CC BY
27экспериментальная и клиническая урология № 4 2021 www.ecuro.ru
https://doi.org/10.29188/2222-8543-2021-14-4-10-19
Сравнительная оценка фармакологической активности хвойного провитаминного концентрата и экстракта Serenoa repens (Sabal serrulatum) на модели доброкачественной гиперплазии предстательной Аелезы, индуцированной тестостероном у крыс
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
А.А. Кужанов, Я.Г. Муразов, А.О. Нюганен, В.А. Александров, А.С. Артемьева, А.Н. Стуков
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации; д. 68, ул. Ленинградская, Санкт-Петербург, пос. Песочный, 197758, Россия
Контакт: Муразов Ярослав Геннадьевич, [email protected]
Аннотация:
Введение. Растительные средства играют значимую роль в лечении пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ). Цель. Оценить фармакологическую активность комплекса биологически активных веществ, выделенных из древесной зелени Picea abies L. и Pinus sylvestris L. (хвойный провитаминный концентрат, ХПК), в сравнении с экстрактом S. repens (ПростамолУно', Германия) на модели ДГПЖ, индуцированной пролонгированным препаратом тестостерона (ППТ) у крыс.
Материал и методы. Эксперимент был проведен на 82 половозрелых самцах крыс Wistar. Для индукции ДГПЖ у животных производилась хирургическая кастрация и последующее (через неделю после кастрации) курсовое введение ППТ - п/к в дозе 0,1 мл/кг через день в течение 14 дней. ХПК (400 мг/кг) и экстракт S. repens (200 мг/кг) вводили крысам per os (с помощью зонда). Начало их введения зависело от задачи: при лечебном режиме - одновременно с первой инъекцией тестостерона, а при лечебно-профилактическом режиме - за 14 дней до кастрации животных. Длительность введения агентов в лечебном режиме составила 28 дней, в лечебно-профилактическом - 49 дней. Конечные точки исследования включали оценку простатического индекса (ПИ) и расчетных параметров на его основе, объем дорсолатерального отдела предстательной железы (ПЖ) и уровень тестостерона сыворотки крови на момент эвтаназии животных.
Результаты. Фармакологические эффекты ХПК на ДГПЖ, индуцированную тестостероном, были сопоставимы с влиянием экстракта S. repens. Кроме того, имелась тенденция к более выраженной активности у ХПК, вводимого в лечебно-профилактическом режиме.
Выводы. ХПК - перспективное растительное средство для комплексной терапии ДГПЖ, которое может рассматриваться как альтернатива лечению синтетическими препаратами у мужчин со слабыми или умеренными симптомами нижних мочевых путей.
Ключевые слова: доброкачественная гиперплазия предстательной железы; хвойный провитаминный концентрат; Serenoa repens; доклиническое исследование.
Для цитирования: Кужанов А.А., Муразов Я.Г., Нюганен А.О., Александров В.А., Артемьева А.С., Стуков А.Н. Сравнительная оценка фармакологической активности хвойного провитаминного концентрата и экстракта Serenoa repens (Sabal serrulatum) на модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы, индуцированной тестостероном у крыс. Экспериментальная и клиническая урология 2021;14(4): 10-19; https://doi.org/10.29188/2222-8543-2021-14-4-10-19
https://doi.org/10.29188/2222-8543-2021-14-4-10-19
Comparative evaluation of the pharmacological activity of coniferous provitamin concentrate and Serenoa repens (Sabal serrulatum) extract using a model of testosterone-induced benign prostatic hyperplasia in rats
EXPERIMENTAL STUDY
A.A. Kuzhanov, Ya.G. Murazov, A.O. Nyuganen, V.A. Alexandrov, A.S. Artemyeva, A.N. Stukov
The Federal State Budgetary Institution «N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; 68 Leningradskaya St., Pesochnyi Settlement, 197758 Saint Petersburg, Russian Federation
Contacts: Yaroslav G. Murazov, [email protected] Summary:
Introduction. Phytotherapy continues to play an important role in the treatment of patients with benign prostatic hyperplasia (BPH).
Aim. To evaluate the pharmacological activity of a complex of biologically active compounds isolated from the foliage of Picea abies L. and Pinus sylvestris L. (coniferous provitamin concentrate, CPC) in comparison with S. repens extract (Prostamol'Uno, Germany) using the testosterone-induced BPH model in rats. Material and мethods. The experiment was carried out on 82 mature male Wistar rats. BPH was induced by subcutaneous administration of a prolonged testosterone preparation at a dose 0,1 ml/kg on alternate days for 14 days following surgical castration of animals. The first injection was performed one week after castration. CPC (400 mg/kg per os daily) and S. repens (200 mg/kg per os daily) treatment was started either together with the first injection of testosterone (treatment regimen)
экспериментальная и клиническая урология № 4
2curo.ru
or 14 days before castration (preventive therapy regimen). The duration of the administration of agents in the therapeutic regimen was 28 days, in the preventive therapy regimen - 49 days. The study endpoints included the assessment of the prostatic index (PI) and the calculated parameters based on it, the volume of the dorsolateral prostate and the serum testosterone level at the time of euthanasia of the animals.
Results. The pharmacological effects of CPC on testosterone-induced BPH were comparable to S. repens extract. Furthermore, there was a trend towards more pronounced pharmacological activity of CPC, administered in a preventive therapy regimen.
Conclusion. CPC is a promising herbal agent for the complex therapy of BPH and a possible alternative to a synthetic drug treatment in men with mild to moderate lower urinary tract symptoms.
Key words: benign prostatic hyperplasia; coniferous provitamin concentrate; Serenoa repens; preclinical trials.
