CC BY
237
, Ferek J., Wöjtowicz a case report. Med.
9. Tomasik T., Zawilinska B., Pawlik D., Ferek J., A. et al. Congenital cytomegaly in one twin WiekuRozwoj. 2012; 16 (3): 252—60.
10. Astsaturova O.R., Nikonov A.P. Cytomegalovirus infection and pregnancy. ConsiliumMedicum. 2008; 6: 34—7. (in Russian)
11. Baryshnikov E.N., Drozdov V.N., Shulyat'ev I.S., Parfenov A.I. Cytomegalovirus infection at patients ulcer colitis. Eksperimental'naya i klinicheskayagastroenterologiya. 2010; 10: 25—8. (in Russian)
12. Kojima Tetsu, Watanabe Toshiaki, Hata Keisuke, Shinozaki Masaru et al. Cytomegalovirus infection in ulcerative colitis. Scand. J. Gastroenterol. 2006; 41 (6): 706—11.
13. Yarullina D.R., Il'inskaya O.N., Silkin N.I., Salakhov M.H. The infectious nature of an atherosclerosis: the facts and hypotheses. Uchebnye zapiski Kazanskogo gos. un-ta. 2010; 1: 136—54. (in Russian)
14. Sheen Jiunn-Ming, Kuo Ho-Chang, Yu Hong-Ren, Huang Eng-Yen et al. Prolonged acquired neutropenia in children. Pediatr. Blood Cancer. 2009; 53 (7): 1284—8.
15. Abukawa Daiki, Takeyama Junji, Miura Katsushi Eosionophilic gastroenteritis with cytomegalovirus infection in an immunocompetent child. World J. Gastroenterol. 2007; 13 (34): 4653—4.
16. Hernadi K., Szalmas A., Mogyorosi R., Czompa L., Veress G., Cso-ma E. et al. The prevalance of herpes viruses in human apical periodontitis samples. Fogorv. Sz. 2012; 105 (4): 135—40.
17. Smirnov A.V., Chuelov S.B., Bryusova I.B., Ivanova Ju.N., Volkova G.I., Karpina L.M. et al. Clinical variants of current cytomegalovirus a hepatites. Detskie infektsii. 2008; 1: 18—22. (in Russian)
18. Chee S.P., Jap A. Cytomegalovirus anterior uveitis: Outcome of treatment. Brit. J. Ophthalmol. 2010; 94 (12): 1648—52.
19. Zaykova E.F., Dolgikh T.I., Noskova F.V. Etiological structure and clinical-immunologycal the characteristic lymphadenitis infectious in Omsk area. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. 2008; 1: 18— 22. (in Russian)
20. Tzavella Konstantina, Zantidis Anestis, Economou Ippolyti, Man-draveli Kalliopi Portal hypertension caused by acute cytomegalovirus infection with liver involvement in an immunocompetent patient. Scand. J. Infect. Dis. 2007; 39 (2): 177—8.
21. Alves Bonon Sandra Helena, Rossi Claudio Lucio, De Souza Carmino Antonio Comparison of serology, antigenemia assay for the polymerase chain reaction for monitoring active cytomegalovirus infections in hematopoietic stem cell transplantation patients. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 2006; 48 (5): 275—8.
22. Subramanian Venkataraman Distinguishing primary CMV infection from reactivation of latent infection. Dig. Dis. Sci. 2008; 53 (1): 140.
23. Zaytsev V.M., Liflyandskiy V.G., Marinkin V.I. Applied medical statistics [Prikladnaya meditsinskaya statistika]. Sankt-Peterburg: Foliant; 2006. (in Russian)
Поступила 21.02.14 Received 21.02.14
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.887.083.12
Румянцева Т.А.1, Варламова А.В.1, Гущин А.Е.1, Безруков В.М.2
СРАВНЕНИЕ ТЕСТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ UREAPLASMA PARVUM, UREAPLASMA UREALYTICUM, MYCOPLASMA HOMINIS: "MYCOpLAsMA DuO", "УРЕАПЛАЗМА МИКРОТЕСТ", "МИКОПЛАЗМА МИКРОТЕСТ" И "АМПЛИСЕНС-ФЛОРОЦЕНОЗ-МИКОПЛАЗМЫ-FL"
1ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, 111123, Москва;
2ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, 119991, Москва
Генитальные микоплазмы (ГМ) — условно-патогенные бактерии, выявление которых необходимо проводить в количественном формате. В данном исследовании сравнивали наборы реагентов "Mycoplasma Duo", "Уреаплазма Микротест", "Микоплазма Микротест" и "АмплиСенс-Флороценоз-Микоплазмы-FL". Получены высокие показатели диагностической чувствительности (ДЧ) и диагностической специфичности (ДС) всех наборов, при этом самые низкие показатели отмечены при применении набора "Mycoplasma Duo". Обнаружена корреляция количественных значений, определяемых с использованием культурального исследования и ПЦР. Воспроизводимость количественных значений культуральногометода оказалось существенно ниже таковой для набора "Флороценоз-Микоплазмы".
Ключевые слова: генитальные микоплазмы; Ureaplasma parvum; Ureaplasma urealyticum; Mycoplasma hominis; количественный анализ; полимеразная цепная реакция.
