CC BY
94
БИОТЕРАПИЯ
УДК 616-006.81:576.385.5:575 Т.В. Михайлова, М.А. Барышникова, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников СРАВНЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ HSP70 НА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМЫ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Михайлова Татьяна Витальевна, научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-10-65 e-mail: [email protected]
Статья поступила: 15.12.2009, принята к печати 25.03.2010.
Резюме
Уровень экспрессии белка теплового шока (heat shock protein) hsp70 имеет прогностическое значение в опухолях различного типа и используется для стимуляции иммунного ответа при вакцинотерапии злокачественных новообразований.
Экспрессию hsp70 определяли на 15 клеточных линиях меланомы после замораживания и прогревания. Определение уровня экспрессии проводили методом иммуноблоттинга.
Уровень hsp70 в лизатах клеток, подвергшихся прогреванию, резко отличался от уровня белка в клетках, подвергшихся замораживанию. Установлено, что экспрессия hsp70 не зависит от экспрессии молекул HLA I и II классов. Высокий уровень экспрессии hsp70, выявленный в лизатах клеточных линий после заморозки, может быть применен впоследствии при вакцинации пациентов с меланомой.
Ключевые слова: hsp70, клеточные линии меланомы, иммуногенность.
T.V. Mikhailova, M.A. Baryshnikova, O.S. Burova, L.F. Morozova, I.N. Mikhailova, A.Yu.Baryshnikov EXPRESSION OF HSP70 IN MELANOMA CELL LINES N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
Expression of hsp70 is of prognostic significance in several tumor types and use as a marker of immune response in tumor vaccination.
In this study, expression of hsp70 was determined in 15 melanoma cell lines. We have followed the expression of hsp70 in melanoma cells after freezing and heating. Expression of hsp70 was validated by Western blot analysis.
There was a significant difference in protein level of hsp70 between melanomas cell lines and after heating/freezing.
It has been also established that expression of hsp70 was not correlated with the expression of HLA. The high expression of hsp70 in cells after freezing indicates that this protein might be a potential vector in melanoma vaccination.
Key words: hsp70, melanoma cell lines, immunotherapy.
Введение
Меланома кожи еще 30-40 лет назад была сравнительно редкой патологией в большинстве стран мира. Однако за истекшее время частота ее возникновения значительно увеличилась и продолжает неуклонно возрастать. Среднегодовой темп прироста заболеваемости этой опухолью в мире составляет около 5 % (в США - 4 %, в России - 3,9 %) и может считаться одним из самых высоких среди всех злокачественных опухолей, кроме рака легкого.
Меланома считается «антигенной опухолью», экспрессирующей так называемые опухолеассоциированные антигены. Эти антигены используются при вакцинотерапии, которая является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний [3].
В процессе поиска опухолеспецифических антигенов было установлено, что белки теплового шока обладают высокой иммуногенной активностью.
Наиболее широко распространены и лучше изучены hsp с молекулярным весом 70 кДа. Представители этого семейства участвуют во многих внутриклеточных процессах. Действуя как молекулярные шапероны, они способствуют образованию мультибелковых комплексов, принимающих участие в транслокации полипептидов через клеточную мембрану в ядро, а также обеспечивают правильное сворачивание полипептидной цепи. Недавно было установлено, что экстрацеллюлярно-локализованные hsp 70 играют ключевую роль в индуцировании клеточного иммунного ответа [4; 5].
При многих злокачественных новообразованиях hsp высоко экспрессируются и участвуют в пролиферации, дифференцировке, метастазирова-нии и узнавании опухолевых клеток иммунной системой. Они являются важными биомаркерами канцерогенеза в некоторых тканях и сигнализируют о степени дифференцировки и агрессивности некоторых видов рака [2].