For citation: Kuzhanov A.A., Murazov Ya.G, Nyuganen A.O., Alexandrov V.A., Artemyeva A.S., Stukov A.N. Comparative evaluation of the pharmacological activity of coniferous provitamin concentrate and Serenoa repens (Sabal serrulatum) extract using a model of testosterone-induced benign prostatic hyperplasia in rats. Experimental and Clinical Urology, 2021;14(4):10-19; https://doi.org/10.29188/2222-8543-2021-14-4-10-19
ВВЕДЕНИЕ
Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) является одним из наиболее частых заболеваний предстательной железы (ПЖ) у мужчин пожилого возраста и наиболее частой причиной симптомов нижних мочевыводящих путей (СНМП). Распространенность гистологически подтвержденной ДГПЖ по данным исследований аутопсийного материала существенно увеличивается с возрастом, достигая 90% у мужчин в возрасте 81-90 лет [1]. ДГПЖ и СНМП оказывают значительное влияние на здоровье пожилых мужчин и на расходы здравоохранения в целом. По мере старения населения мира заболеваемость и распространенность ДГПЖ и СНМП быстро увеличиваются [2]. В статье О.И. Аполихина с соавт. сообщается, что, если экстраполировать мировые данные на мужское население России, можно рассчитать, что более 13 млн. мужчин старше 18 лет могут иметь ту или иную степень ДГПЖ, которая часто протекает бессимптомно [3].
В настоящее время основными целями лечения ДГПЖ являются облегчение СНМП, улучшение качества жизни, подавление прогрессирования заболевания и снижение частоты осложнений. Кроме того, в ближайшее время предстоит ответить на вопрос, может ли своевременная диагностика и лечение ДГПЖ повлиять на риск развития рака предстательной железы (РПЖ)? Варианты лечения ДГПЖ зависят от выраженности симптомов заболевания и включают выжидательную тактику, медикаментозное и хирургическое лечение [4, 5]. Лекарственная терапия ДГПЖ направлена на устранение двух основных компонентов заболевания: динамического (тонус гладкой мускулатуры предстательной железы (ПЖ) и шейки мочевого пузыря) и статического (увеличение объема ПЖ, вызывающее механическую обструкцию). Основные группы лекарственных препаратов для лечения ДГПЖ хорошо известны: а1-адреноблокаторы, ингибиторы 5а-редук-тазы, ингибиторы фосфодиэстеразы 5-го типа, м-холино-блокаторы, агонисты ^З-адренорецепторов [6, 7]. Многочисленные крупномасштабные клинические исследования также показали преимущества комбинации а1-адре-ноблокаторов и ингибиторов 5а-редуктазы для лечения СНМП, вызванных ДГПЖ [8]. Следует отметить, что современная терапия ДГПЖ нередко сопровождается раз-
витием нежелательных явлений, особенно у мужчин старшей возрастной группы [9].
В лечении ДГПЖ и СНМП применяются также методы комплементарной и альтернативной медицины. К ним можно отнести средства растительного происхождения. По данным A. Kehn и соавт. в США 40% мужчин, выбирающих безоперационное лечение ДГПЖ, используют добавки, содержащие растительные компоненты, как самостоятельный метод лечения или в комбинации с лекарственными препаратами выбора [10].
Клинические руководства профессиональных сообществ как правило не содержат рекомендаций по применению растительных средств при СНМП. Однако многие пациенты часто остаются недовольными синтетическими препаратами первой линии и предпочитают растительные средства из-за их низкой токсичности [11]. Фитотерапия может рассматриваться как дополнительный метод лечения ДГПЖ у мужчин со слабыми или умеренными СНМП. В качестве лекарственного растительного сырья наиболее часто применяются Serenoa repens, Hypoxis rooperi, Secale cereale, Pygeum africanum, Urtica dioica, Curcubita pepo. В недавно опубликованном систематическом обзоре и мета-анализе T. Cai и соавт. пришли к заключению, что S. repens при применении в течение 6 мес. и более оказывает такой же эффект при лечении ДГПЖ как и тамсулозин, если оценивать по шкале IPSS (International Prostate Symptom Score), качеству жизни и остаточному объему мочи [12]. Однако по данным Кох-рейновского систематического обзора, выпущенного еще в 2012 г., было установлено, что S. repens даже в двух- и трехкратных дозах не влияет на никтурию, не улучшает показатели потока мочи, симптоматику или размер ПЖ у мужчин с ДГПЖ и СНМП [13]. Следует отметить, что S. repens (Sabal serrulatum) произрастает в основном в США, а на отечественном фармацевтическом рынке данная группа препаратов представлена средствами, производимыми в основном за рубежом (Франция, Германия), что, безусловно, отражается на их высокой цене. В этой связи остается актуальной разработка отечественных эффективных растительных средств для лечения ДГПЖ.
Целью настоящей работы является сравнительная доклиническая оценка фармакологической активности комплекса биологически активных веществ, выделенных из древесной зелени хвойных пород (хвойный Н
экспериментальная и клиническая урология № 4 2021 www.ecuro.ru
провитаминный концентрат, ХПК) с экстрактом S repens (ПростамолУно®, Каталент Германия Эбербах ГмбХ, Германия) на модели ДГПЖ у половозрелых самцов крыс Wistar, индуцированной смесью эфиров тестостерона (ППТ). Ранее нами впервые на модели ДГПЖ, индуцированной сульпиридом у самцов крыс, было проведено сравнительное изучение простатотропных эффектов ХПК и известного фитопрепарата для лечения ДГПЖ (Serenoa repens fructuum extract, Простамол®Уно) [14]. На основании полученных данных целесообразно продолжить изучение ХПК в качестве перспективного лечебного и лечебно-профилактического средства фитотерапии ДГПЖ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. Их содержание и использование. Исследование проведено на аутбредных половозрелых крысах самцах Wistar, полученных из ФГУП Питомник лабораторных животных «Рапполово» (Россия, Ленинградская область). Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом. Уход и все манипуляции с животными выполнялись в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123) и Директивой Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС о защите животных, использующихся для научных целей. Животные содержались в конвенциональном виварии в стандартных условиях: температура воздуха 21-24°C, относительная влажность 52-60%, 12-часовой цикл светлого/ темного времени суток. Крысы получали полнорационный брикетированный комбикорм для лабораторных грызунов (рецептура ПК-120, ООО «Лабораторкорм», Россия) и водопроводную питьевую воду ad libitum.