T.A. Rumiyantseva, A.V. Varlamova, A.E. Guschin, V.M. Bezrukov
THE COMPARISON OF TESTS FOR QUALITATIVE EVALUATION OF UREAPLASMA PARVUM, MYCOPLASMA HOMINIS: "MYCOPLASMA DUO", "UREAPLASMA MICROTEST", "MYCOPLASMA MICROTEST" AND "AMPLISENS-FLOROCENOSIS-MYCOPLASMA-FL"
The genital mycoplasma is an opportunistic bacteria and its detection is to be implemented in qualitative format. The study was organized to compare reagents kits "Mycoplasma Duo", "Ureaplasma Microtest", "Mycoplasma microtest" and "AmpliSens-Florocenosis-Mycoplasma-FL". The study resulted in high indicators of diagnostic .sensitivity and diagnostic .specificity for all kits. At that, the lowest indicators were registered under application of "Mycoplasma Duo" kit. The study reveled correlation of qualitative values detected by using cultural analysis and polymerase chain reaction. The reproducibility of qualitative values of cultural method occurred significantly lower in comparison with "AmpliSens-Florocenosis-Mycoplasma-FL" kit.
Keywords: genital mycoplasma; Ureaplasma parvum; Ureaplasma urealyticum; Mycoplasma hominis; qualitative analysis; polymerase chain reaction
Введение. Генитальные микоплазмы (ГМ, бактерии рода Ureaplasma — U. parvum, U. urealyticum, а также Mycoplasma
Для корреспонденции:
Румянцева Татьяна Андреевна, науч. сотр.
Адрес: адрес: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а.
E-mail: [email protected]
hominis) — условно-патогенные бактерии, которые могут участвовать в развитии патологических процессов в органах урогенитального тракта. Описана связь уреаплазм с бесплодием [1], преждевременными родами [2], хориоамнионитом [2], пиелонефритом [3], воспалительными заболеваниями органов малого таза (ВЗОМТ) [4]. Показана ассоциация M. hominis с развитием эндометрита [5] и преждевременны-
Таблица 1
Результаты, полученные с использованием трех наборов реагентов, в качественном формате
ми родами [5]. Известны случаи выделения M. hominis как единственного возбудителя менингоэнцефалита [6], абсцесса головного мозга [7], пневмонии [8], медиастинита [9], перикардита [10], эндокардита [11], остеита [12], артрита [13], раневой инфекции [14]. Уреаплазмы и M. hominis в большей степени ассоциированы с нарушениями видового и количественного состава микрофлоры урогенитального тракта, т. е. с бактериальным вагинозом [15].
Несмотря на то что истинная роль ГМ в развитии патологии остается предметом дискуссии, очевидно, что данные микроорганизмы относятся к условно-патогенным и могут присутствовать в урогенитальном тракте здоровых людей. M. hominis обнаруживают у 10—50% женщин [5], Ureaplasma spp. (U. parvum и U. urealyticum) — у 11—80% женщин [5]. Важным патогенетическим показателем может стать не только обнаружение микоплазм, но и количественная оценка бактериальной нагрузки, отражающая массивность микробной обсемененности. Показана связь между массивностью обсе-мененности слизистой оболочки урогенитального тракта ГМ и риском развития осложнений во время беременности (хо-риоамнионит, низкая масса тела новорожденных [2]) и вне беременности (эндометрит [16]).
Для выявления и количественной оценки U. parvum, U. urealyticum, M. hominis в биологическом материале традиционным считается бактериологическое исследование. В настоящее время разработаны и внедрены тесты, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени, позволяющая выявлять микроорганизмы и одновременно проводить количественную оценку с высокой точностью и воспроизводимостью.
Цель данной работы — сравнение результатов (как качественных, так и количественных) исследования биологического материала с использованием трех серийно выпускаемых наборов реагентов: трех тестов для бактериологического исследования — "Mycoplasma Duo" ("Bio-Rad", США), "Уреаплазма Микротест", "Микоплазма Микротест" (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) [17], а также теста на основе ПЦР в реальном времени ("АмплиСенс-Флороценоз-Микоплазмы-FL" (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).
Материалы и методы. В исследование были включены образцы биологического материала от 220 пациенток Научно-консультативного клинико-диагностического центра (НККДЦ) ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Сбор материала проводили с октября по ноябрь 2012 г. Средний возраст пациенток составил 30,8±7,9 года (от 18 до 64 лет). В исследование включали пациенток, не принимавших антимикробных и пробиотических препаратов, а также не использовавших антисептических средств в течение 4 нед до посещения врача. Все пациентки подписывали форму информированного согласия на участие в исследовании. Исследование одобрено этическим комитетом ФБУН ЦНИИ эпидемиологии.
Всем пациенткам проводили осмотр влагалища и шейки матки в зеркалах, а также бимануальное исследование. При осмотре получали вагинальный мазок с боковой стенки влагалища. Для забора материала использовали дакроновые зонды. Полученный материал переносили с зонда в транспортную среду объемом 2 мл, поставляемую в комплекте "Mycoplasma Duo". Полученные образцы хранили при 6±2oC не более 24 ч до момента доставки в лабораторию.
Далее материал из каждой пробирки тестировали с использованием 4 наборов реагентов: "Mycoplasma Duo", "Уреаплазма Микротест", "Микоплазма Микротест", "Ам-плиСенс-Флороценоз-Микоплазмы-FL" (далее — "Флороце-ноз-Микоплазмы").
Полуколичественное исследование с использованием набора реагентов "Mycoplasma Duo" выполняли в соответствии с инструкцией производителя.
