек с рабочим электролитом.
Рабочий электролит - раствор хлорида натрия, приготовленный растворением кристаллической соли в фосфатном буфере (рН 7.0) [3]. Растворы фосфатов готовились растворением навесок кристаллических солей в бидистиллированной воде. Навеска кристаллической соли №С1 (х.ч.) растворялась в полученной смеси фосфатов из расчёта 10 г/л.
В качестве медиатора применяли окислительно-восстановительный индикатор - метиленовый синий (ч.д.а). Выбор указанного медиатора основан, во-первых, на том, что он соответствует практически всем требованиям, предъявляемым экзогенным медиаторам [4], во-вторых, его электрохимические свойства хорошо изучены [5, 6] и, в-третьих, окисленные и восстановленные формы растворов мети-ленового синего различаются по цвету, что позволяет визуально оценивать эффективность протекания метаболизма субстрата и электрохимического превращения медиатора.
В качестве субстрата был выбран раствор глюкозы С6Н1206 (х.ч.).
При проведении экспериментов использовались различные концентрации растворов медиатора и субстрата, которые готовились растворением навесок этих веществ в этиловом спирте и бидистилли-рованной воде соответственно.
Вращающиеся дисковые электроды были выбраны в качестве рабочих электродов, которые пред-
ставляли собой торцы стержней из стеклоуглеро-да. Нерабочие поверхности электродов (боковые поверхности стержней) изолировались. В качестве материалов для изоляции электрода был выбран фторопласт-4 (тефлон). Диаметры дисков составляли 3 мм (S =0.071 см2). Непосредственно перед экспериментом проводилась обработка торцевых поверхностей электродов, которая выражалась в зачистке их наждачной бумагой разной зернистости и промывании горячей дистиллированной водой.
Изучение поляризационных характеристик проводилось в электрохимической ячейке с помощью потенциостата IPC-2000, интегрированного с персональным компьютером. Обработка результатов измерений проводилась с помощью программы Microsoft Excel.
Суть биоэлектрохимического эксперимента заключалась в следующем. Собранная ячейка заполнялась электролитом таким образом, чтобы в системе не было пузырьков воздуха. Спираль вспомогательного электрода опускалась в электролит полностью. Затем отсек рабочего электрода герметизировался и продувался аргоном. Рубашка ячейки соединялась с резервуаром термостата, и по ней в течение всего эксперимента циркулировала вода.
После создания в отсеке рабочего электрода нужных физиологических условий - отсутствие кислорода, температура 37°C - в этот отсек с помощью шприца вводились растворы медиатора, субстрата и бактериальная суспензия.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Массоперенос играет важную роль в химических реакциях, поэтому проблемам массопереноса в течение многих лет уделялось большое внимание. В ферментативном катализе проблемы массопере-носа начали привлекать внимание исследователей в связи с изучением кинетики действия ферментов и микроорганизмов в электрохимических системах.
Гетерогенные превращения на границе раздела фаз (частным случаем которых являются электрохимические реакции) состоят из нескольких последовательных стадий, среди которых обязательными являются: перенос реагирующих веществ к месту реакции, собственно гетерогенного превращения и отвод продуктов реакции от реакционной поверхности.
С целью изучения кинетики электрохимических процессов, протекающих во внешнедиффузи-онной цепи, были проведены амперометрические измерения биоэлектрохимического окисления глюкозы бактериальными клетками E. coli и En. cloacae на вращающемся дисковом электроде.
На рис. 1 приведены потенциостатические кривые анодного окисления метиленового синего на платиновом вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 4.6 ■ 10-3 моль/л глюкозы, 2 мг вл. массы/мл клеток E. coli и 7.5 ■ • 10-4 моль/л медиатора при различных скоростях вращения дискового электрода.
Рис. 1. Потенциостатические кривые анодного окисления метиленового синего на вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 7.5 • 10-4 моль/л медиатора, 4.6 •
• 10-3 моль/л глюкозы и 2 мг вл. массы/мл клеток E. coli при различных скоростях вращения (рад/с): 1 — 36.6; 2 — 54.5; 3 —
80.64; 4 - 104.6; 5 - 151.8 при потенциале +0.250 В
На рис. 2 приведены потенциостатические кривые анодного окисления метиленового синего на стеклографитовом вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 4.6 •
• 10-3 моль/л глюкозы, 1.5 • 109 клеток/мл En. cloacae и 7.5 • 10-4 моль/л медиатора при различных скоростях вращения дискового электрода.
Рис. 2. Потенциостатические кривые анодного окисления мети-ленового синего на вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 7.5 • 10-4 моль/л медиатора, 4.6 • • 10-3 моль/л глюкозы и 1.5 • 109 клеток/мл En. cloacae при различных скоростях вращения (рад/с): 1 — 104.6; 2 — 177.9;
3 - 251.2; 4 - 324.5 при потенциале +0.080 В
Из рис. 1, 2 видно, что при добавлении бактериальных клеток в рабочий электролит начинается резкое возрастание плотности анодного тока, поскольку происходит увеличение концентрации восстановленной формы метиленового синего в объёме раствора, о чём свидетельствует постепенное обесцвечивание электролита. Кривые проходят через максимум, после чего наблюдается постепенное снижение плотности тока во времени с выходом на постоянное значение, что, по всей видимости, связано со снижением концентрации восстановленной формы медиатора в объёме раствора. Величина плотности тока максимума возрастает при увеличении скорости вращения дискового электрода.