Препараты и реактивы. В исследовании использовали ХПК, производства ООО НПО «Тихвинская ЭКО Фабрика (г. Тихвин, Россия), поставляемый в виде густого маслянистого продукта ярко-оранжевого цвета со специфическим хвойным запахом. ХПК представляет собой неомыляемые вещества древесной зелени из Picea abies L. и Pinus sylvestris L., содержит фитол, фитосте-рины, полипренолы, каротиноиды, витамин Е. Экстракт S. repens извлекали из капсул лекарственного препарата Простамол® Уно. В одной капсуле содержится спиртового экстракта плодов пальмы ползучей (Serenoa repens fructuum extract) 320 мг. Перед введением крысам нужную навеску ХПК и экстракта S. repens растворяли в носителе (растительное масло). ППТ Омнадрен 250® представляет собой стерильный масляный раствор, в 1 мл которого содержится: тестостерона пропионата 30,0 мг, тестостерона фенилпропионата 60,0 мг, тестостерона изокапроната 60,0 мг, тестостерона капроната 100,0 мг, бензилового спирта 50,0 мг, арахисового масла для инъекций до 1,0 мл. Производитель: «Jelfa» (Польша).
Индукция ДГПЖ. Крысам выполнялась хирургическая кастрация под изофлурановым наркозом. Введение Омнадрена 250® начинали через неделю после операции. Препарат вводили подкожно через день в дозе 0,1 мл/кг. Исходный раствор перед введением разводили стерильным персиковым маслом до нужной концентрации. Всего выполнялось 7 инъекций.
Дизайн исследования. Исследование состояло из двух серий экспериментов. В первой серии были изучены эффекты ХПК и экстракта S. repens на ДГПЖ, вводимых в лечебном режиме (начало введения вместе с первой инъекцией препарата тестостерона). Длительность эксперимента составила 35 дней, длительность введения агентов -28 дней. Были сформированы следующие группы:
I. Интактный контроль (n=10) - животные получали носитель (растительное масло) по 0,5 мл на крысу per os ежедневно до конца эксперимента.
II. Омнадрен-контроль (n=10) - индукция ДГПЖ + носитель (per os 0,5 мл на крысу ежедневно).
III. Омнадрен + ХПК (n=10) - индукция ДГПЖ + ХПК per os 400 мг/кг ежедневно.
IV. Омнадрен +S. repens (n=11) - индукция ДГПЖ + экстракт S. repens per os 200 мг/кг ежедневно.
Во второй серии были изучены эффекты ХПК и экстракта S. repens на ДГПЖ, вводимых в лечебно-профилактическом режиме (начало введения за две недели до кастрации). Длительность эксперимента составила 49 дней. Длительность введения агентов - 49 дней. Были сформированы следующие группы:
I. Интактный контроль (n=10) - животные получали носитель (растительное масло) по 0,5 мл на крысу per os ежедневно до конца эксперимента.
II. ДГПЖ-контроль (n=10) - индукция ДГПЖ + носитель (per os 0,5 мл на крысу ежедневно).
III. ДГПЖ-ХПК (n=11) - индукция ДГПЖ + ХПК per os 400 мг/кг ежедневно.
IV. ДГПЖ-S. repens (n=10) - индукция ДГПЖ + экстракт S. repens per os 200 мг/кг ежедневно.
Оцениваемые параметры. Плановую эвтаназию выполняли через день после последнего введения тестируемого агента и носителя. Перед эвтаназией у животных выполняли забор крови методом кардиопункции. Уровень тестостерона в образцах сыворотки определяли с использованием коммерческого набора Testosterone ELISA (582,701; Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA) в соответствии с протоколом производителя. Крысы подвергались эвтаназии (камера с CO2+церви-кальная дислокация). На аутопсии ПЖ у крыс выделялась в виде комплекса дорсолатерального отдела (ДЛП, dorsolateral prostate) и двух вентральных долей ПЖ (ВП, ventral prostate). Отдельно забирались два семенных пузырька с передними долями железы, после чего передние доли отделялись от семенных пузырьков. После стандартной гистологической обработки готовились се-
экспериментальная и клиническая урология № 4
scuro.ru
рийно-ступенчатые срезы отделов ПЖ (по 5 мкм каждый) с шагом микротома 500 мкм. Минимум выполнялось четыре среза каждой доли ПЖ. Полученные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной программе, после чего анализировались патологом вслепую.
Во время вскрытия животных все отделы ПЖ каждой крысы взвешивались. Для всей ПЖ и ее отделов (дорсолатеральный, две вентральные и две передние доли) рассчитывали простатический индекс (ПИ) по формуле:
ПИ= МПх100, где МТ
ПИ - простатический индекс, мг на 100 г массы тела животного
МП - масса ПЖ, мг
МТ - масса тела животного, г.
Увеличение ПИ (в %) рассчитывали по формуле:
ПИопыт х100%
ПИконтроль
Торможение увеличения ПИ (в %) рассчитывали по формуле:
ПИ опыт- ПИ
100 -.