Культивирование бактерий Ureaplasma и M. hominis с использованием наборов реагентов "Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест" проводили в 96-луночных кругло-донных планшетах ("Sarstedt", Германия) в объеме среды 250 мкл под слоем стерильного минерального масла. Для определения количества цветообразующих единиц (ЦОЕ) готовили серию 10-кратных разведений (от 10-1 до 10-6) исходного образца в среде роста, каждое разведение вносили в 3 параллельные лунки планшета. Планшеты с посевами инкубировали в термостате при 37oC в течение 72 ч. Учет результатов проводили, подсчитывая количество лунок каждого разведения, в которых произошло изменение цвета среды вследствие роста микроорганизмов.
Для исследования с использованием набора "Флороце-ноз-Микоплазмы" отбирали аликвоту 100 мкл из исходного образца, проводили выделение нуклеиновых кислот с помощью набора реагентов ДНК-Сорб-АМ (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии) в соответствии с инструкцией производителя. При применении данного набора реагентов показана высокая эффективность экстракции нуклеиновых кислот [18]. Далее предпринимали амплификацию и учет результатов в геномных эквивалентах — ГЭ по инструкции производителя. Обработка результатов амплификации с количественной оценкой
Таблица 2
Чувствительность, специфичность, ПЗПР, ПЗоР трех наборов реагентов
Образцы Показатель, % "Флороце-ноз-Мико-плазмы" "Mycoplasma Duo" "Микоплазма (Уреаплазма)-Микротест
Ureaplasma spp. ДЧ 100 96,1 98
(102 истинно ДС 97,5 96,6 100
положительных,
118 истинно ПЗПР 97,1 96,1 100
отрицательных) ПЗОР 100 96,6 98,3
M. hominis ДЧ 96 96 96
(25 истинно ДС 99,5 98,5 100
положительных,
195 истинно ПЗПР 96 88,9 100
отрицательных) ПЗОР 99,5 99,5 99,5
"Флороценоз-Микоплазмы" "Mycoplasma Duo" "Микоплазма (Уреаплазма)-Микротест" Число пациенток
Ureaplasma spp.
+ + + 98
+ + - 0
+ - + 2
+ - - 5
- - + 0
- - - 111
- + + 0
- + - 4
M. hominis
+ + + 23
+ + - 0
+ - + 0
+ - - 2
- - + 0
- - - 191
- + + 1
- + - 3
7-1 65" I 4
Зз
О
2 Н
Ureaplasma spp.
Ai |ЦШ1 A A^Jii Ai
R 2 =0,7917 р<0,0001
7 -| 65" 1 4
Зз
О
2 Н
О 1
0 12 3 4
geq/ml
5 6 geq/ml
7 8 9 10
Рис. 1. Корреляция количественных результатов, полученных при использовании "Флороценоз-Микоплазмы" (в ГЭ/мл) и "Микоплазмы Микротест" (в ЦОЕ/мл).
geq/ml — ГЭ/мл; CCU/ml — ЦОЕ/мл. Получена корреляция для уреаплазм, четкой количественной корреляции для M. hominis получить не удалось ввиду ограничения метода "Микоплазма Микротест", при котором максимально возможная концентрация составляет 106 ЦОЕ/мл.
осуществлялась автоматически в специальном программе, что исключало влияние субъективных факторов на результат.
Полученные результаты анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 4.0.
Результаты и обсуждение. Проведен анализ совпадения результатов трех изучаемых тестов (табл. 1). Для Ureaplasma spp. положительный результат трех исследований получен в 98 из 220 случаев, отрицательный — в 111 из 220 (совпадение результатов — 95% (209 из 220)). Для M. hominis положительный результат трех исследований получен в 23 из 220 случаев, отрицательный — в 191 из 220 (совпадение результатов — 97,3% (214 из 220)).
Тестирование на наличие Ureaplasma spp. дало 11 несовпадающих результатов: 2 положительных образца по результатам "Флороценоз-Микоплазмы" и "Уреаплазма Микротест" (концентрация 103 ЦОЕ/мл в микротесте; 2 • 103 и 6 • 103 ГЭ/мл в ПЦР); 5 положительных образцов только в тесте "Флороценоз-Микоплазмы" (концентрация 6 • 101—2 • 103 ГЭ/ мл; для всех образцов проводили повторную экстракцию ДНК и амплификацию в трех повторах, при этом 2 из 5 образцов показали положительный результат в трех повторах); 4 положительных образца только по результатам "Mycoplasma Duo" (концентрация < 103 ЦОЕ/мл в 2 образцах, > 104 ЦОЕ/мл в 2 образцах). Для Ureaplasma spp. истинно положительными признаны 102 образца. Из них 98 были положительными по результатам трех тестов, 2 — по данным "Флороценоз-Мико-плазмы" и "Уреаплазма Микротест", и еще 2 образца дали воспроизводимый положительный результат в тесте "Флоро-ценоз-Микоплазмы".
Шесть несовпадающих результатов получено для M. hominis: 2 образца положительны только по данным "Флоро-ценоз-Микоплазмы" (концентрация 4 • 102 и 2 • 104 ГЭ/мл; для всех образцов проводили повторную экстракцию ДНК и амплификацию в трех повторах, при этом 1 из 2 образцов показал положительный результат в трех повторах); 1 образец был положительным по данным "Mycoplasma Duo" и "Ми-коплазма Микротест" (концентрация <103 ЦОЕ/мл по данным "Mycoplasma Duo"; 103 ЦОЕ/мл в "Микоплазма Микротест"); 3 образца были положительными только по данным "Mycoplasma Duo" (концентрация > 104 ЦОЕ/мл). Для единственного образца, отрицательного по данным "Флороце-ноз-Микоплазмы", но положительного в тестах "Mycoplasma Duo" и "Микоплазма Микротест", получен положительный результат после повторного выделения нуклеиновых кислот и повторного проведения ПЦР. Для M. hominis истинно положительными признаны 25 образцов. Из них 23 положительны по данным всех трех тестов, 1 — по результатам "Mycoplasma Duo" и "Микоплазма Микротест" и 1 — в тесте "Флороценоз-Микоплазмы".
