CC BY
75
Сравнение поведенческих и нейрорецепторных эффектов пантогама и бемитила при одно- и многократном введении мышам C57BL/6 и BALB/c
Кондрахин Е.А.1, Салимое Р.М.1, Незнамов Г.Г.2, Ковалёв Г.И.1
1 — Лаборатория радиоизотопных методов исследований
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», г. Москва
2 — Лаборатория клинической психофармакологии
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», г. Москва
Резюме. Исследовано воздействие режимов однократного и многократного введения пантогама (пантокальцина) и бемитила (метапрота) на динамику развития специфического ноотропного и неспецифического анксиолитического поведенческих эффектов препаратов и их возможную взаимосвязь с NMDA- и бензодиазепиновыми рецепторами в мозге инбредных мышей С57BL/6 и BALB/c. Линия BALB/c характеризуется сниженными по сравнению с мышами C57BL/6 исходными уровнями когнитивного и эмоционального статусов, NMDA- и бензодиазепиновых рецепторов в гиппокампах и префронтальной коре, в связи с чем была использована в качестве неинвазивной модели дефицитарных проявлений указанных функций.
Под воздействием острого, 7- и 14-кратного введения пантогама (200 мг/кг/день, в/б) у мышей BALB/c наблюдалось медленное увеличение NMDA-рецепторов и медленное нарастание специфического эффекта, характерного для ноотропов. Анк-сиолитический эффект препарата у мышей BALB/c и C57Bl/6 обнаружен не был, однако, у линии C57Bl/6 выявлено увеличение плотности бензодиазепиновых рецепторов в течение первой недели, а к концу эксперимента снижение плотности ниже контроля наблюдалось у обеих линий.
Под воздействием острого, 7- и 14-кратного введения бемитила (25 мг/кг/день, в/б) у мышей BALB/c на раннем этапе эксперимента наблюдалось быстрое увеличение NMDA-рецепторов и эффективности исследовательского поведения, исчезающее в последующие дни. Наблюдаемая быстро реализуемая динамика вероятнее всего присуща не ноотропному, а психостимулирующему компоненту фармакологического эффекта препарата. Анксиолитический эффект развивался в течение первой недели неизбирательно для обеих линий, однако, снижение бензодиазепиновой рецепции обнаруживалось на 14 день у обеих линий.
Ключевые слова: пантогам, бемитил (метапрот), NMDA-рецептор, бензодиазепиновый рецептор (БДЗ-рецептор), крестообразный лабиринт, радиолигандное связывание, исследовательское поведение, тревожность, C57Bl/6, BALB/c
Comparison of behavioral and neuro-receptor effects of pantogam and bemitil with single and multiple injections in mice of C57BL/6 and BALB/c
Kondrakhin E.A.1, Salimov R.M.1, Neznamov G.G.2, Kovalev G.I.1 1 — Laboratory of Radioisotope Research FGBNU «Pharmacology Research Institute named after V.V. Zakusov», Moscow 2 — Laboratory of Clinical Psychopharmacology FGBNU «Institute of Pharmacology named V.V. Zakusov», Moscow
Abstract. The effect of single and multiple modes of administration pantogam (pantokaltsina) and bemitil (metaprot) on the dynamics of nootropic specific and nonspecific behavioral effects of anxiolytic drugs and their possible association with NMDA- and benzodiazepine receptors in the brain of inbred C57BL/6 and BALB/c. The line BALB/c is characterized by decreased compared to mice C57BL/6 baseline levels of cognitive and emotional status, NMDA- and benzodiazepine receptors in the hippocampus and the prefrontal cortex, and therefore has been used as a non-invasive model of deficit manifestations of these functions.
Under the influence of acute, 7- and 14-fold administration pantogam (200 mg/kg/day intraperitoneally) in BALB/c mice was observed slow increase in NMDA-receptors and slow rise specific effect characteristic nootropics. Anxiolytic effect of the drug in mice BALB/c and C57Bl/6 was not detected, however, the line C57Bl/6 showed an increase in the density of benzodiazepine receptor in the first week and by the end of the experiment density reduction below the control was observed in both lines.
Under the influence of acute, 7- and 14-fold bemitil administration (25 mg/kg/day intraperitoneally) in BALB / c mice at an early stage of the experiment there was a rapid increase in NMDA-receptors and efficiency of exploratory behavior, disappearing in the following days. The observed dynamics quickly realized most likely is not unique nootropic and psychoactive component of the pharmacological effect of the drug. Anxiolytic effect developed during the first week indiscriminately for both lines, however, decrease benzodiazepine reception detected at day 14 in both lines.