х100
ПИ контроль- ПИ
Степень восстановления ПИ (в %) определяли по формуле:
А - В, где
А - увеличение ПИ в % в контрольной группе В - увеличение ПИ в % в опытной группе Объем дорсолатерального отдела ПЖ рассчитывали
по формуле:
V= axb2 , где 2
V - объем дорсолатерального отдела, мм3 a - наибольшее линейное измерение дорсолатераль-ного отдела, мм
b - наименьшее перпендикулярное к a измерение, мм Статистическая обработка результатов исследования Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета GraphPad Prism версии 8.0 и jamovi версии 1.6.12. Количественные данные представлены в виде среднего (mean) и ошибки среднего (standard error of the mean, SEM). Для сравнения количественных данных двух групп применяли t-крите-рий Стьюдента для независимых выборок. Однофактор-ный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) с post-hoc тестом Тьюки (Tukey's test) или тестом Даннета (Dunnett's test) использовался для множественных сравнений количественных данных. В случае множественных сравнений приведено скорректированное значение уровня значимости (adjusted P, Padj). Все критерии были двусторонними. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В I и II серии все животные дожили до конца эксперимента. Значимого различия в динамике массы тела крыс в контрольных группах, и группах, получавших ХПК и экстракт S. repens в различных режимах, Н
Таблица 1. Сравнение основных параметров изменений предстательной железы после индукции ДГПЖ и применения ХПК и экстракта S. repens в различных режимах
Table 1. Comparison of the main parameters of changes in the prostate after BPH induction and the administration of coniferous provitamin concentrate (CPC) and S. repens extract in different regimens
Группа Group Масса тела, г Body weight, g ПИ, мг/100 г массы тела* Prostatic index (PI), mg/100 g body weight* Увеличение ПИ, % Increase in PI, % Торможение увеличения ПИ, % Inhibition of increase in PI, % Степень восстановления ПИ, % Recovery rate, %
Лечебный режим Therapeutic regimen
Интактный контроль (n=10) Intact control (n=10) 316,3±10,9 332,7±22,0 - - -
Омнадрен-контроль (n=10) Omnadren-control (n=10) 312,2±6,5 589,5±24,5 100 - -
Омнадрен-ХПК (n=10) Omnadren-CPC (N=10) 305,5±10,8 460,0±15,1 78,0 50,4 22,0
Омнадрен-S. repens (n=11) Omnadren-S.repens (n=11) 293,9±6,6 501,0±24,9 85,0 34,5 15,0
Лечебно-профилактический режим Preventive therapy regimen
Интактный контроль (n=10) Intact control (n=10) 391,4±13,9 269,0±31,0 - - -
ДГПЖ-контроль (n=10) BPH-control (n=10) 371,2±11,5 686,2±28,5 100 - -
ДГПЖ-ХПК (n=11) BPH-CPC (n=11) 357,4±8,9 450,4±19,6 65,6 56,5 34,4
ДГПЖ-S. repens (n=10) BPH-S.repens (n=10) 349,3±12,8 535,3± 27,5 78,0 36,2 22,0
Примечание: *множественное сравнение ПИ проводилось для четырех групп, получивших ХПК и экстракт S. repens в лечебном и лечебно-профилактическом режиме; one-way ANOVA, p= 0,0414; post-hoc тест Тьюки при попарном сравнении групп статистически значимых различий не выявил
Note: * multiple comparison of PI was performed for the four groups receiving CPC and S. repens administered in a therapeutic and preventive therapy regimen; one-way ANOVA, p = 0.0414; Tukey's post-hoc test did not reveal any statistically significant differences in pairwise comparison of groups
экспериментальная и клиническая урология № 4 2021 www.ecuro.ru
не было. В таблице 1 представлены сводные данные о влиянии тестируемых агентов на ПИ и расчетные параметры на его основе. Статистически значимых различий при множественном сравнении ПИ между группами, получавшими ХПК и экстракт Б. гереш в лечебном или лечебно-профилактическом режиме, достигнуть не удалось, по-видимому, из-за малого объема выборки.
Результаты сравнения величин ПИ для каждого отдела ПЖ животных, подвергнутых экспериментальным воздействиям, отображены на рисунке 1. ХПК и
экстракт Б. гереш проявили более выраженный эффект при введении в лечебно-профилактическом режиме (рис. 1В). Обращает на себя внимание отсутствие статистически значимых различий величины ПИ между контрольной группой и группой, получавшей экстракт Б. гереш в лечебном режиме (рис. 1А).
Результаты оценки влияния тестируемых агентов на объем ДЛП приведены на рисунке 2.
Из рисунка 2 видно, что различия в объеме ДЛП у животных, получавших ХПК и экстракт Б. гереш в лечебном режиме, в сравнении с лечебно-профилактическим режимом введения были статистически значимыми. ХПК, вводимый в лечебном и лечебно-профилактическом режиме, оказал более выраженное действие на объем ДЛП чем экстракт Б. гереш, вводимый в лечебно-профилактическом режиме. Следует отметить, что выявленные различия в объеме ДЛП могут быть связаны и с тем, что животные, получавшие ХПК и экстракт Б. гереш в лечебно-профилактическом режиме на момент ввода в эксперимент, были старше и имели большую массу тела в сравнении с лечебным режимом (367,5±6,2 г. против 303,6±4,8, ^критерий р <0,0001) так как эксперименты по лечебному и ле-
Р =0.0125
ДЛП
ПП
вп
Отдел ПЖ
I Интактный контроль Ш Омнадрен + ХПК I Омнадрен-контроль Ш Омнадрен +S. repens
400 п
Р=0,0005*
Р-0,0084
Р<0,0001
Р=0,0005
ДЛП ВП
Отдел ПЖ
пп
Интактный контроль Ш ДГПЖ-ХПК
ДГПЖ-контроль
ДГПЖ-S. repens
Рис. 1. ПИ всех отделов ПЖ у крыс с ДГПЖ, индуцированной Омнадре-ном250®. Попарные сравнения проводились с группой «Омнадрен-конт-роль». 'Приведены значения скорректированного Padj для post-hoc теста Даннета при условии one-way ANOVA p<0,05. А - лечебный режим введения. B - лечебно-профилактический режим введения
Fig. 1. PI of all prostate lobes In rats with 0mnadren250®-lnduced BPH. Palrwlse comparisons were made with the «Omnadren-control» group. * The adjusted p -values (Padj) for Dunnett's post-hoc test where one-way ANOVA р<0.05. A - treatment regimen. B - preventive therapy regimen
1500-1
Н ХПК лечебный режим
Ш ХПК лечебно-
профилактический режим
Н S. repens лечебный режим
Н S. repens лечебно-
профилактический режим
Рис. 2. Влияние ХПК и экстракта S. repens, вводимых в лечебном и лечебно-профилактическом режиме, на объем дорсолатерального отдела ПЖ у крыс с ДГПЖ, индуцированной Омнадреном250®. Различия между группами статистически значимы, one-way ANOVA, p<0,0001; post-hoc тест Тьюки: ****p<0,0001; **p = 0,0061; *p = 0,0115
Fig. 2. Influence of CPC and S. repens extract administered in a therapeutic and preventive therapy regimen on the dorsolateral prostate volume in rats with Omnadren250®-in-duced BPH. Differences between groups are statistically significant, one-way ANOVA, p <0.0001; post-hoc Tukey test: **** p <0.0001; ** p = 0.0061; * p = 0.0115
экспериментальная и клиническая урология № 4
scuro.ru
чебно-профилактическому введению тестируемых агентов проводили не параллельно.
