CC BY
107
Рис. 2. Выявление бактерий рода Salmonella с использованием экспресс-теста Singlepath®-Salmonella.
фичные и простые в исполнении экспресс-тесты, предназначенные для микробиологического контроля продовольственного сырья и пищевой продукции. Они эффективны при скрининге образцов продукта на наличие патогенных бактерий рода Salmonella, Campylobacter, Listeria monocytogenes, E. шИ O157 и др. Их использование на пищевых предприятиях с целью обнаружения патогенной микрофлоры обеспечивает высокую надежность определения, существенно сокращает время анализа (до 24-48 ч) и затраты на его проведение. Метод также эффективно используется при идентификации колоний патогенных
Рис. 3. Использование теста Singlepath®-Salmonella для идентификации сальмонелл.
микроорганизмов. Singlepath®-тестирование не требует сложных процедур подготовки проб и использования приборов. Испытания экспресс-тестов Singlepath® во ВНИИ мясной промышленности РАСХН при выявлении сальмонелл в мясном сырье (в сравнении с классическим методом определения по ГОСТ 7702.2.3-93) показали высокую сходимость результатов.
Литер атур а
1. ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579-2002). Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella. - М., 2008. (Переиздан в 2009 г. с поправкой от 29.05.2009).
2. Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием хроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия): Метод. рекомендации. № 24ФЦ/976. - М., 2004.
3. Fung D. Y. С. // Rapid Meth. Automation in Microbiol. - 20022003. - Vol. 1.
4. Singlepath® и Duopath® // Питательные среды и лабораторное оборудование. - М., 2009. - С. 35-39.
5. Thompson L., Lindhardt Ch. Singlepath® Salmonella // J. AOAC Int. - 2006. - Vol. 89, N 2. - P. 417-432.
Поступила 29.10.10
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 614.31:579.862.1.083.12
С. М. Суханова, Н. Е. Захарова, И. А. Голубенко
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА НОВЫХ КОММЕРЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ
выделения стафилококков
ФГБУ «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России, Москва
Проведены сравнительные испытания новых коммерческих питательных сред Для выделения стафилококков отечественных и зарубежных производителей (ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития РФ; ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии, пос. Оболенск; ОАО “Биомед” им. И. И. Мечникова, Московская обл.; ЗАО Научно-исследовательский центр фармакологии, Санкт-Петербург; “НоваМед Лтд.”, Израиль). Качество оценивали по физико-химическим и биологическим показателям. Испытуемые питательные среды обеспечивали хороший рост специфически значимых тест-штаммов стафилококков, а также ингибирующие свойства в отношении тест-штаммов энтеробактерий. Техника использования традиционного посева на чашки гарантирует более высокую чувствительность и степень ингибиции питательных сред в сравнении с техникой нанесения инокулята на “НоваСтрик”.
Ключевые слова: питательные среды, стафилококк, элективный солевой агар, выделение, чувствительность, ингибиция
75
[гиена и санитария 1/2012
S. М. Sukhanova1, N. E. Zakharova2, I. A. Golubenko3 - COMPARATIVE EVALUATION OF NEW COMMERCIAL NUTRIENT MEDIA FOR ISOLATION OF STAPHYLOCOCCI
L. A. Tarasevich State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Preparations, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow
Comparative trials were carried out new commercial nutrient media made by Russian (Mirogen Research-and-Production Association, Ministry of Health of the Russian Federation; State Research Centerfor Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Serpukhov District, Moscow Region; and I. I. Mechnikov Biomed, Moscow Region; Research Center of Pharmacotherapy, Saint Petersburg) and foreign (NovaMed Ltd, Israel) manufacturers to isolate staphylococci. Their quality was assessed in terms of physicochemical and biological parameters. The test nutrient media provided a good growth of specifically important test staphylococcal strains and inhibited Enterobacteriaceae. The technique of using the traditional inoculum to Petri dish ensures a higher sensitivity and inhibition of nutrient media as compared to that of applying the inoculum to NovaStreak.
Key words: nutrient media, Staphylococcus, elective saline agar, isolation, susceptibility, inhibition.
