CC BY
50
УДК 591.1: 612
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ МЕТОТРЕКСАТА И ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ КРОЛИКОВ
© 2009 А. Н. Барков
аспирант каф. зоологии и теории эволюции e-mail: [email protected]
Научно-исследовательская лаборатория «Генетика»
Курский государственный университет
Представлены данные сравнительного влияния метотрексата и фолиевой кислоты на функциональную активность рибосомных генов в интерфазных ядрах лимфоцитов периферической крови кроликов. Выявлено активирующее влияние метотрексата на процессы транскрипции рибосомных цистронов. Действие фолиевой кислоты продемонстрировало противоположный характер.
Ключевые слова: функциональная активность рибосомных генов, лимфоциты периферической крови, метотрексат, фолиевая кислота.
Проблема регуляции биосинтеза белка - одна из наиболее важных и острых проблем современного естествознания. Современное развитие молекулярной генетики также открывает новые возможности оценки работы целого генома - в перспективе изучения и понимания различных аспектов работы кластеров рибосомных генов. В настоящее время активно изучается транскрипция генов рРНК и ее регуляция. Рядом исследований последних лет по изменчивости функциональной активности рибосомных генов [Барановская 1991; Смирнова 2002] обнаружено, что активность рибосомных цистронов является важным интегральным маркером функционального состояния клеток [Ядрышкообразующие районы... 2001].
На сегодняшний день известны данные по работе генома не только человека, но и животных, связанные с функциональной активности рибосомных генов в лимфоцитах периферической крови у разных видов млекопитающих. К примеру, достаточно хорошо изучены особенности строения и работы кластеров рибосомных генов у копытных [Анализ распределения. 1997], грызунов [Ментейфель 1986] и др. Согласно
имеющимся данным, не вызывает сомнений схожесть функционирования рибосомных генов человека и других представителей класса Млекопитающие как в зависимости от общего функционального состояния клеток, так и при воздействии разного рода экзогенных факторов [Стржижевский 1972; Руководство. 2005].
Целью нашего исследования явилось изучение сравнительного характера изменчивости параметров функциональной активности рибосомных генов кроликов при дозированном воздействии метотрексата и фолиевой кислоты.
Материалом для исследования послужили интерфазные ядра лимфоцитов периферической крови животных. Было получено и проанализировано 400 образцов ядер. При постановке культуры клеток лимфоцитов периферической крови использовался полумикрометод [Ядрышкообразующие районы. 2001]. Концентрации введенных в организм кроликов ксенобиотиков составили: метотрексата - 20 мг/кг, 40 мг/кг, 70 мг/кг, 250 мг/кг. В качестве контроля послужила кровь кроликов, которым вещества не вводились.
Анализ результатов проводили на световом микроскопе с помощью цифровых систем-анализаторов изображений и пакета прикладных программ «Image Scope» и
«KaryoService». Определяли следующие показатели функциональной активности рибосомных генов: площадь ядра, количество окрашенных ядрышек, площадь окрашенных ядрышек и площадь ядра лимфоцита. После определения вышеперечисленных показателей производили подсчёт суммарной площади окрашенных ядрышек и расчёт ее процентного отношения к площади ядра лимфоцита периферической крови. Статистический анализ сформированного банка данных проводился на ПК с использованием пакета прикладных программ STATISTICA фирмы StatSoft Inc. (США), версия 6.0. Обработка данных осуществлялась по стандартным методикам вариационной статистики [Трубников 1980]. Для проверки достоверности различий между совокупностями использовался критерий Стьюдента для несвязанных групп [Реброва 2003]. Уровень значимости р принимали при<0,05.
По результатам сравнительного анализа воздействия выбранных концентраций метотрексата на функциональную активность рибосомных генов интерфазных ядер лимфоцитов кроликов (табл. 1) следует отметить, что значимое изменение отношения суммарной площади ядрышек к площади ядра наблюдалось при воздействии ксенобиотика в концентрации 250 мг/кг массы тела животного. При этом показатель увеличился с 11,02 процентов в контроле до 14,96 процентов. Коэффициент Стьюдента составил в данном случае 3,99. Во всех остальных концентрациях достоверных изменений по данному показателю не установлено.
