CC BY
50
УДК 578.823.2. 57.083.3
Ключевые слова: Вирус Блутанга, вакцина, адъюванты, реактогенность, иммуногенность
Key words: Bluetongue disease, vaccine, adjuvants, reactogenicity, immunogenicity
Жугунисов К.Д.1, Таранов Д.С.1, Ершебулов З.Д.1, Жунушов А.Т.2, Абдураимов Е.О.1
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ АДЪЮВАНТОВ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БЛУТАНГА
THE COMPARATIVE EVALUATION OF DIFFERENT ADJUVANTS AT MANUFACTURING OF AN INACTIVATED BLUETONGUE DISEASE VACCINE
'Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Адрес: 080904, Казахстан, Жамбылская область, Кордайский район, пгт. Гвардейский
Research Institute of Biological Safety Problems Address: 080904, Kazakhstan, Zhambylskaya region, Kordayskiy district, urban-type settlement Gvardeyskiy 2Институт биотехнологии Национальной академии наук Кыргызской Республики Адрес: 720071, Кыргызстан, г. Бишкек, проспект Чуй, д. 265 Institute of Biotechnology of National Academy of Sciences of the Kyrgyz Republic Address: 720071, Kyrgyzstan, Bishkek, Chui av., 265
Жугунисов Куандык Даулетбаевич, магистр ветеринарных наук, науч. сотрудник Zhugunisov Kuandyk D., Master of Veterinary Sciences, Researcher Таранов Дмитрий Сергеевич, магистр биологических наук, науч. сотрудник Taranov Dmitriy S., Master of Biological Sciences, Researcher Ершебулов Закир Джаппарович, магистр биологических наук, начальник отдела обеспечения качества Yershebulov Zakir D., Master of Biological Sciences, Head of Quality Assurance Department Жунушов Асанкадыр Темирбекович, д. в. н., профессор, директор Института биотехнологии Zhunushov Asankadyr T., Doctor of Veterinary Sciences, Professor, Director of the Institute of Biotechnology Абдураимов Ергали Орынбасарович, д. в. н., главный ученый секретарь Abduraimov Yergaly O., Doctor of Veterinary Sciences, Chief Executive Secretary
Аннотация. В данной работе были проведены сравнительные исследования по оценке эффективности различных адъювантов при изготовлении инактивированной вакцины против вируса блутанга. Определены следующие параметры: рН, вязкость и стабильность эмульсии, реактогенность и иммуногенность сорбированной и эмульгированной вакцин. Результаты исследования показали хорошую стабильность эмульгированной вакцины с масляным адъювантом и отсутствие реактогенности у овец при внутримышечном введении. Тогда как сорбированная вакцина обладала реактогенностью, вызывая образование припухлости и повышение температуры тела животных на 2-3 сут. Изучение иммуногенных свойств на 40-е сут показало, что иммунный ответ эмульгированной вакцины значительно выше, чем у сорбированного препарата.
Summary. The results of studies of the comparative evaluation of different adjuvants for the manufacture of inactivated sorbate and emulsified vaccines against bluetongue virus are presented in this work. Such parameters as pH, viscosity and emulsion stability, vaccine reactogenicity and immunogenicity are identified in the experiments. The results of the study showed a good stability of emulsified vaccine with oil adjuvant and a lack of reactogenicity in sheep by intramuscular administration. Whereas the sorbed vaccine had a reactogenicity causing swelling and increasing of animal's body temperature during 2-3 days. The study of immunogenic properties on 40th day showed that the immune response of the emulsified vaccine is significant higher than that of the sorbed vaccine.
Введение
Блутанг (катаральная лихорадка овец, синий язык) - инфекционная, неконтагиозная, переносимая трансмиссивными насекомыми вирусная болезнь домашних и диких жвачных животных. В настоящее время известны 27 серотипов вируса блутанга [7], которые дают небольшие перекрестные реакции. Блутанг в естественных условиях поражает домашних и диких жвачных животных, в частности, вызывая тяжелое клиническое заболевание у овец [3].