На основании полученных результатов проведен расчет
M.hominis диагностических характеристик — диагно-
стической чувствительности (ДЧ) и диагностической специфичности (ДС) трех изуча-а емых наборов реагентов. ДЧ, ДС, а также
прогностическое значение положительного результата (ПЗПР) и прогностическое значение отрицательного результата (ПЗОР) 2 изучаемых тестов представлены в табл. 2.
R =0,2524 Как показали полученные результаты,
ЛООС
р^и.изло распространенность Ureaplasma spp. со-
ставила 46,4% (102 из 220), M. hominis — 11,4% (25 из 220).
Второй задачей исследования была оценка количественных результатов в тестах "Флороценоз-Микоплазмы", "Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест" (рис. 1). Получена достоверная корреляция количественных результатов в ГЭ/мл и ЦОЕ/мл (R2 = 0,8, p < 00001, уклон 1,046±007440) для Ureaplasma spp. Оценить корреляцию результатов для M. hominis не представлялось возможным, так как в большинстве положительных образцов по данным "Микоплазма Микротест" получено значение 106 ЦОЕ/мл (максимально возможная величина при рутинном исследовании), в то же время в тесте "Флороценоз-Микоплазмы" получены значения, превышающие 106 ГЭ/мл, что выходило за пределы диапазона измерения "Микоплазма Микротест" и не позволило провести анализ корреляции получаемых значений. Оценивали также воспроизводимость количественных результатов. С этой целью 15 образцов, в которых обнаружены Ureaplasma spp., протестированы в трех повторах с использованием "Флороце-ноз-Микоплазмы" и "Уреаплазма Микротест". Количественные результаты представлены на рис. 2. При использовании "Уреаплазма Микротест" часто получаемые количественные значения варьировали в пределах одного порядка (8 из 15 образцов), более того, в 2 образцах из 15 получена разница в 2 порядка. Коэффициент вариации составил 0,028 для "Флоро-ценоз-Микоплазмы", 0,19 для "Уреаплазма Микротест".
Третья задача исследования заключалась в определении коэффициента пересчета между результатами в ЦОЕ/ мл и ГЭ/мл. Для этого были получены чистые культуры Ureaplasma spp. и M. hominis в логарифмической фазе роста. Готовили серии 10-кратных разведений до 10-10 (стандартно при использовании наборов "Уреаплазма Микротест" и "Ми-коплазма Микротест" делают 6 разведений, в данном случае диапазон был увеличен для точного определения концентрации). Для M. hominis результаты "Микоплазма Микротест" и "Флороценоз-Микоплазмы" практически совпадали (например, 1,3 • 108 ГЭ/мл и 108 ЦОЕ/мл; 1,4 • 107 ГЭ/мл и 107 ЦОЕ/мл); для Ureaplasma spp. результаты "Флороценоз-Ми-коплазмы" превосходили результаты Уреаплазма Микротест"
оГ ^ Q.O
II
□ а
□ □
□ Ö
□ Ö
О 1
-1—г-
8 9 Образец
10
-О—О—г" 12 13 14
-1-1
15 16
Рис. 2. Воспроизводимость количественных результатов, полученных при использовании "Флороценоз-Микоплазмы" (в ГЭ/мл) и "Уреаплазма Микротест" (в ЦОЕ/мл) (15 образцов, положительных на Ureaplasma). Набор "Флороценоз-Микоплазмы" позволяет получить близкие значения при повторном тестировании; значения, полученные при использовании набора "Уреаплазма Микротест", могут отличаться на 1—2 порядка.
в среднем в 10 раз (например, 1,1 • 106 ГЭ/мл и 105 ЦОЕ/мл; 9,76 • 104 ГЭ/мл и 104 ЦОЕ/мл). Коэффициенты пересчета из ЦОЕ/мл в ГЭ/мл составили 1 для M. hominis (1 ЦОЕ/мл = 1 ГЭ/мл) и 10 для Ureaplasma spp. (10 ГЭ/мл = 10 ЦОЕ/мл).
ГМ рассматриваются как условно-патогенные микроорганизмы и могут быть обнаружены в репродуктивном тракте здоровых женщин [19]. В некоторых условиях они могут приводить к ряду патологических процессов. Наиболее неблагоприятными последствиями колонизации ГМ слизистой оболочки влагалища и шейки матки являются преждевременные роды, хориоамнионит, эндометрит [2, 16], которые могут развиваться на фоне активного размножения этих микроорганизмов. При выборе оптимального метода выявления ГМ важно учитывать следующие аспекты.
1. Независимо от вида выявляемого микроорганизма применяемый метод диагностики должен иметь максимально высокие показатели ДЧ и ДС.
2. Видовая идентификация уреаплазм, по-видимому, важна, поскольку имеются данные, свидетельствующие, что U. urealyticum обладают большим патогенным потенциалом в сравнении c U. parvum [19]. Несмотря на большую распространенность U. parvum, именно U. urealyticum в большей степени ассоциируется с бесплодием, выкидышами и ВЗОМТ.