На рисунке 3 показан уровень тестостерона сыворотки животных на момент окончания эксперимента.
С 2
ж I-
о о. о л
3 и X
о о.
о и о о н
о ф
Группа
Интактный контроль (N=10) Омнадрен-контроль (N=10) Омнадрен + ХПК (N=10) Омнадрен +S.repens (N=11)
с 2
о о. о m
л
о
X
о
CL Ф
Р и о н о 0
101
8-j
6-j 2-É
Т
—I-1-1-
Группа
c= Интактный контроль (N=10)
cm ДГПЖ-контроль (N=10)
l=l ДГПЖ-ХПК в леч-проф режиме (N=11)
1=] ДГПЖ-S.repens в леч-проф режиме (N=10)
Рис. 3. Уровень тестостерона сыворотки в конце эксперимента у животных, получавших ХПК и S. repens в лечебном и лечебно-профилактическом режиме. Различия между группами статистически значимы, one-way ANOVA, p<0,0001; ****различия с группой «Омнадрен-контроль» статистически значимы, post-hoc тест Даннета, p<0,0001. А - лечебный режим введения. B - лечебно-профилактический режим введения
Fig. 3. Serum testosterone level at the end of the experiment in animals treated with CPC and S. repens in a therapeutic and preventive therapy regimen. Differences between groups are statistically significant, one-way ANOVA, p<0.0001; **** differences with the «Omnadren control» group are statistically significant, Dun-nett's post-hoc test, p <0.0001. A - treatment regimen. B - preventive therapy regimen
Многократное подкожное введение ППТ значимо повышало его концентрацию в сыворотке по сравнению с интактными животными. При этом ни ХПК, ни экстракт Б. гереш, вводимые в двух режимах, не оказывали значимого влияния на этот показатель.
На рисунке 4 показаны гистологические изменения ткани ПЖ животных. На фоне введения ППТ у крыс наблюдалась выраженная гиперплазия простатического эпителия по сравнению с интактным контролем. В группах животных, получавших ХПК и экстракт Б. гереш, выраженность гиперплазии была менее выра-
ОБСУЖДЕНИЕ
В некоторых странах ЕС и США растительные средства играют значимую роль в лечении пациентов с СНМП легкой и средней степени тяжести. В соответствии с Рекомендациями Европейской ассоциации урологов (EAU) гексановый экстракт S. repens, может быть предложен мужчинам с СНМП, которые хотят избежать любых потенциальных побочных эффектов, особенно связанных с сексуальной функцией (степень рекомендации - низкая). При этом необходимо сообщить пациенту, что степень эффективности этого лечения может быть невысокой (степень рекомендации - высокая) [6]. Результаты клинических исследований свидетельствуют о том, что экстракты растений могут обеспечивать облегчение симптомов, сравнимое с эффектом синтетических лекарственных средств. Таким образом, для пациентов без риска прогрессиро-вания фитопрепараты могут быть даже полезны, потому что они хорошо переносятся и не имеют противопоказаний или значимых лекарственных взаимодействий [11].
Экстракты из плодов S. repens (Sabal serrulatum) достаточно давно используются в урологической практике для лечения ДГПЖ и СНМП. Поскольку большинство безрецептурных препаратов, содержащих экстракты S. repens, различаются по методу экстракции, качеству, составу и дозировке не удивительно, что использование таких не стандартизированных продуктов привело к неоднозначным результатам [15]. Расхождения в полученных результатах клинического изучения экстракта S. repens могли быть связаны с различием в дизайнах протоколов исследований, а также из-за разнородной популяции включаемых пациентов (возраст, степень выраженности СНМП и др).
Андроген-индуцированные модели ДГПЖ на животных с использованием различных режимов введения гормональных препаратов хорошо отработаны на крысах, мышах и собаках. Крысы являются наиболее распространенным видом для моделирования ДГПЖ. Обычно индукция ДГПЖ у крыс проводится путем подкожной инъекции препаратов тестостерона H
жена.
экспериментальная и клиническая урология № 4 2021 www.ecuro.ru
Рис. 4. Влияние ХПК и экстракта S. repens на гистологические изменения ткани ПЖ у крыс с ДГПЖ, индуцированной омнадреном250®, гематоксилин/эозин. A -интактный контроль. Железы ацинарного строения, выстланные однослойным призматическим эпителием с базально ориентированным ядром и нормальным ядерно-цитоплазматическим соотношением. B - ДГПЖ, индуцированная омнадреном250®. Железы увеличены в размере, сильно ветвятся. Наблюдается выраженное уменьшение площади просвета ацинусов и наличие многочисленных складок в их просвете. Количество эпителиальных клеток увеличено, выражен их полиморфизм. С - ДГПЖ на фоне лечения ХПК. Железы увеличены в размере, расширен их просвет. Ядерный полиморфизм выражен умеренно. D - ДГПЖ на фоне лечения экстрактом S. repens. Железы увеличены в размере, количество клеток увеличено не значительно, полиморфизм умеренно выражен Fig. 4. Effect of CPC and S. repens extract on histological changes of the prostate tissues in rats with BPH induced by omnadren250®, haematoxylin and eosin staining. A - intact control. Glands of acinar structure, lined with a single-layer prismatic epithelium. Cells with the basal position of nuclei and a normal nucleo-cytoplasmic ratio. B - BPH induced by omnadren250®. The enlarged glands are highly branched with partially obliterated gland lumen. There is a pronounced decrease in the area of the lumen of the prostatic acini. Furthermore, presence of numerous folds into prostatic lumen was noted. The number of epithelial cells with exceptional polymorphism is increased. C -BPH treated with CPC. The glands are enlarged, their lumen is widened. D - BPH treated with S. repens extract. The glands are enlarged, but the number of cells is not significantly increased, and polymorphism is moderately expressed
экспериментальная и клиническая урология № 4
scuro.ru
после кастрации или без кастрации животных [16]. Одним из преимуществ кастрации является то, что можно исключить эффекты «внутреннего» тестостерона [17]. При гистологическом анализе серийно-ступенчатых срезов ПЖ у крыс с тестостерон-индуци-рованной ДГПЖ нами были выявлены следующие морфологические изменения: гиперпролиферация железистого эпителия и стромы, очаговые интралюми-нальные папиллярные складки и наполненные простатическим секретом расширенные протоки. Такие изменения характерны и для человека. Модели ДГПЖ, индуцированные половыми гормонами, представляют собой простой, не затратный по времени и недорогой способ изучения данной патологии и средств терапии [16].