Стафилококки представляют собой широко распространенную группу микроорганизмов, которые вызывают заболевания, носящие характер либо аутоинфекции (при различных повреждениях кожи и слизистых оболочек), либо экзогенной инфекции, обусловленной контактно-бытовым, воздушно-капельным или алиментарным (при пищевых отравлениях) способами заражения. В последние годы вспышки токсикоинфекций, вызываемые, в частности, стафилококками, все чаще становятся объектами пристального внимания исследователей [7, 8]. Стафилококковые заболевания протекают тяжело, с высокой летальностью, особенно у детей раннего возраста и ослабленных больных. Патогенное действие оказывает преимущественно Staphylococcus aureus, относящийся к коагулазоположи-тельным стафилококкам [9]. Среди коагулазонегативных стафилококков к клинически значимым в первую очередь относятся S. epidermidis и S. saprophyticus [1].
В качестве основного метода диагностики стафилококковых заболеваний используют бактериологический метод исследования - посев патологического материала на питательные среды с последующим выделением чистой культуры и изучением свойств, характеризующих ее патогенность [3, 6]. Исследование на обсемененность стафилококками проводят, применяя питательную среду с высоким содержанием хлорида натрия, обеспечивающего ее элективные свойства.
Цель работы состояла в изучении свойств новых питательных сред, предлагаемых отечественными и зарубежными производителями для выделения стафилококков.
Материалы и методы
Объектами исследования стали “Питательная среда для выделения стафилококков сухая (солевой агар-М)” (ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития РФ, Махачкала); “Питательная среда для выделения стафилококков сухая (стафилококкагар) (ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии, пос. Оболенск); “Элективный солевой агар для стафилококков - ПД” (ОАО “Биомед” им. И. И. Мечникова, Московская обл.); “Питательная среда для выделения стафилококков (элективный солевой агар)” (ЗАО “Научно-исследовательский центр фармакотерапии”, Санкт-Петербург); “НоваСтрик Питательный агар для выделения и идентификации микроорганизмов (комплект № 2 “НоваСтрик BD-508”), система,
Суханова С. М. - канд. биол. наук, рук. лаб. бактериологических питательных сред и автоклавирования ([email protected]); Захарова Н. Е. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. бактериологических питательных сред и автоклавирования; Голубенко И. А. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. бактериологических питательных сред и автоклавирования
готовая к применению (“НоваМед Лтд.”, Израиль) (представитель в РФ - ЗАО “ДАС”, Ростов-на-Дону).
Оценку качества сред проводили по физико-химическим (растворимость, pH, потеря в массе при высушивании, содержание аминного азота и хлоридов (в пересчете на хлорид натрия), прочность студня) и биологическим показателям [2]. Контроль специфической активности по биологическим показателям включал определение чувствительности сред с использованием тест-штаммов стафилококков - St. aureus “Виотко”, S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305, оценку ингибирующих свойств с использованием тест-штаммов Escherichia coli 168/59 (O111:K59), E. coli ATCC 25 922, Pseudomonas aeruginosa 27/99, P. aeruginosa ATCC 27 853, P. aeruginosa 273, Proteus vulgaris HX 19 222, Salmonella typhimurium ATCC 14 028, Shigella flexneri ATCC 12 022, а также определение скорости роста и стабильности основных биологических свойств микроорганизмов. Использовали штаммы из коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ “Государственный научноисследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов” им. Л. А. Тара-севича” (ГИСК им. Л. А. Тарасевича) Минздравсоцразви-тия России. Оценивали по три серии каждой среды. Для определения чувствительности среды производили посев по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов из разведений 10-5, 10-6, 10-7. Предварительно готовили взвесь культуры в 0,9% растворе хлорида натрия с оптической плотностью, соответствующей 10 единицам по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича (ОСО-4228-85 П), из которой получали необходимые разведения. Результаты по чувствительности и ингибирующим свойствам сред регистрировали каждые 24 ч в течение 2 сут. Инкубацию посевов проводили при 37 ± 1е. Оценивали показатель прорастания как отношение среднего количества колоний, образовавшихся на испытуемой среде, к среднему количеству колоний на контрольной среде, выраженное в процентах [5]. В качестве контрольной среды роста штаммов использовали “Питательный агар для культивирования микроорганизмов (СПА)” (ФГУП “НПО “Микроген”) и Violet Red Bile Agar (VRBA) в комплекте “НоваСтрик BD-508”.