3. Чем выше концентрация микоплазм в вагинальных образцах, тем более вероятно развитие осложнений. Иными словами, нет единой "границы принятия решения" о необходимости назначения терапии ГМ [2]. По другим данным, границей является концентрация 105 ЦОЕ/мл, однако она получена только для определения тактики ведения пациенток с послеродовым эндометритом [16]. Точная количественная оценка U. parvum, U. urealyticum и M. hominis в биоматериале является важным звеном в выборе тактики ведения пациенток.
Рассмотрим изучаемые наборы в соответствии с обозначенными требованиями к идеальному методу выявления ГМ.
Диагностические характеристики наборов. Лабораторные тесты должны иметь аналитические и диагностические характеристики, соответствующие особенностям рассматриваемых инфекций. В частности, принципиальное значение имеют ДЧ, ДС, ПЗПР, ПЗОР.
В данном исследовании проводили сравнение 4 наборов реагентов, предназначенных для выявления и количественной/полуколичественной оценки U. parvum, U. urealyticum и M. hominis: "Mycoplasma Duo", "Уреаплазма Микротест", "Микоплазма Микротест" и "Флороценоз-Микоплазмы". Первые 3 набора из перечисленных ("Mycoplasma Duo", "Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест") предназначены для бактериологического исследования. Рост бактерий U. parvum, U. urealyticum, M. hominis сопровождается утилизацией мочевины (U. parvum, U. urealyticum) или аргинина (M. hominis), накоплением в среде аммиака, увеличением значения рН среды и как следствие изменением цвета индикатора среды.
Совпадение результатов 3 тестов составило 95% для Ureaplasma spp. и 97,3% для M. hominis, что превышает значения, полученные в предыдущих исследованиях (88,1— 93,9%) [20, 21].
Хотя бактериологическое исследование часто считается "золотым стандартом", к настоящему времени накоплен ряд данных, свидетельствующих о большей аналитической чувствительности ПЦР. По этой причине дополнительные положительные результаты по данным ПЦР являются вероятнее всего не ложноположительными, а истинно положительными в случае низкой концентрации микроорганизмов [19, 21—24]. Такая разница в чувствительности затрудняет оценку новых высокочувствительных методов, однако введение "расширенного золотого стандарта" (признание истинно положительным результата в случае получения не менее 2 положительных результатов при использовании 3 методов исследования) может помочь в решении данной проблемы, что также продемонстрировано в данной работе. Истинно-
положительными признаны результаты, воспроизводящиеся в 100% случаев в 3 параллельных исследованиях.
При оценке дискордантных результатов получены следующие варианты: положительный результат по данным "Фло-роценоз-Микоплазмы" и "Уреаплазма Микротест", "Микоплазма Микротест" (демонстрирует более высокую чувствительность этих двух методов); положительный результат только в тесте "Флороценоз-Микоплазмы" (как сказано выше, ПЦР — наиболее чувствительный метод, поэтому получение таких результатов закономерно); положительный результат по данным "Mycoplasma Duo", "Микоплазма Микротест" при отрицательном результате в "Флороценоз-Микоплазмы" (всего 1 образец, для которого получен положительный результат в "Флороценоз-Микоплазмы" при перестановке); положительный результат только по данным "Mycoplasma Duo". Все образцы, положительные только по данным "Mycoplasma Duo", характеризовались нетипичным изменением окраски среды, что может трактоваться как бактериальный зарост. В рутинной практике в такой ситуации будет дан ложноположитель-ный результат по формальным признакам. Получение лож-ноположительных результатов возможно при бактериологическом исследовании [25].
Оценены диагностические характеристики трех изучаемых наборов реагентов. ПЗПР тестов "Флороценоз-Мико-плазмы", "Mycoplasma Duo" и "Уреаплазма (Микоплазма) Микротест" составило 97,1, 96,1 и 100% для Ureaplasma spp., 96, 88,9 и 100% для M. hominis соответственно; ПЗОР — 100, 96,6 и 98,3% для Ureaplasma spp., 99,5, 99,5 и 995% для M. hominis соответственно. Таким образом, для всех изучаемых наборов были получены высокие значения, однако набор "Mycoplasma Duo", считающийся референсным во многих работах, в нашем исследовании дал наиболее низкие значения ПЗПР и ПЗОР.
Видовая идентификация уреаплазм. Только набор реагентов "Флороценоз-Микоплазмы" дает возможность дифференцировать бактерии рода Ureaplasma до вида, в то время как микробиологические тесты (как "Mycoplasma Duo", так и "Уреаплазма Микротест") позволяют получить лишь результат "обнаружены Ureaplasma spp.".
Определение концентрации ГМ в полученном материале. Набор реагентов "Mycoplasma Duo" даст возможность проводить только полуколичественный анализ (концентрация микроорганизмов в образце > 104 или < 103 ЦОЕ/мл), наборы "Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест" — получать количественные значения в диапазоне 102—106 ЦОЕ/мл. При использовании набора "Флороценоз-Микоплазмы" возможно получение любого значения концентрации в широком диапазоне (103—107 ГЭ/мл). Отдельно стоит обратить внимание на то, что количественные значения, получаемые в тесте "Флороценоз-Микоплазмы", выражают в ГЭ/мл. При оценке количественных результатов "Mycoplasma Duo" оказывается самой уязвимой системой, так как позволяет определить концентрацию лишь в двух диапазонах, а при наличии ГМ риск развития осложнений увеличивается при повышении концентрации. Рассмотрение лишь двух диапазонов концентрации не может дать полной картины для клинициста. Этот недостаток делает невозможным использование набора "Mycoplasma Duo" в дальнейших исследованиях по изучению роли ГМ в развитии патологии органов репродукции.