В нашем исследовании фармакологическая активность ХПК была сопоставима с экстрактом Б. гереш. Отсутствие значимого влияния исследуемых агентов на уровень тестостерона сыворотки у крыс в двух экспериментах свидетельствует о том, что эффекты -Б. гереш и ХПК в отношении ДГПЖ реализуются по-видимому не только через андрогенную ось регуляции. Следует учесть, что уровень тестостерона сыворотки у интактных самцов крыс суще-
ственно различается в течение дня и между животными. Это затрудняет оценку терапевтической активности тестируемых средств и дифференциацию от физиологических колебаний в норме [18]. Кроме того, неоднократно было показано, что уровень сывороточных андрогенов плохо коррелирует с их интра-простатическим уровнем как при ДГПЖ, так и при РПЖ [19].
Есть основания полагать, что фармакологическая активность ХПК обусловлена эффектами входящих в его состав биологически активных веществ. В частности, фитол (дитерпен, состоящий из длинноцепочеч-ных ненасыщенных ациклических спиртов) и некоторые из его производных, включая фитановую кислоту. Эти вещества обладают широким спектром биологических эффектов: анксиолитическим, метабо-лизм-модулирующим, цитотоксическим, антиокси-дантным, стимулирующим аутофагию и апоптоз, антиноцицептивным, противовоспалительным, имму-номодулирующим и антимикробным [20]. Фитол, поступающий с пищей, и его полиметилированные метаболиты жирных кислот с разветвленной цепью (фитановая и пристановая кислоты), привлекают внимание исследователей по химиопрофилактике рака (особенно РПЖ) из-за их способности служить естественными лигандами для рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами РРАИ-а, РРАИ-у и ретиноидного рецептора X (ИХИ.). Эти рецепторы являются факторами транскрипции, обеспечивающими нисходящую регуляцию метаболизма, клеточной пролиферации и апоптоза. Кроме того, они повышают
экспрессию а-метилацил-КоА рацемазы (AMACR), особенно в ткани опухолей ПЖ [21]. Фитостерины (стероиды растительного происхождения) обладают множеством фармакологических свойств. Они снижают общий уровень холестерина и холестерин липо-протеинов низкой плотности. Фитостерины регулируют воспаление; обладают антиоксидантным, противоязвенным, иммуномодулирующим, антибактериальным и противогрибковым действием. Они стимулируют заживление ран и ингибируют агрегацию тромбоцитов [22]. По данным Кохрейновского обзора ß-ситостерин улучшает симптомы мочеиспускания и скоростные показатели потока мочи [23]. Ка-ротиноиды - это окрашенные жирорастворимые пигменты. Существует более 600 каротиноидов, которые делятся на каротины, ксантофиллы и ликопин. Описан целый ряд биологических эффектов кароти-ноидов: антиоксидантная активность, активация иммунитета, антиканцерогенный и ингибирование мутагенеза. Наибольшие надежды в плане лечения и профилактики заболеваний ПЖ возлагались на лико-пин. Однако сегодня невозможно однозначно поддержать использование ликопина для профилактики или лечения ДГПЖ или РПЖ из-за ограниченного числа рандомизированных контролируемых исследований и различного качества этих исследований [24]. Поли-пренолы - природные длинноцепочечные изопрено-идные спирты, являются предшественниками доли-холов. Фосфорилированные долихолы выступают в роли липидного переносчика сахаров на ранних стадиях N-гликозилирования белков. Полипренол-содер-жащие соединения обеспечивают стабильность кле-точных мембран. Высокие количества долихолов обнаружены в яичках и гипофизе человека [25]. Ранее на модели канцерогенеза ПЖ, индуцированного ^метил-^нитрозомочевиной и 0мнадреном250® у самцов крыс, нами были продемонстрированы антиканцерогенные эффекты длительного перорального применения полипренолов в виде снижения частоты и множественности простатической интраэпители-альной неоплазии (ПИН) и РПЖ [26]. Витамин Е содержится в ХПК в минимальных количествах. Это важно с точки зрения возможного повышения риска РПЖ на фоне длительного приема а-токоферола ацетата. К сожалению, обескураживающими были результаты SELECT (the Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial) - самого крупного рандомизированного клинического исследования по химиопрофилак-тике РПЖ из когда-либо проведенных. Оно включало более 35000 мужчин. При медиане периода наблюдения 7 лет в группе мужчин, получавших а-токоферола ацетат (400 мг/сут), было установлено достоверное повышение риска развития РПЖ на 17% (HR=1.17; 99% CI 1,004-1,36, p=0,008) [27]. Н
экспериментальная и клиническая урология № 4 202 1 www.ecuro.ru
ВЫВОДЫ
В нашем исследовании фармакологические эффекты ХПК в отношении тестостерон-индуцированной ДГПЖ были сопоставимы с экстрактом S. repens. Кроме того, имелась тенденция к более выраженной фармакологической активности у ХПК, вводимого в лечебно-профилактическом режиме. Полученные результаты
вместе с ранее полученными экспериментальными данными могут служить обоснованием для дальнейшего клинического изучения ХПК в качестве лечебного растительного средства в комплексной терапии ДГПЖ или лечебно-профилактического средства в качестве альтернативы при выжидательной тактике у мужчин со слабыми или умеренными СНМП. □
Л1ШАША/ШЕШШ
1. Launer BM, McVary KT, Ricke WA, Lloyd GL. The rising worldwide impact of benign prostatic hyperplasia. BJU Int 2021;127(6):722-728. https://doi.org/10.1111/bju.15286.
2. Patel ND, Parsons JK. Epidemiology and etiology of benign prostatic hyperplasia and bladder outlet obstruction. Indian J Urol 2014;30(2):170-6. https://doi.org/10.4103/0970-1591.126900.