Результаты и обсуждение
Принцип действия исследованных в работе сред состоит в том, что подавляющее большинство микроорганизмов возможной сопутствующей микрофлоры на среде с высоким содержанием хлорида натрия (70% и более) колоний не образует, тогда как на рост стафилококков такая концентрация хлорида натрия не влияет.
Все исследованные среды, кроме комплекта “НоваСтрик BD-508”, представляли мелкодисперсные порошки светложелтого цвета, которые хорошо растворялись в дистилли-
76
Сравнительные показатели испытуемых питательных сред
Чувствительность среды Ингибирующие свойства Срок год-
Название среды тест-штаммы; размер колоний через 48 ч инкубации (диаметр, мм) разве- дение тест-штаммы разве- дение pH ности готовой среды
Элективный солевой агар для стафилококков - ПД S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305 (1,0-1,5) S. aureus "Виотко" (2,0-2,5) 10-6, 10-7* E. coli 168/59 (O111:K58); P. aeruginosa 27/99; P. vulgaris HX 19 222 ooo 7,1 14 дней
Элективный солевой агар S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305 S. aureus "Виотко" (2,0-2,5) 10-6, 10-7* E. coli ATCC 25 922; P. aeruginosa ATCC 27 853; P. vulgaris HX 19 222 о о о 6,8 15 дней
Стафилококагар S. epidermidis ATCC 14 490, S. Saprophyticus ATCC 15 305 (2,0-3,0) S. aureus "Виотко" (2,0-2,5) 10-6, 10-7* E. coli 168/59 (O111:K58); P. aeruginosa 27/99; P. vulgaris HX 19 222 pop 7,2 15 дней
Солвой агар S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305 (1,5-2,0) S. aureus "Виотко" (2,0-2,5) 10-6, 10-7* E. coli 168/59 (O111:K58); P. aeruginosa 273; P. vulgaris HX 19 222 ООО 7,2 10 дней
"НоваСтрик BD-508" S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305 (< 1,0) S. aureus "Виотко" (1,5-2,0) 10-5, 10-6* S. typhimurium ATCC 14 028; S. flexneri ATCC 12 022 10-4 10-4 7,0 6 мес
Примечание. * - при посеве наблюдался рост менее 10 колоний.
рованной воде при перемешивании и кипячении в течение S. aureus “Виотко” диаметром 1,5-2 мм S. epidermidis
2-3 мин. Существенных различий физико-химических показателей сред не выявили. Средние значения основных показателей сухих сред составили: pH 7,2; потеря в массе при высушивании 2%; содержание хлоридов 65%; содержание аминного азота 1,5%; прочность студня среды около 350 г. Готовые среды в чашках были прозрачными, светложелтого цвета. Хранение при температуре 2-8oC. Сроки годности приготовленных и разлитых в чашки Петри сред также существенно не различались (см. таблицу).
Комплект “НоваСтрик BD-508”, предназначенный по инструкции для определения обсемененности пищевых продуктов, готов к применению и представляет собой устройство с нанесенными на пластиковую лопасть агаровыми средами - агаром Baird Parker и VRBA. Агар Baird Parker - прозрачная среда ярко-желтого цвета - предназначена для выделения и культивирования стафилококков [10]. Особенностью комплекта “НоваСтрик” является то, что на агар наносится меньший объем микробной суспензии - 3-4 мкл вместо 100 мкл при традиционном контроле на чашках Петри, что, безусловно, снижает чувствительность среды для выделения стафилококков в “НоваСтрик BD-508” по сравнению с таковой при классическом методе примерно на порядок [3, 4].
Испытуемые питательные среды обеспечивали рост специфически значимых тест-штаммов стафилококков, а также ингибирующие свойства в отношении тест-штаммов энтеробактерий. Показатель прорастания составлял 100% для каждой из сред. Тем не менее наблюдали различия в чувствительности и степени ингибиции сред, скорости роста микроорганизмов, а также в размере колоний (см. таблицу).