Полноценный количественный анализ возможен при применении наборов "Флороценоз-Микоплазмы", "Уреаплазма Микротест", "Микоплазма Микротест". Оценку корреляции количественных показателей можно провести только для двух наборов. В результате сравнения количественных параметров показана достоверная корреляция. Получить 100% корреляцию (R2 = 1) при сравнении данных тестов заведомо невозможно по двум причинам: 1) результаты тестов "Уреа-плазма Микротест" и "Микоплазма Микротест" являются дискретными (выдаются только целые значения: 102 ЦОЕ/мл, 103 ЦОЕ/мл и т. д.), в то время как результаты применения метода "Флороценоз-Микоплазмы" непрерывны (можно по-
лучить любое нецелое значение); 2) количественные значения концентраций микроорганизмов в "Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест" могут иметь погрешность в 1 lg, что существенно влияет на корреляцию результатов.
Одной из задач данного исследования было определение коэффициента пересчета из привычных для клиницистов единиц ЦОЕ/мл в ГЭ/мл, используемых в наборах на основе ПЦР в реальном времени. Коэффициент составил 1 для M. hominis (количественные данные совпадают) и 10 для Ureaplasma spp. (ГЭ/мл превышают ЦОЕ/мл в 10 раз). Несмотря на отсутствие данных, подтверждающих наличие единой границы для определения тактики лечения пациенток с ГМ, коэффициенты пересчета помогут клиницистам ориентироваться в получаемых данных при переходе с одного метода диагностики на другой.
Три набора реагентов, которые оценивали в данном исследовании, имеют следующие особенности:
"Mycoplasma Duo" — набор реагентов, давно и широко используемый во многих странах. Он имеет самые низкие показатели ДЧ и ДС из оцененных нами наборов, а также не позволяет проводить полноценную количественную оценку. При использовании данного набора возможно получение ложноположительных результатов вследствие роста сопутствующей бактериальной флоры. При бактериальном заро-сте изменение цвета среды отличается от "классического", однако эта разница невелика; именно по этой причине при использовании "Mycoplasma Duo" в клинико-диагностических лабораториях процент ложноположительных результатов может быть достаточно высоким. "Mycoplasma Duo" позволяет получить только полуколичественный результат (> 104 или < 103 ЦОЕ/мл). Такой подход не дает клиницисту исчерпывающей информации о количественном содержании микоплазм в биоматериале.
"Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест" — отечественные наборы реагентов, которые в нашем исследовании дали более высокие значения ДЧ и ДС. "Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест" позволяют проводить количественную оценку ГМ в достаточно широком диапазоне. По этим характеристикам "Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест" превосходят "Mycoplasma Duo". При выборе реагентов для бактериологического исследования предпочтение следует отдавать отечественным наборам для выявления и количественной оценки урогенитальных микоплазм. В ходе проведенной работы выявлены некоторые недостатки наборов "Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест": достаточно высокий коэффициент вариации количественных результатов (разброс в 1—2 порядка при повторных исследованиях), а также невозможность видовой идентификации уре-аплазм (как и в наборе "Mycoplasma Duo").
Оба недостатка тестов "Уреаплазма Микротест" и "Микоплазма Микротест" устранены в наборе реагентов "Флороце-ноз-Микоплазмы". Этот набор позволяет дифференцировать бактерии рода Ureaplasma до вида, в то время как микробиологические тесты дают результат "Ureaplasma spp." вне зависимости от вида уреаплазм. Из трех изучаемых тестов "Флороценоз-Микоплазмы" дает самый широкий линейный диапазон концентраций; кроме того, он не дискретен. К его преимуществам можно отнести высокую скорость получения результата (3 ч в сравнении с 2—3 сут для "Mycoplasma Duo" и "Уреаплазма (Микоплазма)-Микротест"), возможность работы с универсальным биологическим материалом, который предназначается для исследования на весь спектр инфекций органов репродукции, высокий уровень стандартизации и автоматизации процесса получения материала, позволяющий свести к минимуму влияние субъективных факторов на результат. К недостаткам метода относятся необходимость использования специального оборудования, а также специальной подготовки персонала. Данные недостатки теряют актуальность в связи с широким внедрением тестов на основе ПЦР в клиническую практику, что означает наличие оборудования и обученного персонала во многих диагностических лабораториях.
Выводы
1. При проведении бактериологического исследования для определения ГМ предпочтение следует отдавать наборам "Микоплазма Микротест" и "Уреаплазма Микротест".
2. Продемонстрированы высокие показатели ДЧ и ДС набора реагентов "Флороценоз-Микоплазмы", а также высокая воспроизводимость количественных результатов. Данный набор позволяет проводить видовую идентификацию мико-плазм, а также количественный анализ в широком линейном диапазоне.
ЛИТЕРАТУРА
(пп. 1—4, 6 — 16, 18 — 25 см. в REFERENCES)
5. Савичева А.М., Прилепская В.Н., Соколовский Е.В., Кисина В.И., Гущин А.Е., Забиров К.И. Роль микоплазм в урогениталь-ной патологии женщин и их половых партнеров. Актуальные проблемы здравоохранения. 2008; 57: 11—22. 17. Безруков В.М., Шипулин Г.А. "Уреаплазма микротест" и "Микоплазма микротест" — новые микротест-системы для диагностики урогенитальных микоплазмозов. В кн.: Покровский В.И., ред. Сборник трудов V Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных болезней". М.; 2004; т. 1: 10—2.