3. Аполихин О.И., Сивков А.В., Золотухин О.В., Шадеркин И.А., Войтко Д.А., Просянников М.Ю. и др. Распространенность симптомов нарушения функции нижних мочевых путей у мужчин по результатам популя-ционного исследования. Экспериментальная и клиническая урология 2018(2):4-12. [Apolikhin O.I., Sivkov A.V., Zolotuhin O.V., Shaderkin I.A., Voytko D.A., Prosyannikov M.Yu., et al. Prevalence of lower urinary tract symptoms in men according to the results of population research. Eksperimentalnaya i klinicheskaya urologiya = Experimental and Clinical Urology 2018(2):4-12. (In Russian)]. https://doi.org/10.29188/2222-8543-2018-9-1-4-12.
4. Chughtai B, Forde JC, Thomas DD, Laor L, Hossack T, Woo HH, Te AE, Kaplan SA. Benign prostatic hyperplasia. Nat Rev Dis Primers 2016(2):16031. https://doi.org/10.1038/nrdp.2016.31.
5. Yu ZJ, Yan HL, Xu FH, Chao HC, Deng LH, Xu XD, et al. Efficacy and side effects of drugs commonly used for the treatment of lower urinary tract symptoms associated with benign prostatic hyperplasia. Front Pharmacol 2020(11):658. https://doi.org/10.3389/fphar.2020.00658.
6. EAU Guidelines. Edn. presented at the EAU Annual Congress Milan 2021. URL: https://uroweb.org/guidelines/how-to-cite-the-eau-guidelines/
7. Lerner LB, McVary KT, Barry MJ, Bixler BR, Dahm P, Das AK. et al. Management of lower urinary tract symptoms attributed to benign prostatic hyper-plasia: AUA Guideline part I, initial work-up and medical management. J Urol 2021;206(4):806-817.
8. Jiwrajka M, Yaxley W, Ranasinghe S, Perera M, Roberts MJ, Yaxley J. Drugs for benign prostatic hypertrophy. Aust Prescr 2018;41(5):150-153. https://doi.org/10.18773/austprescr.2018.045.
9. Bortnick E, Brown C, Simma-Chiang V, Kaplan SA. Modern best practice in the management of benign prostatic hyperplasia in the elderly. Ther Adv Urol 2020(12): 1756287220929486. https://doi.org/10.1177/1756287220929486.
10. Keehn A, Lowe FC. Complementary and alternative medications for benign prostatic hyperplasia. Can J Urol 2015;22 Suppl 1:18-23.
11. Fornara P, Madersbacher S, Vahlensieck W, Bracher F, Romics I, Kil P. Phytotherapy adds to the therapeutic armamentarium for the treatment of mild-to-moderate lower urinary tract symptoms in men. Urol Int 2020;104(5-6):333-342.
https://doi.org/10.1159/000504611.
12. Cai T, Cui Y, Yu S, Li Q, Zhou Z, Gao Z. Comparison of Serenoa repens with tamsulosin in the treatment of benign prostatic hyperplasia: a systematic review and meta-analysis. Am J Mens Health 2020;14(2):1557988320905407. https://doi.org/10.1177/1557988320905407.
13. Tacklind J, Macdonald R, Rutks I, Stanke JU, Wilt TJ. Serenoa repens for benign prostatic hyperplasia. Cochrane Database Syst Rev 2012;12(12):CD001423. https://doi.org/10.1002/14651858.CD001423.pub3.
14. Беспалов В.Г., Муразов Я.Г., Кужанов А.А., Семенов А.Л. Сравнительное изучение простатотропных эффектов хвойного провитаминного концентрата и экстракта Serenoa repens на модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы у крыс. Экспериментальная и клиническая урология 2013(2):0-34. [Bespalov V.G., Murazov Ya.G., Kuzhanov A.A., Semenov A.L. Comparative study of prostatotropic effects of coniferous provitamin concentrate and extract of Serenoa repens based on the model of benign prostatic hyperplasia in rats. Eksperimentalnaya i klinicheskaya urologiya = Experimental and Clinical Urology 2013(2):30-34. (In Russian)].
15. Strum SB. Serenoa repens (Saw palmetto) for lower urinary tract symptoms (LUTS): the evidence for efficacy and safety of lipidosterolic extracts. Part I. Uro 2021(1):118-138. https://doi.org/ 10.3390/uro1030015.
16. Zhang J, Zhang M, Tang J, Yin G, Long Z, He L, et al. Animal models of benign prostatic hyperplasia. Prostate Cancer Prostatic Dis 2021;24(1):49-57. https://doi.org/10.1038/s41391-020-00277-1.
17. Choi YJ, Kim EK, Fan M, Tang Y, Hwang YJ, Sung SH. Effect of Paecilomyces tenuipes extract on testosterone-induced benign prostatic hyperplasia in sprague-dawley rats. Int J Environ Res Public Health 2019;16(19):3764. https://doi.org/10.3390/ijerph16193764.
18. Heywood LH. Testosterone levels in the male laboratory rat: variation under experimental conditions. Int J Androl 1980;3(5):519-29. https://doi.org/10.1111/j.1365-2605.1980.tb00140.x.
19. Simkova M, Heracek J, Drasar P, Hampl R. Determination of intraprostatic and intratesticular androgens. Int J Mol Sci 2021;22(1):466. https://doi.org/10.3390/ijms22010466.
20. Islam MT, Ali ES, Uddin SJ, Shaw S, Islam MA, Ahmed MI, et al. Phytol: A review of biomedical activities. Food Chem Toxicol 2018(121):82-94. https://doi.org/10.1016/j.fct.2018.08.032.
21. Bobe G, Zhang Z, Kopp R, Garzotto M, Shannon J, Takata Y. Phytol and its metabolites phytanic and pristanic acids for risk of cancer: current evidence and future directions. Eur J Cancer Prev 2020;29(2):191-200.
экспериментальная и клиническая урология № 4
scuro.ru
Л1ШАША/ШЕШШ
https://doi.org/10.1097/CEJ.0000000000000534.