Keywords: pantogam, bemitil (metaprot), NMDA-receptor-benzodiazepine receptor (BDZ-receptor), plus maze, radioligand binding, exploratory behavior, anxiety, C57Bl/6, BALB/c
Автор, ответственный за переписку:
Кондрахин Евгений Анатольевич — научный сотрудник лаборатории радиоизотопных методов исследований ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; адрес: г. Москва, 125315, ул. Балтийская, 8; тел. +7 (495) 601-20-51
44
Фшшкишш И фармащшмш
Введение
Фармакологические эффекты психотропных средств имеют различные динамические характеристики при их применении в клинической практике. К медленно развивающимся эффектам препаратов относятся но-отропный, антидепрессивный и антипсихотический. Быстро проявляющимися эффектами являются психостимулирующий, анксиолитический и седативный [1, 2]. В 1960-1970 гг. критерии принадлежности к группе ноотропов ограничивались способностью к активации процессов обучения, к улучшению памяти и умственной деятельности, а также к повышению устойчивости мозга к агрессивным воздействиям [3]. Позже рамки канонических психофармакологических свойств пирацетама были расширены за счёт так называемых «неспецифических» компонентов, в частности, анксиолитического и стимулирующего, что нашло подтверждение и в экспериментальной фармакологии [4]. Более того, с привлечением инбредных мышей С57ВЦ/6 и BALB/c было обнаружено, что характер и темпы развития «специфического» (ноотропного) и «неспецифического» (анкси-олитического) составляющих психофармакологических эффектов пирацетама зависят и от базового поведенческого и нейрорецепторного статуса животных [5]. Также установлено, что указанные закономерности характерны для реализации действия и других препаратов с ноотропными свойствами — фенотропила, нооглютила, семакса, ацефена [6], ноопепта [7].
Поэтому с целью углубления понимания характера и механизмов, описанных выше, закономерностей в настоящей работе была предпринята попытка изучить в сравнительном плане психофармакологические и ней-рорецепторные эффекты отечественных препаратов — пантогама (ноотропа, обладающего мягким седатив-ным компонентом действия [8]) и бемитила, профиль фармакологического действия которого включает психостимулирующую [9] и ноотропную [10] активность.
Методология
Экспериментальное исследование особенностей реализации действия и нейрорецепторных эффектов пантогама и бемитила проведены на мышах инбредных линий ВАЬВ/с и С57ВЦ/6.
1. Исследование эффективности исследовательского поведения по методике крестообразного лабиринта.
Исследовательское поведение и тревожность оценивали в крестообразном лабиринте [11]. Исследования проводили на самцах мышей линий ВАЬВ/с (п=45) и С57ВЦ/6 (п=43), полученных из питомника «Столбовая», массой 23-25 г, которых содержали в виварии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в стандартных условиях при свободном доступе к воде и корму.
Препараты вводили внутрибрюшинно, один раз в сутки, в дозах 200 мг/кг (пантогам) и 25 мг/кг (беми-
тил). Каждую линию мышей разделяли на контрольную (физиологический раствор) и опытную группу. После 1-кратного, субхронического (в течение 7 суток) и хронического (14 суток) введения препарата мышей тестировали в крестообразном лабиринте. Подробное описание метода и интерпретации показателей представлены в предыдущих публикациях [12].
Для представления эффективности исследовательского поведения (ЭИП) был введён нормированный параметр, который является совокупностью двух главных параметров ЭИП в крестообразном лабиринте — показателей числа визитов в боковые отсеки во время первого патрулирования и общего числа патрулирований. Нормированный параметр является среднеарифметической суммой данных показателей, при этом вклад каждого из них равноценен. Формула расчёта нормированного параметра = ((100-(F_PtrN-4)*11,111) +PatrlN*33,33)/2 (где F_PtrN — длина первого цикла патрулирования и PatrlN — число циклов патрулирования). Тревожность оценивали по латентному периоду первого захода в боковой отсек лабиринта.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0.
После исследования в лабиринте в 1-й, 7-й и 14-й день введения препаратов мышей декапитировали, извлекали структуры головного мозга и замораживали в жидком азоте для последующего проведения радио-лигандного анализа с бензодиазепиновыми и NMDA-рецепторами. Результаты экспериментов ex vivo оценивали с помощью рассчитанных величин Kd, отражающей степень сродства рецептора к лиганду (нМ), и Bmax, представляющей количество мест связывания лиганда (фемтомоль/мг белка), соответственно.