REFERENCES
1. Kramer D.G., Brown S.T. Sexually transmitted diseases and infertility. Int. J. Gynecol. Obstet. 1984. 22: 19—27.
2. Abele-Horn M., Scholz M., Wolff C., Kolben M. High-density vaginal Ureaplasma urealyticum colonization as a risk factor for chorio-amnionitis and preterm delivery. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2000; 79 (11): 973—8.
3. Taylor-Robinson D. Infections due to species of Mycoplasma and Ureaplasma: an update. Clin. Infect. Dis. 1996; 23: 671—84.
4. Stacey C.M., Munday P.E., Taylor-Robinson D. A longitudinal study of pelvic inflammatory disease. Br. J. Obstet. Gynaecol. 1992; 99: 994—9.
5. Savitcheva A.M., Prilepskaya V.N., Sokolovskiy Y.V., Kisina V.I., Guschin A.E., Zabirov K.I. Role of mycoplasmas in genital pathology in women and their partners. Arktual'nye problemy zdra-vookhraneniya. 2008; 57: 11—22.
6. Akonso-Vega C., Wauterus N., Vermeyken D. et al. A fatal case of Mycoplasma hominis meningoencefalitis in a full-term newborn. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 286—7.
7. Zheng X., Olson D., Tully J. et al. Isolation of Mycoplasma hominis from brain abscess. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 992—4.
8. Lyon G., Alspaugh F., Meredith F. et al. Mycoplasma hominis pneumonia complicating bilateral lung transplantation: case report and review of literature. Chest. 1997; 112: 1428—1.
9. Mattila P., Carlson P., Sevonen A. et al. Life-threatening Mycoplasma hominis mediastenitis. Clin. Infect. Dis. 1999; 29: 1529—37.
10. Farraj R.S., McCully R.B., Oh J.K., Smith T.F. Mycoplasma-associ-ated pericarditis. Mayo Clin. Proc. 1997; 72 (1): 33—6.
11. Blasco M., Torres L., Marco M. et al. Prostetic valve endocarditis caused by Mycoplasma hominis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2000; 19: 638—40.
12. Mechai F., Le Moal G., Duchene S., Burucoa C., Godet C., Freslon M. Mycoplasma hominis osteitis in an immunocompetent man. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2006; 25 (11): 715—7.
13. Luttrell L., Kany S., Corey G. et al. Mycoplasma hominis septic arthritis: two case reports and review. Clin. Infect. Dis. 1994; 19: 1067—70.
14. Marini H., Merle V., Frebourg N. et al. Mycoplasma hominis wound infection after a vascular allograft. J. Infect. 2008; 57 (3): 272—4.
15. Unemo M., ed. Laboratory diagnosis of sexually transmitted infections. Including human immunodeficiency virus. WHO; 2013.
16. Chaim W., Horowitz S., David J.B., Ingel F., Evinson B., Mazor M. Ureaplasma urealyticum in the development of postpartum endo-metritis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2003; 109: 145—8.
17. Bezrukov V.M., Shipulin G.A. "Ureaplasma-microtest" and "My-coplasma-microtest" — new microtest-kits for genital mycoploas-moses. Genodiagnostika infektsionnyh zabolevaniy. Abstract book. 2004; 1: 10—2.
18. Shipitsyna E., Zolotoverkhaya E., Agne-Stadling I., Krysanova A., Savicheva A., Sokolovsky E. et al. First evaluation of six nucleic acid amplification tests widely used in the diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia. J. Eur. Acad. Dermatol. Venerol. 2009; 23: 268—76. doi: 10.1111/j.1468-3083.2008.03038.x
микробиология
19. Waites K.B., Katz В., Schelonka R.L. Mycoplasmas and ureaplasmas as neonathat pathogens. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18 (4): 757—89. doi: 10.1128/CMR.18.4.757-789.2005
20. Vancutsem E., Soetens O., Breugelmans M., Foulon W., Naessens A. Modified real-time PCR for detecting, differentiating, and quantifying Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum. J. Mol. Di-agn. 2011; 13 (2): 206—12. doi: 10.1016/j.jmoldx.2010.10.007.
21. Luki N., Lebel P., Boucher M., Doray В., Turgeon J., Brousseau R. Comparison of polymerase chain reaction assay with culture for detection of genital mycoplasmas in perinatal infections. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998; 17 (4): 255—63.
22. Abele-Horn M., Wolff C., Dressel P., Zimmermann A., Vahlensieck W., Pfaff F., Ruckdeschel G. Polymerase chain reaction versus culture for detection of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in the urogenital tract of adults and the respiratory tract of newborns. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15: 595—8.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
23. Blanchard A., Hentschel J., Duffy L., Baldus K., Cassell G.H. Detection of Ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction in the urogenital tract of adults, in amniotic fluid, and in the respiratory tract of newborns. Clin. Infect. Dis. 1993; 17 (Suppl. 1): S148—53.
24. Yoon B.H., Romero R., Lim J.H., Shim S.S., Hong J.S., Shim J.Y., Jun J.K. The clinical significance of detecting Ureaplasma urealyticum by the polymerase chain reaction in the amniotic fluid of patients with preterm labor. Am. J. Obstet. Gynecol. 2003; 189: 919—24.