Уровень экспрессии 115р70 в сравнении с экспрессией других антигенов на клеточных линиях меланомы
Степень дифференцировки опухолевых клеток Название линии Hsp-70, % HLA-ABC, % HLA-DR, % MelanA HMB-45 Tyr
Высокая Mel Si Mel Si t* Mel Si fr** 5,29 11,98 16,47 99,5 96,0 neg pos pos
Mel Me Mel Me t Mel Me fr 20,04 24,76 16,56 94,1 43,7 pos pos neg
Умеренная Mel R MelRt Mel R fr 9,62 7,97 8,82 83,7 1,4 neg neg neg
Mel P Mel P t Mel P fr 8,00 8,81 10,24 99,3 2,3 neg pos neg
Mel II Mel II t Mel II fr 6,78 7,29 9,69 93 1,9 pos pos pos
Mel Z Mel Z t Mel Z fr 13,81 5,92 14,58 99,7 5,1 pos pos pos
Низкая Mel Mtp Mel Mtp t Mel Mtp fr 9,00 6,39 19,73 99,1 63,3 neg neg neg
Mel Kor Mel Kor t Mel Kor fr 5,13 6,32 8,42 0,1 0,4 pos pos pos
Mel Ibr Mel Ibr t Mel Ibr fr 5,13 5,25 5,39 99,5 47,2 neg neg neg
Mel Is Mel Is t Mel Is fr 15,17 4,76 11,12 86,2 26,2 pos pos pos
Mel Ch Mel Ch t Mel Ch fr 5,46 3,72 5,96 96,0 25,1 neg neg neg
Mel Cher Mel Cher t Mel Cher fr 9,6 9,09 9,83 98,1 61,0 neg pos pos
MelGi MelGi t Mel Gi fr 7,56 9,07 12,38 89,8 37,6 neg neg neg
Mel Gus Mel Gus t Mel Gus fr 8,38 8,44 9,09 97,9 90,0 pos pos neg
Mel Rac Mel Rac t Mel Rac fr 6,24 6,27 8,34 93,8 63,2 neg neg neg
*1 - клетки, прогретые при температуре 42 °С на водяной бане в течение 10 мин; **Гг - клетки после заморозки при температуре -80 °С.
Ме1 к Ме1Мр Ме181 Ме1 Я
Ме11Ьг Ме1 СЬег Ме1СИ Ме1 II
Ме1Ког Ме101 Ме1Ме 1УЫ0ш
Ме1Р
MdZ
Ме1 Иле
Анализ экспрессии белка 1а8р70 в лизатах клеточных линий меланомы человека методом иммуноблотинга.
Экспрессия hsp индуцируется не только при повышении температуры, но и при других таких стрессовых воздействиях, как замораживание, окислительный стресс, отравление тяжелыми металлами, алкоголем [7].
Способность белков теплового шока связывать пептиды-антигены легла в основу иммунотера-певтического подхода к лечению онкозаболеваний. Белки теплового шока, кроме проявления шапероно-вой активности к опухолевым пептидным антигенам, облегчают вхождение в клетки hsp-пептидных комплексов за счет рецепторного эндоцитоза. Эта способность hsp позволила достаточно быстро перейти от изучения hsp-вакцин на моделях животных к лечению раковых заболеваний в клинике. Раньше для вакцинации использовались выделенные из опухолей онкологических больных пептидные комплексы hsp70 и Grp96, затем эффективность hsp-вакцин удалось увеличить при выделении hsp70 из гибридов дендритных клеток с опухолевыми [8].
Как шапероны hsp проявляют антигенпре-зентирующую функцию путем связывания антигенов. Цитоплазматические изоформы hsp70 и hsp90 способны связывать антигенные белки и доставлять их в эндоплазматический ретикулум. Известно, что антигены связываются с молекулами HLA I класса при воздействии гликопротеина GP96 (GRP94) -эндоплазматической изоформы hsp90. Белки теплового шока взаимодействуют с антигенпрезенти-рующими клетками через CD91 и другие рецепторы, инициируя каскад событий, включающих репрезентацию hsp-шаперонных пептидов главному комплексу гистосовместимости [1; 6; 13].
Целью настоящей работы явилось сравнение уровня экспрессии hsp70 на клеточных линиях меланомы для последующего отбора линий с высокой экспрессией как потенциально иммуногенных.
Материалы и методы
Препараты и реактивы
L Акриламид/бис-акриламид 30 %-ный р-р (Sigma); L Электродный буфер - 10*Tris/Glycine/SDS Buffer (Bio-Rad);
L буфер для переноса - 10^Tris/Glycine buffer (Bio-Rad);
L натрия додецил сульфат (SDS) (Bio-Rad);
L краситель Bromophenol Blue Sodium salt (Helicon); L аммония персульфат (Helicon);
L ТЕМЕД (Helicon);
L фосфатно-солевой буфер рН 7,4 (ПанЭко);
L 2-меркаптоэтанол (Helicon);
L неионогенный детергент Triton X-100 (Bio-Rad).
Приборы
L Прибор для анализа гелей Syngene;
L спектрофотометр Beckman coulter DU 800;
L центрифуга Eppendorf centrifuge 5417 R;
L шейкер Biosan PSU -2T;
L вортекс Heidolph Reax top;
L камера для электрофореза и иммуноблота BioRad Power Pac HC (Bio-Rad).