На рис. 3 представлена зависимость плотности предельного тока процесса восстановления метиле-нового синего клетками E. coli и En. cloacae от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода.
Как видно из рис. 3, наблюдается прямая пропорциональная зависимость между плотностью предельного диффузионного тока исследуемого медиатора и корнем квадратным из угловой скорости вращения вращающегося дискового электрода. В этом случае id, ю1/2 - кривые легко аппроксимируются прямыми линиями, проходящими через начало координат, что свидетельствует о диффузионной природе процессов восстановления исследуемого медиатора.
100 JT
80
60
40
20
10
15
20
w1/2, (рад/с)1/2
Рис. 3. Зависимость плотности тока максимума катодного восстановления метиленового синего клетками E. coli (1) и En. cloacae (2) от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода
Доказанный нами факт, что электрохимическая реакция восстановления метиленового синего из клеток E. coli и En. cloacae протекает в режиме диффузионной кинетики, даёт возможность приме-
нить уравнение Левича для определения физико-химической характеристики вещества - коэффициента диффузии исследуемого медиатора в растворе электролита, содержащего бактериальную суспензию [7] (см. таблицу).
Рассчитанное значение коэффициента диффузии метиленового синего в растворе электролита, содержащего бактериальную суспензию E. coli составило (4.5 ± 0.2)-10-7 см2/с, а в растворе электролита, содержащего бактериальную суспензию En. cloacae - (1.3 ± 0.3)10-7 см2/с.
Из полученных данных видно, что значения ко-эффициетов диффузии метиленового синего в представленных экспериментах зависят от природы бактериальной суспензии, используемой в качестве катализатора процесса окисления глюкозы. Это свидетельствует о том, что мы наблюдаем не внеш-недиффузионный (диффузия в объёме электролита), а внутри - диффузионный контроль, т. е. лимитирующей стадией является перенос медиатора через наружную мембрану бактериальной клетки.
Для анализа кинетики явлений был выбран механизм ферментативной реакции, который основывается на представлении о фермент-субстратном комплексе, образующемся при превращении субстрата в продукт под действием фермента.
Считается, что механизм ферментативной реакции заключается в следующем: субстрат проникает через внешнюю мембрану клетки, образует комплекс с активным центром фермента, в комплексе происходят фермент-субстратные изменения, образуются продукты реакции, которые уходят из активного центра, освобождая его для взаимодействия с новой молекулой субстрата (рис. 4) [8]. Медиатор должен быть специфическим субстратом фермента и, кроме того, электрохимически активным на электроде из данного материала.
Рис. 4. Схематическая модель процесса окисления субстрата бактериальными клетками в присутствии медиатора [8]
С учётом вышеизложенного схема процесса переноса электронов в системе «субстрат - микроорга-
0
0
5
низм - медиатор - электрод» имеет следующий вид:
k1 k2
S -F ^ FS -4 P + F
°клет ^ок,клет ^— ^°клет A клет + ^в k-1
- клет + ^в,клет>
(1)
этой причине клетки En. cloacae являются менее эффективным катализатором по сравнению с клетками E. coli для биоэлектрохимического окисления глюкозы.
Мо
k3 k4
— Ев,клет ^— ЕМ-клет * М-в
k-3
Электрод _
МВ-> МОк + ne ,
+ Ео
(2) (3)
где S^er и Рклет - субстрат и продукт внутри бактериальной клетки;
Мок, клет и Мв клет - окисленная и восстановленная формы медиатора внутри бактериальной клетки соответственно;
Мок и Мв - окисленная и восстановленная формы медиатора вне бактериальной клетки соответственно;
Еок,клет и Евклет - фермент, локализованный в цитоплазматической мембране бактериальной клетки в окисленном и восстановленном состояниях соответственно.
Как видно из полученных данных, коэффициент диффузии восстановленной формы метиленово-го синего из клеток E. coli в 3.5 раза выше, чем из клеток En. cloacae. В то же время эти значения много меньше соответствующей величины в свободном объёме раствора (1.3 ± 0.1) • 106 см2/с [9]. Это указывает на то, что при подборе микроорганизмов в качестве катализаторов биоэлектрохимического окисления субстратов необходимо учитывать механизм переноса медиатора через клеточную мембрану. По
ВЫВОДЫ
1. Изучено электрохимическое поведение медиатора метиленового синего в биоэлектрохимической системе «глюкоза - клетки - медиатор - электрод» и показано, что метиленовый синий является обратимым окислительно-восстановительными медиатором и может быть применим при реализации микробного медиаторного анода на основе глюкозы и клеток E. coli и En. cloacae.