В настоящее время эффективным методом борьбы с блутангом является специфическая вакцинопрофилактика. Применение моно-или поливалентных вакцин, содержащих инактивированный вирус, является самым эффективным методом борьбы с заболеванием в очагах и эндемичных регионах. Из-за определенных рисков, связанных с использованием живых вакцин, в том числе терато-генности, реверсии вирулентности, подавления иммунитета и генетической ассоциации
серотипов, инактивированные вакцины считаются более безопасными и использовались во многих европейских странах для контроля вспышек, снижения вирусемии и циркуляции вирусов [9].
Для повышения эффективности инакти-вированных вакцин против блутанга были проведены многие исследования по поиску вспомогательных веществ, способных повысить гуморальный и клеточный иммунный ответ организма. В настоящее время в составе инактивированных вакцин против блутан-га используются минерально-солевые и масляные адъюванты. Соли алюминия, которые представляют собой коллоидные дисперсии гидроксида алюминия (ГОА), являются одним из наиболее часто используемых адъю-вантов в вакцинах из-за их безопасности и низкой стоимости. Соли алюминия были использованы в ветеринарии и в вакцинах человека с 1930-х годов. Тем не менее, их главный недостаток - неспособность вызывать клеточный иммунный ответ, в частности, цитотоксический Т-клеточный ответ. Алюминиевые соли стимулируют синтез антител в регионарных лимфоузлах и вызывают скопление плазматических клеток в местах образования поствакцинальных гранулем [4].
Из веществ органической природы в качестве адъюванта часто используют сапонин. Известно, что сапонины, относящиеся к большой группе гликозидов растительного происхождения, имеют сложное химическое строение и обладают различными токсическими, гемолитическими и адъювантными свойствами [1].
В последнее время в практику вошел новый тип адъюванта, приготовленный на основе минеральных и неминеральных масел и их смесей. При использовании такого адъ-юванта предварительно растворенный или суспендированный в воде антиген очень тонко диспергирует в масле, в результате чего получают эмульсию типа «вода в масле», то есть капельки воды с антигеном находятся в масляной фазе. Биопрепараты с масляными адъювантами имеют более высокую имму-ногенность, чем сорбированные вакцины. Вакцины с масляными адъювантами отличаются высокой иммуногенной активностью,
но их применение сдерживается вследствие индуцирования серьезных местных реакций, образования абсцессов и т.д. По сравнению с масляными, сорбированные вакцины, содержащие в качестве сорбентов-адъювантов гели гидрата окиси алюминия, фосфата алюминия, фосфата кальция, имеют меньшую токсичность для животных, однако могут, особенно при подкожном введении, вызывать образование стерильных абсцессов и длительно персистирующих узелков.
Целью работы был подбор адъюван-тов, изучение их эффективности в составе инактивированных вакцин в сравнительном аспекте для оценки их способности вызывать гуморальный ответ и местную реакцию животных.
Материалы и методы
В исследованиях использовали вирус блу-танга 16-го серотипа с биологической активностью (6,91 ± 0,08) lg ТЦД50/см3, наработанный в культуре клеток ВНК-21/17.
Инактивацию вируса блутанга проводили 0,1 % бета-пропиолактоном (БПЛ) в течение 12 ч при температуре 37 °С.
Составление сорбированной инактиви-рованной вакцины. К инактивированной суспензии вируса блутанга добавляли 6 % ГОА до конечной концентрации (5-10) мг/мл, затем тщательно перемешивали и выдерживали при температуре (2-6) °С в течение суток для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч осторожно, не взбалтывая, декантировали 1/3 надосадка, доливали новую партию инактивированной вирусной суспензии до первоначального объема, тщательно перемешивали и выдерживали еще 24 ч. К полученной сорбированной вакцине добавляли 10 % сапонин до конечной концентрации 0,5 мг/мл, перемешивали и разливали в стерильные флаконы.
Составление эмульгированной инактивированной вакцины. Вакцину готовили путем объединения масляного адъюван-та Montanide ISA-71VG (Seppic, Франция) и охлажденного инактивированного антигена вируса блутанга в соотношении 7:3, путем тщательного перемешивания при помощи лабораторного миксера (T25 basic ULTRA-
TURRAX) при обороте 3000 об/мин в течение 10 мин.
Определение физических характеристик вакцин
Определение рН. Значения рН полученных образцов измеряли с помощью рН-метра С830, в трёх повторностях при постоянной температуре 25 °С.
Определение вязкости. Вязкость определяли на вискозиметре ВПЖ-2 согласно наставлению к прибору и выражали данные в мм2/с.