25. Cheah F.C., Anderson T.P., Darlow B.A., Murdoch D.R. Comparison of the Mycoplasma Duo Test with PCR for Detection of Ureaplasma Species in Endotracheal Aspirates from Premature Infants. J. Clin. Microbiol. 2005; 43 (1): 509—10. doi: 10.1128/JCM.43.1.509— 510.2005
Поступила 10.10.13 Received 10.10.13
УДК 616.98:578.825.11]-078
Ганова Л.А.1, Ковтонюк Г.В.2, Коршун Л.Н.2, Киселева Е.К.2, Терещенко М.И.2, Вудмаска М.И.2, Мойса Л.Н.2, Шевчук В.А.2, Спивак Н.Я.1
ЛИЗАТНЫЕ И РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИГЕНЫ В ELIsA ТЕСТ-СИСТЕМАХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА
1Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, 03143, Киев; 2ЧАО НПК "Диапроф Мед', 04123, Киев, Украина
Исследованы лизатные и рекомбинантные антигены различного производства в составе ELISA-тест-системы для определенияIgG KHerpexSimplex Virus 1-го и 2-го типов (HSV1 иHSV2). Для тестирования использованы панели сывороток PTH201 ("BBI Inc."), образцы которой содержат антитела к HSV1 и HSV2 в смешанных титрах, и 69 сывороток доноров (17 образцов имеют IgG к HSV1, 23 — к HSV2 и 29 не содержат антител к HSV. Диагностическая способность смеси рекомбинантных антигенов gG1 HSV1 и gG2 HSV2 (ЧАО НПК "Диапроф Мед") была сопоставима с таковой лизатного антигена Herpex Simplex Virus 1 & 2 (Membrane) EIE Antigen ("Virion Ltd."). В тест-системах для дифференцирования IgG к HSV1 и HSV2 рекомбинантный антиген gG1 HSV1 оказался сопоставимым с коммерческим аналогом Herpex Simplex Vi-rus-1 gG1M ("Viral Therapeutics Inc."). Вместе с тем способность выявлять IgG к HSV2 у рекомбинантного белка gG2 HSV2 существенно выше, чем у его аналога Herpex Simplex Virus-2 gG2с ("Viral Therapeutics Inc.").
Ключевые слова: Herpes simplex virus; ELISA-тест-системы; лизатные и рекомбинантные антигены.
L.A. Ganova1, G.V Kovtonyuk2, L.N. Korshun2, E.K. Kiseleva2, M.I. Tereschenko2, M.I. Vudmaska2, L.N. Moiysa2, V.A. Shevtchuk2, N.Ya. Spivak1
THE LYSATE AND RECOMBINANT ANTIGENS IN ELISA-TEST-SYSTEMS FOR DIAGNOSTIC OF HERPES SIMPLEX
1The D.K. Zabolotniy institute of microbiology and virology of the National academy of sciences of Ukraine, 03143 Kiev, Ukraine; 2The research-and-production complex "DiaprofMed'; 04123 Kiev, Ukraine
The lysate and recombinant antigens of various production included in formula ofELISA-test-systems were analyzed. The ELISA-test-systems are used for detection of IgG to Herpes simplex virus type I and II. For testing the panel of serums PTH 201 (BBI Inc.) were used. The samples of this panel contain antibodies to Herpes .simplex virus type I and II in mixed titers. The 69 serums of donors were used too (17 samples had IgG to Herpes simplex virus type I, 23 samples to Herpes simplex virus type II and 29 samples had no antibodies to Herpes simplex virus). The diagnostic capacity of mixture of recombinant antigens gG1 Herpes simplex virus type I andgG2 Herpes simplex virus type II (The research-and-production complex "DiaprofMed") was comparable with mixture of lysate antigen Herpes simplex virus type I and II (Membrane) EIE Antigen ("Virion Ltd."). In the test-systems for differentiation of IgG to Herpes simplex virus type I the recombinant antigen gG1 Herpes simplex virus type I proved to be comparable with commercial analogue Herpes simplex virus-1 gG1M ("Viral Therapeutics Inc."). At the same time, capacity to detect IgG to Herpes simplex virus type II in recombinant protein gG2 Herpes simplex virus type II is significantly higher than in its analogue Herpes simplex virus-2 gG2c ("Viral Therapeutics Inc.").
Keywords: Herpes simplex virus; ELISA-test-systems; lysate and recombinant antigen.
Возбудителем простого герпеса является Herpes simplex virus (HSV), 2 серотипа которого — HSV1 и HSV2 — широко распространены во всем мире. По данным ВОЗ, в индустриально развитых странах около 90% взрослого населе-
Для корреспонденции:
Ганова Лариса Александровна, зав. лаб. иммунохимии Адрес: 03164, Киев, ул. Булаховского, 5/58 E-mail: [email protected]
ния инфицировано HSV1, 20% — HSV2 и 30% — обоими серотипами [1, 2]. Первичное заболевание приводит к пожизненной персистенции вируса в организме, и возможна его реактивации. Преобладание хронических и бессимптомных форм заболевания, а также возможность атипичных проявлений осложняют диагностику простого герпеса по внешним симптомам [3]. Одной из проблем является дифференцирование HSV1 от HSV2, которое не всегда проводится в клиниках. Оно необходимо для прогноза течения заболевания и возможных осложнений, поскольку частота рецидивов,