2. Установлено, что лимитирующей стадией процесса биоэлектрохимического окисления глюкозы в нейтральных средах является диффузия восстановленной формы медиатора (метиленового синего) через клеточную мембрану микроорганизма. Показано, что величина коэффициента диффузии мети-ленового синего через клеточную мембрану микроорганизмов E. coli составляет (4.5 ± 0.2) • 107 см2/с, что в 3.5 раза выше величины коэффициента диффузии метиленового синего через клеточную мембрану микроорганизмов En. cloacae ((1.3 ± 0.3) • 107 см2/с), и, следовательно, клетки E. coli являются более эффективным биокатализатором процесса окисления глюкозы.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ в рамках Госзадания по проекту № 4.1212.2014/K.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Davila D., Esquivel J., Vigues N. Development and Optimization of Microbial Fuel Cells // J. New Mater. Electroch. Systems. 2008. Vol. 11. P. 99-103.
2. Миллер Д.Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. 440 с.
3. Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1965. 390 с.
4. Казаринов И. А., Игнатова А. А., Наумова М. Н. Кинетика электрокаталитического окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli в присутствии экзогенных медиаторов // Электрохимия. 2014. Т. 50, № 1. С. 97-101.
5. Градсков Д. А., Казаринов И. А., Игнатов В. В. Биоэлектрохимическое окисление глюкозы с помощью бактерии Escherihia coli // Электрохимия. 2000. Т. 37, № 11. С. 13971400.
6. Kim J. R., Jung S. H., Regan J. M., Logan B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells // Bioresource Technology. 2007. Vol. 98. P. 2568-2577.
7. Плесков Ю. В., Филиновский В. Ю. Вращающийся дисковый электрод. М.: Наука, 1972. 344 с.
8. Варфоломеев С. Д.Химическая энзимология. М.: Академия, 2005. 480 с.
9. Казаринов И. А., Кузьмичева Е. В., Игнатова А. А. Оценка эффективности работы экзогенных редокс-медиаторов в биоэлектрохимической системе глюкоза - клетки Escherihia coli - медиатор // Электрохим. энергетика. 2011. Т. 11, № 2. С. 60-64.
RFFFRFNCFS
1. Davila D., Esquivel J., Vigues N. Development and Optimization of Microbial Fuel Cells. J. New Mater. Electroch. Systems, 2008, vol. 11, pp. 99-103.
2. Miller D. Eksperimenty v molekulyarnoy genetike. [Experiments in molecular genetics]. Moscow, Mir Publ., 1976, pp. 440 (in Russian).
3. Lurie Y. Y. Spravochnik po analiticheskoy khimii. [Handbook of Analytical Chemistry]. Moscow, Khimiya Publ., 1965, pp. 390 (in Russian).
4. Kazarinov I. A., Ignatova A. A., Naumova M. N. Kinetics of the Electrocatalytic Oxidation of Glucose by Escherichia coli Bacterial Cells in the Presence of Exogenous Mediators.
Russian J. Electrochemistry, 2014, vol. 50, no. 1. pp. 87-91 (in Russian).
5. Gradskij D. A., Kazarinov I. A., Ignatov V. V. Bioelektrokhimicheskoye okisleniye glyukozy s pomoshch'yu bakterii Escherihia coli [Bioelectrochemical glucose oxidation using bacteria Escherihia coli]. Russian J. Electrochemistry, 2000, vol. 37, no. 6, pp. 1397-1400 (in Russian).
6. Kim J. R., Jung S. H., Regan J. M., Logan B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresource Technology, 2007, vol. 98, pp. 2568-2577.
7. Pleskov Y. V., Filinovskiy V. Y. Vrashchayushchiysya diskovyy elektrod [Rotating disk electrode]. Moscow, Nauka Publ., 1972, 344 p. (in Russian).
8. Varfolomeyev S. D. Khimicheskaya enzimologiya [Chemical enzymology]. Moscow, Akademiya Publ., 2005, 480 p. (in Russian).
9. Kazarinov I. A., Kuzmicheva E. V., Ignatova A. A. The estimation of performance of exogenous redox mediatorsin the bioelectrochemical system glucose - Escherihia coli cells - mediator. Elektrokhimicheskaya energetika (Electrochemical energetics), 2011, vol. 11, no. 2. pp. 60-64.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Наумова Мария Николаевна - студентка, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского». Служебный телефон: (8452) 51-64-13, e-mail: [email protected]
Мещерякова Мария Олеговна - студентка, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского». Служебный телефон: (8452) 51-64-13, e-mail: [email protected]
Турковская Ольга Викторовна - д-р биол. наук, руководитель лаборатории, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов. Служебный телефон: (8452) 97-04-94, e-mail: [email protected]
Казаринов Иван Алексеевич - д-р хим. наук, профессор, зав. кафедрой физической химии, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского». Служебный телефон: (8452) 51-64-13, e-mail: [email protected]