Получение лизатов клеточных линий Клетки линий меланомы mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Il, mel Is, mel Si, mel Me, mel Gus, mel Z,mel Gi, mel Ibr, mel R, mel Rac, mel Ch, Mel Cher из коллекции РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН культивировали в полной питательной среде RPMI 1640 с 10%-ной телячьей эмбриональной сывороткой. Далее клетки подвергали тепловому воздействию при
42 °С в течение 10 мин на водяной бане, после чего выдерживали в СО2-инкубаторе 30 мин. В работе также использовались клетки после заморозки. Для получения опухолевого лизата в суспензию, содержащую 5 млн клеток, поочередно добавляли лизи-рующий буфер (буфер А) в количестве 300 мкл.
Состав буфера А:
L 50 мМ трис 1 (гидроксиметил) аминометан (Helicon), L 120мМ NaCl,
L 1 мМ дитиотреитол (Fluka),
L 0,5 %-ный неионогенный детергент NP-40 (Sigma),
L 1 мМ ЭДТА (Helicon),
L 0,25 %-ный натрия дезоксихолат (Sigma),
L коктейль ингибиторов протеаз PIC (Rôche).
Затем выдерживали во льду 30 мин. Разрушенные клетки осаждали центрифугированием (20 мин при 2000 g). Супернатант отбирали и использовали для постановки электрофореза по стандартной методике [12]. Анализируемые белки растворяли в буфере для проб Laemmli Sample buffer (BioRad), на каждую дорожку наносили 20 мкг белка. После окончания электрофореза гель извлекали и использовали для переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Sigma).
Иммуноблотинг
Нитроцеллюлозную мембрану с перенесенными белками инкубировали при комнатной температуре в течение часа с 5 %-ным раствором сухого молока Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (BioRad) для блокирования неспецифического связывания в буфере Б, состоящем из 2М трис, 0,5 М ЭДТА, 5М NaCl, 0,1 %-ного реагента Tween 20 (Bio-Rad). Затем мембрану дважды отмывали по 10 мин в 20 мл буфера Б. Далее проводили инкубацию с антителами Mouse anti-heat shock Protein 70 Monoclonal Ig G (Abfrontier), разведенными в соотношении 1: 2000 в буфере Б в течение 90 мин. После этого мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере Б.
Инкубацию с антителами Blotting Grade Affinity Purified Goat Anti Mouse Ig G Alkaline Phosphatase conjugate (Bio-Rad), разведенными в соотношении 1:3000 в буфере Б, проводили в течение 90 мин. Затем мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере Б.
Мембрану детектировали с помощью красителя 1 Step NbT/BCIP (Thermo scientific). Результат и степень интенсивности окраски полос фиксировали на приборе Syngene с помощью программы Gene tools (см. рисунок).
Результаты и обсуждение
Экспрессия hsp70
в клетках меланомы человека
На начальной стадии работы мы определяли методом иммуноблоттинга уровень экспрессии hsp70 в лизатах клеток меланомы, полученных из опухолевого материала больных диссеминированной меланомой и выведенных в клеточную линию в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Во всех 15 анализируемых клеточных линиях меланомы был обнаружен белок с молекулярной массой 70 кДа, соответствующий полноразмерному белку hsp70.
Однако количество его варьировало как в различных клеточных линиях, так и в зависимости от предварительной обработки клеток.
Сравнивали уровень экспрессии hsp70 с экспрессией антигенов гистосовместимости ! (HLA-ABC) и П (HLA-DR) классов. Экспрессию HLA-ABC и HLA-DR ранее определяли в нашей лаборатории на проточном цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson),используя антитела фирмы Serotec. HLA ! и П классов экспрессируются на клетках различных типов и разной степени дифференцировки [11].
Был проведен анализ корреляции экспрессии hsp70 с дифференцировочными, тканеспецифичными и неопухолеассоциированными антигенами меланомы (MelanA,HMB-45, Tyr) и др., экспрессию которых определяли ранее в нашей лаборатории им-муноцитохимическими методами. Количественный анализ экспрессии hsp70 в сравнении с уровнем экспрессии HLA-ABC, HLA-DR и других антигенов на клеточных линиях меланомы представлен в таблице.
Так, самое низкое содержание hsp70 обнаружено на линиях Mel Si, Mel Kor, Mel Ibr, Mel Ch. Высокое содержание hsp70 зафиксировано на линиях Mel Me, Mel Is, Mel Z. Высокий уровень экспрессии hsp70 в клетках после прогревания наблюдали на клеточных линиях Mel Me, Mel Si. Наибольшее количество hsp70 в клетках, подвергнутых заморозке, обнаружили на линиях Mel Si, Mel Mtp, Mel Is, Mel Gi, Mel Me, Mel Z.