Отсутствовали значимые изменения в количестве ядрышек во всех концентрациях вводимого вещества, кроме последней, где показатель ФАРГ уменьшился до 1,83 по сравнению с 2,30 ядрышками в контроле. Достоверное изменение площадей ядрышек наблюдалось при воздействии ксенобиотика в концентрации 40 мг/кг массы тела. Здесь произошло увеличение показателя с 936,48 мкм2 до 1035,78 мкм2 (t=2,41). По остальным концентрациям достоверных изменений не было, это относится и к параметру площади ядра.
Таблица 1
Показатели ФАРГ кроликов в интерфазных ядрах лимфоцитов периферической крови в результате воздействия метотрексата
№ признака Контроль (I) (N=40) 20 мг/кг (II) (N=40) 40 мг/кг (III) (N=40) t
X±Sx X±Sx X±Sx I-II I-III
1 2,30±0,15 2,13±0,13 2,350±0,17 0,90 0,22
2 93б,48±70,94 923,15±б2,00 1035,78±59,9б 0,14 1,07
3 8410,50±354,7б 815б,50±288,83 8179,75±275,14 0,55 0,51
4 11,02±0,б0 11,17±0,51 12,58±0,52 0,19 1,99
№ признака Контроль (I) (N=40) T0 мг/кг (IV) (N=40) 250 мг/кг (V) (N=40) t
X±Sx X±Sx X±Sx I-IV I-V
1 2,30±0,15 2,20±0,14 1,83±0,11 0,49 2,55*
2 93б,48±70,94 1059,33±70,98 1214,18±90,75 1,22 2,41*
3 8410,50±354,7б 8825,50±347,б7 7971,50±34б,83 0,84 0,88
4 11,02±0,б0 11,81±0,39 14,9б±0,79 1,11 3,99*
1 - количество ядрышек, 2 - суммарная площадь ядрышек (мкм2), 3 - площадь ядра (мкм2), 4 -
отношение суммарной площади ядрышек к площади ядра (%). *- различия статистически достоверны при р<0,05
Результаты сравнительного анализа воздействия различных концентраций фолиевой кислоты на функциональную активность рибосомных генов лимфоцитов периферической крови кроликов (табл. 2) демонстрируют отсутствие достоверных изменений числа ядрышек, а также отсутствие значимых изменений относительно
суммарной площади ядрышек при воздействии концентраций 60 мкг/кг и 3,36 мг/кг. В остальных же случаях наблюдалось снижение данного показателя до 1066,05 мкм2 при воздействии концентрации 15,3 мг/кг и его увеличение до 1678,45 мкм2 в концентрации 55 мг/кг по сравнению с 1390 мкм2 в контроле. Площадь ядра незначительно увеличилась при воздействии ксенобиотика в концентрации 60 мкг/кг и незначительно уменьшилась при воздействии концентрации 3,26 мг/кг. Статистически значимые изменения по данному показателю наблюдались при воздействии витамина в концентрациях 15,3 мг/кг и 55 мг/кг. В первом случае произошло уменьшение показателя, во втором - его увеличение. Это в целом сказалось на процентном отношении площади ядрышек к площади ядер. По данному показателю достоверные различия произошли при воздействии на организм кроликов витамина в концентрации 55 мг/кг (1=3,41). Следует отметить, что наибольшие изменения площадей ядрышек произошли при воздействии витамина в этой же концентрации (1678,45 мкм2).