22. Salehi B, Quispe C, Sharifi-Rad J, Cruz-Martins N, Nigam M, Mishra AP et al. Phytosterols: from preclinical evidence to potential clinical applications. Front Pharmacol 2021(11):599959. https://doi.org/10.3389/fphar.2020.599959.
23. Wilt T, Ishani A, MacDonald R, Stark G, Mulrow C, Lau J. Beta-sitosterols for benign prostatic hyperplasia. Cochrane Database Syst Rev 2000;1999(2):CD001043. https://doi.org/10.1002/14651858.CD001043.
24. Milani A, Basirnejad M, Shahbazi S, Bolhassani A. Carotenoids: biochemistry, pharmacology and treatment. Br J Pharmacol 2017;174(11):1290-1324. https://doi.org/10.1111/bph.13625.
25. Cantagrel V, Lefeber DJ. From glycosylation disorders to dolichol biosynthesis defects: a new class of metabolic diseases. J Inherit Metab Dis 2011;34(4):859-67. https://doi.org/10.1007/s10545-011-9301-0.
26. Муразов Я.Г., Нюганен А.О., Артемьева А.С. Оценка химиопрофилактиче-ского потенциала полипренолов из хвои Picea abies L. и Pinus sylvestris L. на модели канцерогенеза предстательной железы у самцов крыс Wistar. Вопросы питания 2021;90(3):104-115. https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-3-104-115 [Murazov I.G., Nyuganen A.O., Artemyeva A.S. [Evaluation of the chemo-preventive potential of polyprenols from the needles of Picea abies L. and Pinus sylvestris L. using the model of prostate carcinogenesis in male Wistar rats. Vo-prosy Pitaniia = Problems of Nutrition 2021;90(3):104-115. (In Russian)]. https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-3-104-115.
27. Klein EA, Thompson IM Jr, Tangen CM, Crowley JJ, Lucia MS, Goodman PJ et al. Vitamin E and the risk of prostate cancer: the selenium and Vitamin E cancer prevention trial (SELECT). JAMA 2011;306(14):1549-56. https://doi.org/10.1001/jama.2011.1437.
Сведения об авторах:
Кужанов А.А. - лаборант-исследователь научной лаборатории химиопрофилактики рака и онкофармакологии, ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России; Санкт-Петербург, Россия; [email protected]; РИНЦ Author ID 910829
Муразов Я.Г. - к.б.н., научный сотрудник научной лаборатории химиопрофилактики рака и онкофармакологии, ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России; Санкт-Петербург, Россия; [email protected]; РИНЦ Author ID 899740
Нюганен А.О. - врач-патологоанатом патологоанатомического отделения ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России; Санкт-Петербург, Россия; [email protected]; РИНЦ Author ID 1088145
Александров В.А. - д.м.н., в.н.с. научной лаборатории химиопрофилактики рака и онкофармакологии, ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России; Санкт-Петербург, Россия; [email protected]; РИНЦ Author ID 80753
Артемьева А.С. - к.м.н., врач-патологоанатом, заведующий патологоанатомическим отделением, руководитель научной лаборатории морфологии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России; Санкт-Петербург, Россия; [email protected]; РИНЦ Author ID 927324
Стуков А.Н. - д.м.н., старший научный сотрудник научного отдела инновационных методов терапевтической онкологии и реабилитации ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России; Санкт-Петербург, Россия; [email protected]; РИНЦ Author ID 611058
Вклад авторов:
Кужанов А.А. - концепция исследования, сбор и систематизация данных, написание и редактирование текста статьи, 30%
Муразов Я.Г. - сбор и анализ данных, написание и редактирование текста статьи, 20% Нюганен А.О. - сбор и анализ данных, редактирование текста статьи, 20% Александров В.А. - написание и редактирование текста статьи, 10% Артемьева А.С. - критические замечания, редактирование текста статьи, 10% Стуков А.Н. - критические замечания, редактирование текста статьи, 10%
Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: Статья опубликована без финансовой поддержки.
Статья поступила: 08.11.21
Результаты рецензирования: 18.11.21
Исправления получены: 29.11.21
Принята к публикации: 2.12.21
Information about authors:
Kuzhanov A.A. - Laboratory Research Assistant, Scientific Laboratory of Cancer Chemoprevention and Oncopharmacology, FSBI «N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Saint-Petersburg, Russia; https://orcid.org/0000-0002-8983-3679
MurazovIa.G. - PhD, Researcher, Scientific Laboratory of Cancer Chemoprevention and Oncopharmacology, FSBI «N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Saint-Petersburg, Russia;
https://orrid.org/Q000-Q002-6577-3312
Nyuganen A.O. - pathologist, Department of Pathology, FSBI «N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Saint-Petersburg, Russia; https://orcid.org/0000-0003-2685-5093
Alexandrov V.A. - Dr. Sc., Leading Researcher, Scientific Laboratory of Cancer Chemopre-vention and Oncopharmacology, FSBI «N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Saint-Petersburg, Russia;
https://orcid.org/0000-0002-0019-2685
Artemyeva A.S. - PhD, Head of the Department of Pathology, Head of the Scientific Laboratory of Morphology of Tumors, FSBI «N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Saint-Petersburg, Russia;
https://orcid.org/0000-0002-2948-397X
Stukov A.N. - Dr. Sc., Senior Researcher, Department of innovative methods of therapeutic oncology and rehabilitation, FSBI «N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Saint-Petersburg, Russia; https://orcid.org/0000-0002-1741-6630
Authors' contributions:
Kuzhanov A.A. - conception of the work, data collection and systematization, writing and editing of the manuscript, 30%
Murazov Ia.G. - data collection and analysis, writing and editing of the manuscript, 20% Nyuganen A.O. - data collection and analysis, editing of the manuscript, 20% Alexandrov V.A. - writing and editing of the manuscript, 10% Artemyeva A.S. - critical revision of the article, editing of the manuscript, 10% Stukov A.N. - critical revision of the article, editing of the manuscript, 10%
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Financing. The article was published without financial support.
Received: 08.11.21
Peer review: 18.11.21
Corrections received: 29.11.21
Accepted for publication: 2.12.21