На средах, приготовленных из порошков, колонии стафилококков были выпуклыми, непрозрачными, блестящими с ровными краями: S. epidermidis ATCC 14 490 и S. saprophyticus ATCC 15 305 белого цвета, S. aureus “Ви-отко” желтоватого цвета. Наблюдать колонии можно было через 24 ч инкубации, но диаметр их составлял от 0,5 до 1 мм. Через 48 ч инкубации диаметр колоний S. aureus “Виотко” достигал 2-2,5 мм, а для S. epidermidis ATCC 14 490 и S. saprophyticus ATCC 15 305 этот показатель различался - на элективно-солевом агаре и стафилококкагаре колонии были больше, чем на элективном солевом агаре для стафилококков-ПД и солевом агаре-М. На агаре Baird Parker комплекта “НоваСтрик BD-508” стафилококки росли в виде выпуклых блестящих колоний черного цвета:
ATCC 14 490 и S. saprophyticus ATCC 15 305 менее 1 мм.
Ингибирующие свойства проявлялись следующим образом: при 48-часовой инкубации посевов на всех средах, полученных из порошков, наблюдали полное подавление роста E. coli из разведения 10-2 и из разведения 10-4 на «НоваСтрик BD-508”. Рост P. aeruginosa, рост и роение P. vulgaris на элективно-солевом агаре, элективном солевом агаре для стафилококков-ПД и солевом агаре-М подавлялся из разведения 10-2. Любопытно, что через 24 ч инкубации на стафилококкагаре рост и роение протея также ингибировались из разведения 10-2, однако через 48 ч инкубации происходило подрастание колоний, и полную ингибицию наблюдали только из разведения 10-3. Ингибирующие свойства агара Baird Parker в комплекте “НоваСтрик BD-508” оценивали согласно инструкции по применению с использованием других штаммов энтеробактерий: Salmonella ty-phimurium ATCC 14 028, Shigella flexneri ATCC 12 022. Их рост подавлялся так же, как рост E. coli, из разведения 10-4.
Заключение
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о надлежащем качестве описанных новых сухих питательных сред для выделения стафилококков, в том числе их высокой чувствительности и специфичности. Эти среды могут быть использованы для выделения стафилококков из пищевых продуктов, грудного молока, смывов, воды, а также клинических материалов. Следует отметить тот положительный факт, что качество отечественных сред не имело существенных различий у разных производителей.
Более низкая чувствительность и степень ингибиции «НоваСтрик» (10-5 и 10-4 соответственно) обусловлены техникой нанесения образца, что не позволяет рекомендовать использовать эту систему широко. Тем не менее при вспышках пищевых отравлений, когда быстрота получения результатов является определяющим фактором, анализ с помощью этого комплекта дает возможность быстро выявить и дифференцировать контаминацию продуктов питания при массивной обсемененности.
Литер атур а
1. Акатов Ф. к., Зуева В. С. Стафилококки. - М., 1983.
2. Бактериологические исследования использования комплектов
питательных сред «НоваСтрик» в практической работе бакте-
77
[гиена и санитария 1/2012
риологических лабораторий: Метод. рекомендации. - М., 2004.
3. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СанПин 2.3.2.1078-01. - М., 2002.
4. Захарова Н. Е., Суханова С. М., Голубенко И. А. // Вопр. пит. - 2008. - № 1, т. 77. - С. 48-51.
5. Методы контроля бактериологических питательных сред: Метод. указания. МУК 4.2.2317-08. - М., 2008.
6. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А. С.
Лабинской и др. - М., 2004.
7. Шевелева С. А. // Вестн. РАМН. - 2006. - № 5. - С. 43-51.