Контроль стабильности эмульгированной инактивированной вакцины. Стабильность эмульсии приготовленных инактивированных вакцин контролировали согласно инструкции компании «Seppic» (Франция) при помощи экспресс-метода центрифугирования.
Животные
В эксперименте были использованы кролики (массой от 2,0 до 3,0 кг) и овцы (породы казахские мериносы) в возрасте 6-9 мес, массой от 16,0 до 21,0 кг. На протяжении всего периода исследований животные содержались в виварии Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности (НИИПББ), Жамбылская область, Казахстан. Животных содержали в тихой и климатически контролируемой среде со свободным доступом к стандартному корму и воде. Перед экспериментом у всех овец брали сыворотку крови и исследовали в РН (реакция нейтрализации) и методом ТФ-ИФА на обнаружение груп-поспецифических антител к вирусу блутанга. Эксперименты проводили в соответствии с руководящими принципами, изложенными Комитетом по этике экспериментирования животных НИИПББ. Животные были использованы для вакцинации и оценки гуморального ответа, а также в тесте по оценке реактогенности.
Вакцинация животных: оценка реакто-генности и гуморального ответа
Овцы методом рандомизации были разделены на три группы по пять голов: 1-я группа контрольная (физиологической раствор),
2-я группа (вакцинирована ГОА вакциной),
3-я группа (вакцинирована эмульгированной вакциной). Препараты вводили овцам вну-
тримышечно по 2 см3 с внутренней стороны бедра. От животных каждой группы на 0, 7, 14, 21, 28 и 40-й день опыта из яремной вены брали образцы для получения сыворотки, которую тестировали на наличие специфических и нейтрализующих антител в реакциях ТФ-ИФА и РН.
Определение титра антител с помощью РН и ТФ-ИФА
Реакцию нейтрализации проводили в соответствии с методом Haig and MaRAA [5] с использованием контрольного штамма BTV-16 и серотип-специфической сыворотки против данного серотипа.
Постановку ИФА проводили согласно инструкции изготовителя (ID-Vet, Франция).
Результаты исследований
Получение и характеристика адъювант-ных вакцин
Сорбированную (ГОА) и эмульгированную (ISA-71VG) вакцину приготовили согласно инструкции производителя. ГОА-вакцина была получена в виде коллоидной дисперсии розоватого цвета. Эмульгированная вакцина получена в виде эмульсии белого цвета, однородной консистенции. После приготовления двух типов вакцин измеряли значения их рН, вязкости и стабильности эмульсии. Результаты представлены в таблице 1.
Из данных таблицы 1 видно, что значение pH ГОА-вакцины составило в среднем (6,68 ± 0,27), тогда как в эмульгированной вакцине рН показало значение (7,21 ± 0,22). Вязкость сорбированной и эмульгированной вакцин составили (21,2 ± 0,11) и (25,5 ± 0,35) мм2/с соответственно. Статистические анализы показали, что при определении pH у видов вакцин нет существенных различий, тогда как при изучении вязкости сорбированная вакцина значительно ниже (Р< 0,001) по сравнению с эмульгированной вакциной. При определении стабильности методом центрифугирования у образцов эмульгированной вакцины не происходило отделения водной фазы на дне, что свидетельствует о хорошей стабильности эмульсии изготовленного препарата согласно рекомендации производителя.
Таблица 1.
Физические параметры сорбированной и эмульгированной вакцин
Параметры Состав препарата р-значение
ГОА+Антиген КА-7^0+Антиген
рН 6,68±0,27 7,21±0,22
Вязкость (мм2/с) 21,2±0,1 25,5±0,4 < 0,001
Стабильность эмульсии не определяли стабильна -
значения приведены как среднее ± стандартное отклонение (п=3)
Реактогенность адъювантов в составе инактивированной вакцины
При изучении реактогенности особое внимание уделяли учету местных и общих реакций. Местные реакции учитывали по появлению инфильтрата в ответ на введение образцов. Общие реакции оценивали на основании клинических признаков при ежедневной термометрии в течение 14-ти суток после введения образцов.