Таблица 2
Показатели ФАРГ кроликов в интерфазных ядрах лимфоцитов периферической крови в результате воздействия фолиевой кислоты
№ Контроль (I) (N=40) 60 мкг/кг (II) (N=40) 3,26 мг/кг (III) (N=40) t
признака Х±£х Х^х Х^х I- II I- III
1 2,25±0,13 2,25±0,13 2,25±0,16 0 0,0 0 0,0
2 1390,43±96,78 1458,35±72,80 1206,30±75,27 6 0,5 0 1,5
3 9530,00±3 80,00 10393±497,85 9179,50±365,92 8 1,3 6 0,6
4 14,24±0,65 14,10±0,43 13,02±0,53 7 0,1 4 1,4
№ Контроль (I) (N=40) 15,3 мг/кг (IV) (N=40) 55 мг/кг (V) (N=40) t
признака Х±£х Х^х Х^х I- IV ГУ
1 2,25±0,13 2,25±0,13 2,37±0,13 0 0,0 7 0,6
2 1390,43±96,78 1066,05±39,57 1678,45±79,10 0* 3,1 0* 2,3
3 9530,00±3 80,00 7176,75±153,50 9714,25±307,92 4* 5,7 8 0,3
4 14,24±0,65 14,95±0,56 17,16±0,55 2 0,8 1* 3,4
1 - количество ядрышек, 2 - суммарная площадь ядрышек (мкм2), 3 - площадь ядра (мкм2), 4 -отношение суммарной площади ядрышек к площади ядра (%). *- различия статистически достоверны при р<0,05
Настоящий эксперимент является частью нашего исследования по выяснению сравнительного влияния экзогенных химических факторов на интенсивность транскрипции рибосомных генов кроликов и человека. Описанные выше данные свидетельствуют о наличии устойчивых изменений в параметрах функциональной активности рибосомных генов при воздействии на генетический аппарат лимфоцитов периферической крови отдельных доз метотрексата и фолиевой кислоты. Оба вещества являются антагонистами друг друга, и противоположный характер изменений главного цитогенетического показателя, характеризующего интенсивность транскрипции
рибосомных генов, - суммарной площади ядрышек - (при воздействии метотрексата в концентрации 40 мг/кг и фолиевой кислоты в концентрации 15,3 мг/кг) подтверждает это. Данный факт может объясняться: 1) структурно-функциональными свойствами самих веществ; 2) структурно-функциональными особенностями лимфоцитов, одной из которых может быть свойство изменчивости проницаемости клеточной мембраны при различных исследуемых нами концентрациях вводимых веществ; 3) функционированием неизвестных нам структурных элементов рибосомных генов, которые, в зависимости от свойств экзогенного вещества, активируют транскрипцию молчащих копий рибосомных генов или ингибируют транскрипцию уже работающих в клетке.
Полученные данные также позволяют по-новому взглянуть на особенности работы рибосомального аппарата и в новом свете интерпретировать специфику вариативной изменчивости транскрипции рибосомных генов в живом организме при воздействии на него ряда условий внешней среды. Устойчивый же характер наблюдаемых изменений в параметрах функциональной активности рибосомных генов экспериментальных кроликов может дать возможность целенаправленного изменения работы белоксинтезирующего аппарата организма, в частности в целях повышения продуктивности пород сельскохозяйственных животных.
Библиографический список
Анализ распределения генов рРНК на хромосомах домашних лошадей с помощью флуоресцентной in situ гибридизации / С. Е. Дерюшева, Д. А. Логинова, О. Т. Чиряева и др. // Генетика. 1997. Т. 33. № 9. С. 1281-1286.
Барановская Л. И. Характеристика функционального состояния ядрышкообразующих районов хромосом человека / Л. И. Барановская, И. В. Гарькавцев, И. А. Кравец // Цитология. 1991. Т. 29. № 9. С. 51-52.
Ментейфель В. М. Изменение тонкой организации неактивных кольцевидных ядрышек зрелых лимфоцитов крыс на ранних этапах бласттрансформации /
B. М. Ментейфель, П. В. Челидзе // Молекуляр. биология. 1986. № 20. С. 564-572.
Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2003. 312 с.
Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. М. У. Хабриева. М.: Медицина, 2005.
C. 40-43.
Смирнова О. Ю. Особенности организации функционирования ядрышка в условиях полного пространственного разобщения его основных структур in situ / О. Ю. Смирнова, О. А. Дудник, О. В. Зацепина // Цитология. 2002. Т. 44. № 1. С. 5.
Стржижевский А. Д. Количественная оценка длительности существования хромосомных аберраций в клетках различных тканей млекопитающих in vivo // Генетика. 1972. Т. 8. № 2. С. 93-99.
Трубников В. И. Многомерный статистический анализ антропометрических показателей. Сообщ. 1. Генетическая корреляция между признаками / В. И. Трубников, В. М. Гиндилис // Вопр. антропологии. Вып. 64. М.: Медицина, 1980. С. 94-106.
Ядрышкообразующие районы (ЯОР) хромосом человека: опыт количественного цитологического и молекулярного анализа / Н. А. Ляпунова, Н. А. Еголина, Н. Н. Вейко и др. // Биологич. мембраны. 2001. Т.18. № 3. С. 189-199.