8. FujikawaН. // Biocontrol Sci. - 2010. - Vol. 15, N 3. - P. 75-80.
9. Han Z., Lautenbach E., Fishman N., Nachamkin I. // J. Med. Microbiol. - 2007. - Vol. 56, Pt 1. - P. 43-46.
10. Zadik P. M., Davies S., Wittaker S., Mason C. // J. Med. Microbiol. - 2001. - Vol. 50, N 5. - P. 476-479.
Поступила 17.11.10
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 614.31:631.521.54]-074
Е. А. Карпова1, А. Г. Малышева1, А. А. Ермаков1, Н. К. Сидоренкова2
АТОМНО-АБСОРБЦИОННОЕ ЭЛЕКТРОТЕРМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ МЫШЬЯКА В РАСТЕНИЯХ И ПРОДУКЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
1ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина» Минздравсоцразвития РФ; 2ФГУ государственный центр агрохимической службы «Московский»
Разработаны оптимальные температурно-временные параметры электротермического атомноабсорбционного определения содержания мышьяка в растениях после их предварительного кислотного разложения. Модификатор матрицы — 1% раствор нитрата никеля или нитрата палладия. Кюветы (печи) простые из пористого графита или пиролитические. Аналитическая программа применима как для спектрометров с Зеемановской, так и дейтериевой коррекцией фона. Правильность методики оценивали по результатам анализа растительных государственных стандартных образцов состава с аттестованным содержанием мышьяка. Коэффициент вариации для диапазона 0,02—0,2 мг на 1 кг элемента составил 20—35%.
Ключевые слова: мышьяк, загрязнение окружающей среды
Е. A. Karpova1, A. G. Malysheva1, A. A. Ermakov1, N. К. Sidorenkova2 — ELECTROTHERMAL ATOMIC ABSORPTION DETERMINATION OF ARSENIC IN PLANTS AND PLANT FOODS
1A.N. Sysin Research Institute ofHuman Ecology and Environmental Hygiene, Ministry ofHealth and Social Development ofRussia 2State Agrochemical Service Center “Moskovsky”
The authors have developed the optimal temperature-time parameters of electrothermal atomic absorption determination of arsenic in plants after their acid predigestion. The matrix modifier is 1% nickel nitrate or palladium nitrate solution. Cuvettes (ovens) are simple, made of porous or pyrolytic graphite. The analytical program is suitable for both spectrometers with Zeeman and deuterium background correction. The correctness of the procedure has been estimated from the results of analysis of state reference samples certified for their arsenic content. The coefficient of variation was 20-35% for the concentration range of 0.02-0.2 mg/kg.
Мышьяк относится к гигиенически значимым загрязнителем окружающей среды. Это один из самых известных ядов, токсичных для большинства живых организмов. При отравлении мышьяком у человека поражаются ЦНС и периферическая нервная система, кожа, периферическая сосудистая система. Его соединения не только оказывают токсическое действие, но и относятся к доказанным для человека канцерогенам (1-я группа по классификации Международного агентства по классификации рака - МАИР). Содержание мышьяка в объектах окружающей среды нормируется. Так, его предельно допустимая концентрация (ПДК) в воде 0,05 мг/дм3 (СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества»), ПДК среднесуточные (ПДК с.) в воздухе 0,0003 мг/м3 (ГН 2.1.6.1338-03 «Предельно допустимые концентрации загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест»), ПДК в почве 2 мг/кг (ГН 2.1.7.2041-06 и ГН 2.1.7.2042-06 «Предельно допустимые концентрации и
Карпова Е. А. - д-р биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. гигиены питьевого водоснабжения и санитарной охраны водоемов; Малышева А. Г. - д-р биол. наук, проф., руководитель лаб. физикохимических исследований ([email protected]); Ермаков А. А. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. физико-химических исследований; Сидоренкова Н. К. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.
ориентировочно-допустимые концентрации химических веществ в почве»). Такие величины гигиенических нормативов отражают очень высокую токсичность мышьяка. Он относится к I классу опасности.
Главным источником загрязнения окружающей среды мышьяком являются промышленные стоки. Один из основных путей поступления мышьяка в организм человека по пищевой цепочке: из воды и почвы в растения и продукты питания. ПДК мышьяка в пищевых продуктах нормировано, в частности в продукции растительного происхождения (например, зерновые, зернобобовые, крупы, фрукты, ягоды) составляет 0,2 мг/кг (СанПиН 42-123-4089-86 «Предельно допустимые концентрации тяжелых металлов и мышьяка в продовольственном сырье и пищевых продуктах»). Однако к настоящему времени контроль уровня мышьяка в растениях и продукции питания растительного происхождения осложняется отсутствием надежных методик его анализа, характеризующихся оптимальным сочетанием аналитических и метрологических характеристик.
Так, существующая стандартная методика определения концентрации мышьяка в продуктах питания и продовольственном сырье [2, 3] основана на колориметрическом методе с использованием диэтилдитиокарбамата серебра. Методика трудоемка и продолжительна по времени (включает стадию отгонки арсина из раствора разложенной пробы и последующее измерение оптической
78