В результате проведенных работ установлено, что у животных после введения образцов с содержанием ГОА 10 мг/см3 на месте введения появлялись инфильтраты размером (91,5x1,5) см. У животных данной группы отмечалось повышение температуры тела до 40,5 и 40,6°С в течение первых (2-3) суток (рис. 1) и хромота, инфильтрат рассасывался постепенно, исчезая на (5-8) сутки.
При изучении реактогенности эмульгированной вакцины установлено, что у животных после внутримышечного введения в объеме 2 см3 в месте введения не отмечались какие-либо клинические изменения или повышение температуры тела (рис. 1). Клиническое состояние у животных оставалось
Срок наблюдения, сут
Рис. 1. Температурная реакция животных, привитых сорбированной и эмульгированной вакцинами.
удовлетворительным на протяжении всего периода наблюдения.
Определение иммуногенности экспериментальных вакцин против блутанга
В следующей серии опытов изучали им-муногенность приготовленных сорбированной и эмульгированной вакцин на овцах, используя на каждый препарат по 5 голов животных. Результаты изучения динамики формирования группоспецифических антител представлены в таблице 2.
Результаты исследований и данные, представленные в таблице 2, показали, что при иммунизации как сорбированной, так и эмульгированной вакцинами в организме овец в течение 7-ми суток не выявляются группоспецифические антитела. Изучение сывороток крови вакцинированных животных на 14, 21 и 28-е сутки после иммунизации показало формирование группоспе-цифических антител в титрах от 1:200 до 1:1600. Исследования показали, что у животных, вакцинированных сорбированной вакциной, на 40-е сутки после введения титр группоспецифических антител снижается, когда как при иммунизации эмульгированной вакциной наблюдается существенное повышение титров антител до 1:6400. При этом в разный период времени (7, 14, 21 и 28-е сут) между средними титрами антител у животных, привитых сорбированной и эмульгированной вакцинами, существенной разницы не отмечалось, когда как на 40-е сут значимая разница наблюдалась между титрами антител двух групп животных, привитых данными вакцинами (р<0,001).
Наряду с проявлением группоспецифиче-ских антител, выявляемых в ТФ-ИФА, весьма важным является обнаружение вирусней-трализующих антител (ВНА), т. к. именно
Таблица 2.
Результаты исследований динамики формирования группоспецифических антител у вакцинированных животных
Вид вакцины Номер животного Титр антител в ТФ-ИФА, сут
0 7 14 21 28 40
ISA-71VG + Антиген 131 н/о н/о 1 400 1 800 1:800 1:6400
369 н/о н/о 1 400 1 800 1:800 1:6400
367 н/о н/о 1 400 1 800 1:1600 1:6400
137 н/о н/о 1 400 1 800 1:1600 1:6400
296 н/о 1:100 1 200 1 800 1:1600 1:3200
Средний±SD - 0 20±44 360±89 800±0,0 1280±438 5760±1431
ГОА+Антиген 635 н/о 1:100 1 200 1 200 1:800 1:200
378 н/о н/о 1 200 1 200 1:800 1:200
416 н/о н/о 1 200 1 200 1:1600 1:200
512 н/о н/о 1 200 1 200 1:1600 1:200
375 н/о н/о 1 200 1 800 1:800 1:800
Средний±SD - 0 20±44 200±0,0 320±268 1120±438 320±268
ISA-71VG + Антиген против ГОА+Антиген - n/s n/s п^ п^ n/s < 0,001
Примечания: «н/о» - не обнаружено; «n/s» - нет существенной разницы.
данный вид антител является важным показателем иммуногенности вакцинных препаратов. Поэтому в экспериментах необходимо было выяснить и динамику формирования ВНА в организме вакцинированных животных. Результаты проведенных исследований представлены на рисунке 2.
Результаты проведенных исследований показали, что на 7-е сутки после вакцинации у животных не выявляются ВНА. Исследования сывороток крови с 14-е по 40-е сутки после вакцинации показали повышение титра ВНА в пределах 2,0 и 7,0 соответственно у всех животных, независимо от типа использованных вакцин. Однако, у животных, вакцинированных сорбированной вакциной, наибольший пик отмечен на 28-е сутки и незначительное снижение на 40-е сутки, тогда как у животных, иммунизированных эмульгированной вакциной, динамика формирования антител не снижалась в течение 40-ка суток и составила 7,0 ^2.