Полученные данные указывают на то, что в наших экспериментах наиболее высокий уровень экспрессии hsp70 имеют клетки после предварительной заморозки.
Низкое содержание hsp70 в клетках после прогревания по сравнению с интактными клетками и клетками после заморозки говорит о том, что температуру и время прогревания необходимо корректировать.
Так, по некоторым данным [9], клетки меланомы прогревали при температуре 38,5 °С в течение 1 ч, после чего лизировали. В другой работе [10] клетки меланомы прогревали при 42 °С в течение 60 мин, после чего инкубировали 24 ч и затем лизировали. Используя эти данные, мы изменяли температуру и время прогревания, но наибольшее количество hsp70 было зафиксировано при прогревании при 42 °С в течение 10 мин и последующем лизисе через 30 мин. Практически не изменялся уровень экспрессии в клетках после прогревания по сравнению с непрогре-тыми клетками на клеточных линиях Mel R, Mel Kor, Mel Ibr, Mel Cher, Mel P, Mel Gus, Mel Rac. Эти результаты могут указывать на то, что клетки этих линий слабо реагируют на прогревание. Подобный результат был получен на устойчивой к прогреванию клеточной линии меланомы В16 [14].
Выводы
1. На основании полученных результатов установлено, что исследованные нами клеточные линии меланомы различаются по уровню экспрессии hsp70.
2. Интенсивность экспрессии hsp70 меняется в зависимости от типа воздействия. Мы предполагаем, что потенциально более перспективным для создания стимуляторов иммунного ответа больных меланомой кожи будет использование клеток линий Mel Si, Mel Mtp, Mel Is, Mel Z после предварительной заморозки.
3. Интенсивность экспрессии hsp70 меняется в зависимости от времени воздействия на клетки.
4. Уровень hsp70 не зависит от экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости HLA-ABC и HLA-DR.
Авторы статьи выражают благодарность кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей Вартанян А А. за помощь в работе.
Литература
1. Бережной А.Е., Закеева И.Р., Барышников А.Ю. и др. Анализ экспрессии молекул HLA-E в клетках меланомы человека // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2006. - №3. - С. 66-71.
2. Гужова И.В. Механизмы работы шаперона hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии: Автореф. дис. ... д-ра биол.наук. - СПб,2004. - 40 с.
3. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин//Вестник Российской академии медицинских наук. - 2005. - Т.7 - С.37-40.
4. Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. Пер.с англ. - М.: Бином-Пресс, 2004. - С. 69.
5. Basu S., Binder R.J., Ramalingam T., Srivastava P.K. Heat shock proteins as novel mediators of cytokine secretion by macrophages // Cell Stress Chaperones. - 1998. - Vol. 3. - P. 11.
6. Boon T., Pierre C., Benoit J. et al. Human T-Cell Responses Against Melanoma // Annu. Rev. Immunol. -2006. - 24(6). - P. 1-6.34.
7. Blackere N., Li Z., Chandawarcar R. et al Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity//! Exp. Med. - 1997. - Vol. 186. - P. 1315-22.
8. CraigEA., Gross CA. Is HSP70 the cellular thermometer?//Trends Biochem.Science. - 1991. - Vol. 16. - P. 135-40.
9. He L., Guan K., Ye H. Heat shock protein 70 expression in relation to apoptosis in primary bladder transitional cell carcinoma // Cninese Med. J. - 2005. - Vol. 118(24). - P. 2093-6.
10. Ferrini U., Falcioni R., Delpino A. et al. Heat-shock proteins produced by two human melanoma cell lines: Absence of correlation with thermosensitivity // Int. J. of Cancer. - 2006. - Vol. 34. - P. 651-5.
11. Seliger B., Ritz U., Ferron S. Molecular mechanisms of HLA class ! antigen abnormalities following viral infection and transformation // Int. J. Cancer. - 2006. - Vol. 118. - P. 129-38.
12. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual (2nd edn). Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989. - P. 1847-75.
13. Suzue K., ZhouX., Eisen H.N., YoungRA. Heat shock fusion proteins as vehicles for antigen delivery into magor histocompatibility complex class I presentation pathway//Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1997. - Vol. 94. - P. 13146-51.
14. Anderson R.L, Tao T. W, Betten D.A, Hahn G.M. Heat shock protein levels are not elevated in heat-resistant B16 melanoma cells // Radiat. Res. - 1986. - Vol. 105. - P. 240-6.