Обсуждение результатов
Задачей вакцинации является создание напряженного и длительного иммунитета
путем максимального вовлечения в иммуногенез защитных механизмов организма, что во многом связано с выбором и использованием неспецифических стимуляторов иммуногенеза - адъювантов. Поскольку многие инактивированные вирусные вакцины вызывают слабые иммунные реакции, стали использовать адъюванты, добавление которых дало возможность в различной степени возместить этот недостаток.
8-1 7-
«м 6-
П)
5 5Н х~ 4Н
0Q
S
21-
ISA-71 VG+Антиген ГОА+Антиген
7 14 21 28
Время после вакцинации, сут
40
Рис. 2. Результаты исследования динамики формирования ВНА у вакцинированных животных. Значения приведены как средние титры антител ± SD. * - р<0,05.
По мнению Учителя И.Я., адъювантами могут быть вещества различной природы, оказывающие разный местный эффект: создающие «депо», вызывающие воспалительную реакцию и др. Адъюванты участвуют в процессах, происходящих на начальных этапах антителогенеза. Введение адъюван-тов усиливает клеточную пролиферацию и дифференцировку клеток, активируют их метаболизм, но, прежде всего, адъюванты изменяют функциональную активность клеток моноцитарной фагоцитирующей системы. Последнее имеет наиболее существенное значение для интенсивности иммуногенеза и его длительности [1].
При проведении опытов нами были получены два типа инактивированных вакцин на основе соли алюминия и минерального масла. При определении значений рН двух экспериментальных вакцин было установлено, что у эмульгированной вакцины значение рН оказалось слабощелочым и не должно вызывать реакции раздражения в месте введения. Тогда как рН сорбированной вакцины показало слабокислый показатель, что вызывает раздражение мышечной ткани, незначительное повышение температуры в течение 2-3 суток и образование припухлости в месте введения препарата, которая постепенно рассасывается в течение 5-6 суток.
Вакцины с адъювантами должны вводиться парентерально через шприцы, и при этом вязкость имеет решающее значение. По данным Jain et al. [6] установлено, что вязкость парентеральных препаратов может повлиять на проходимость через шприц. В результате проведенных нами исследований было установлено, что низкая вязкость препарата наблюдалась у ГОА-адъюванта, что обеспечивает легкую проходимость через шприц. При этом эмульсия типа «вода в масле» также легко проходила через шприц, хотя её вязкость была выше, чем вязкость у ГОА-вакцины.
Главным недостатком инактивированных эмульгированных вакцин является нестабильность эмульсии в процессе хранения препарата, приводящая к снижению иммуно-генности препарата.
По исследованию многих авторов [2], существует зависимость стабильности эмуль-
сии от степени очистки вируссодержащей суспензии, входящей в состав препарата. Авторами отмечено, что даже частичное разрушение эмульсии вследствие повышенного содержания балластных белков в инакти-вированной вакцине снижает антигенную активность препарата в 1,5-2 раза. В связи с этим для изучения стабильности эмульсии тестируемой вакцины нами был использован экспресс-метод центрифугирования. Данный метод используется при проведении контроля качества ветеринарных и человеческих вакцин, приготовленных с использованием масляных адъювантов. В результате проведенных нами исследований установлено, что вакцина, приготовленная на основе масляного адъюванта с типом эмульсии «вода-масло», оказалась стабильной, хотя при составлении данной вакцины не проводили очистки антигена.
Большинство адъювантов вызывают нежелательные эффекты в месте инъекции, наиболее частым является воспалительный ответ [8]. Согласно данным литературы, допускается образование инфильтрата в месте инъекции вакцины без проявления побочных реакций, таких как: повышение температуры тела, угнетённое состояние и проч. Тем не менее, среди более 100 различных соединений, описанных в литературе как адъ-юванты, большинство были слишком ре-актогенными для использования в области здравоохранения и ветеринарии.
В результате экспериментальных исследований установлено, что для составления инактивированных сорбированных вакцин против блютанга допустимым является использование ГОА в концентрации не более 10 мг/мл, превышение концентрации приводит к нежелательным побочным реакциям в организме овец. При использовании соли алюминия в вакцинах для человека существуют ограничения по содержанию алюминия. В европейских странах эти пределы составляют 1,25 мг/мл, а в США - 0,85 мг/мл. В ветеринарных вакцинах нет такого определенного предела для допустимого содержания в адъювантах соли алюминия. Хотя Уа11пНш сообщил, что до 12 мг алюминий в вакцинах хорошо переносится у свиней, в то
время как вакцинные препараты, содержащие 40 мг, индуцируют гранулемы [10].
Результаты определения реактогенности эмульгированных вакцин показали, что у овец после введения образцов не отмечались какие-либо изменения или повышение температуры тела. Клиническое состояние животных оставалось удовлетворительным на протяжении всего периода наблюдения.
Известно, что определение иммуностимулирующих свойств адъювантов или их способность формирования антител в условиях in vivo является одним из основных критериев оценки эффективности адъювантов.
При изучении иммуногенности тестируемых вакцин установлено, что обе вакцины, приготовленные из разных адъювантов, индуцировали образование антител в организме овец неодинаковой напряженности. Эмульгированная вакцина вызывала у вакцинированных животных более выраженный серологической ответ. Эти различия были особенно ярко заметны в опытах на 40-е сутки после вакцинации, что, видимо, было обусловлено тем, что масляные адъюван-ты способны вызывать весьма длительную плазмоцитарную реакцию по сравнению с адъювантами неорганической природы, способствующими формированию продолжительного поствакцинного иммунитета.
Заключение
Таким образом, в результате анализа литературных данных, в качестве эффективных адъювантов для вакцины против блутанга чаще всего используются ГОА, комплекс ГОА с сапонином и масляный адъювант Montanide ISA. При сравнительном изучении иммуностимулирующей эффективности и реактогенности подобранных адъювантов
в виду наилучших иммунобиологических показателей был признан оптимальным и включен в состав вакцины масляный адъю-вант Montanide ISA-71VG.
Список литературы
1. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины [Текст] / В.А. Сергеев. - Москва, 2007. - 507 с.
2. Aucouturier, J., Ganne, V Assessment of oil adjuvants in Newcastle disease vaccine [Текст] / J. Aucouturier, V Ganne // Proceedings of the XX World Poultry congress. - Montreal, 2000. - 128 р.
3. García-Bocanegra, I. Role of wild ruminants in the epidemiology of bluetongue virus serotypes 1, 4 and 8 in Spain [Текст] / A. Arenas-Montes, C. Lorca-Oró, J. Pujols, A. A. González, S. Napp [et al] // Vet Res. -2011. - № 42. - P. 1-7.
4. Gupta, R. K. Aluminum compounds as vaccine adjuvants [Текст] / R. K. Gupta // Adv. Drug Deliv. Rev. -1998. - № 32. - P. 155-172.
5. Haig, D. G., Mara, D. A. The cytopathic action of Bluetongue virus on tissue cultures and its application to the detection of antibodies in the serum of sheep [Текст] / D. G. Haig, D. A. Mara // Onderstepoort J. Vet Res. -1956. - № 27 (2). - P. 171-177.
6. Jain, J., Fernandes, C., Patravale, V. Formulation development of parenteral phospholipid-based microemulsion of etoposide [Текст] / J. Jain, C. Fernandez, V. Patravale // AAPS Pharm Sci. Tech. -2010. - № 11. - P. 826-831.
7. Jenckel, M. Complete coding genome sequence of putative novel bluetongue virus serotype 27 [Текст] / E. Bréard, C. Schulz, C. Sailleau, C. Viarouge, B. Hoffmann, D. Hoper, M. Beer, S. Zientara // GenomeAnnounc. -2015. - № 3 (2). - P 15-16.
8. Lindblad, E. B. Safety Evaluation of Vaccine Adjuvants, in Vaccine Adjuvants and Delivery Systems (ed M. Singh) [Текст] / E. B. Lindblad. - John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA. - 2007.
9. Noad, R., Roy, P. Bluetongue vaccines [Текст] / R. Noad, P. Roy // Vaccine. - 2009. - № 27. - P. 86-89.
10. Valtulini, S. Aluminium hydroxide-induced granulomas in pigs [Текст] / S. Valtulini, C. Macchi, P. Ballanti, Y. Cherel, A. Laval, J. M. Theaker [et al.] // Vaccine. - 2005. - № 23 (30). - P. 3999-4004.
Подписной индекс журнала «Актуальные вопросы ветеринарной биологии»:
Агентство «Росспечать» - 33184