2. Связывание с NMDA рецепторами. а) Выделение плазматических мембран гиппокампа проводили по методу [13]. Гиппокампы размельчали в гомогенизаторе «тефлон-стекло» в 10 объёмах буфера №1 (5mM HEPES, 4.5 mM Tris, 0.32 M Сахароза, рН 7.6). Гомогенат разбавляли 50 объёмами буфера №2 (5mM HEPES, 4.5 mM Tris, рН 7.6) и центрифугировали при 1000 g 10 минут на ультрацентрифуге Beckman L7-35. Супернатант сливали и повторно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Для увеличения выхода белка супернатант центрифугировали дважды. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объёмах буфера №2 и вновь центрифугировали при 8000 g 20 мин. Супернатант и верхний коричневый осадочный слой сливали и центрифугировали при 25000 g 20 мин. Осадок ресуспендировали в 50 объёмах буфера №3 (5mM HEPES, 4.5 mM Tris, 1 mM Na4EDTA, рН 7.6) и троекратно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объёмах буфера №2 и однократно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Конечный осадок сохраняли в 5 объёмах буфера №2 и замораживали в криопробирках в жидком азоте.
45
етш И Фармащшмш
В день анализа ткань размораживали, разбавляли 10 объёмов буфера №2, центрифугировали при 25000 g 20 мин. Осадок ресуспендировали в необходимом количестве буфера №2. Концентрация белка в образцах мембран составляла 2-3 мг/мл.
б) Радиолигандный анализ. В эксперименте использовали меченный тритием (+)МК-801 с удельной активностью 200 Кюри/ммоль, полученный методом твердофазного катализа в Отделе химии физиологически активных веществ Института молекулярной генетики РАН (рук. — академик Н.Ф. Мясоедов) [14]. Реакционная смесь (конечный объём 0,5 мл) содержала 200 мкл буфера №2, 50 мкл меченного лиганда (в диапазоне концентраций от 0.1 до 20 нМ) и 250 мкл суспензии мембран. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл немеченого (+)МК-801 (1дМ). Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman), предварительно смоченные 0,3% полиэтиленимином в течение 2 часов при 4°С. Каждую пробирку промывали один раз холодным буфером №2, затем фильтры промывали три раза тем же объёмом буфера. Фильтры просушивали на воздухе, переносили в сцинтилляционные флаконы, заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола.
3. Связывание с бензодиазепиновыми рецепторами.
а) Выделение плазматических мембран коры. Ранее замороженные образцы коры мозга гомогенизировали в 16 мл ледяного (0-4°C) 50 mM Tris-HCl буфера (рН 7,4) используя ручной гомогенизатор «тефлон-стекло». Полученную суспензию центрифугировали при 42 000 g в течение 25 мин в ультрацентрифуге Allegra 64k R («Beckman Coulter»). После центрифугирования супернатант сливали, осадок ресуспендировали повторной гомогенизацией в том же объёме буфера, затем вновь центрифугировали. Процедуру отмывки проводили трижды, полученный осадок ресуспендировали в 20 мл Tris-HCl буфера и использовали по 250 мкл в процедуре связывания [3Н]-Флунитразепама.
б) Радиолигандный анализ. Мембранную фракцию структур головного мозга инкубировали с 3Н-Флу-нитразепамом (удельная активность 81 Кюри/ ммоль, "NEN") в течение 30 мин при температуре 0-40C. Неспецифическое связывание определяли в присутствии избытка немеченого диазепама (20 мкМ). Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Процесс связывания останавливали путём добавления ледяного буфера и быстрой фильтрации через стекловолокнистые фильтры
типа GF/B (Whatman) с последующей двукратной промывкой ледяным буфером общим объёмом 8 мл. Фильтры высушивали в течение 12 часов при комнатной температуре, затем помещали в сцинтилля-ционную жидкость (реактив Брея) объёмом 5 мл и использовали для счёта радиоактивности.
Радиоактивность каждой пробы измеряли в течение 2 мин на жидкостно-сцинтилляционном счётчике Tri-Carb 2900TR ("PerkinElmer") с эффективностью счёта 45%. Неспецифическое связывание составляло не более 10% от общего.
Концентрацию белка измеряли по стандартной методике Лоури. Показатель количества мест связывания (В , фемтомоль/мг белка) и константу диссоциации лиганд-рецепторных комплексов (Ка, наномоль/л, нМ) рассчитывали с помощью программы GraphPad Prism 5.
Результаты
В предыдущих исследованиях, проведённых по аналогичному протоколу, было установлено, что между линиями мышей C57BL/6 и BALB/c наблюдаются значимые отличия по критерию ЭИП, по общему уровню тревожности, а также по плотности NMDA- и бензодиазепиновых рецепторов в мозге. Так, мыши BALB/c проявляли в условиях незнакомой обстановки в закрытом крестообразном лабиринте большую тревожность (+143%), менее выраженную эффективность исследовательского поведения (-13%), меньшую плотность NMDA-рецепторов в гиппокампе (-22%) и БДЗ-рецеп-торов в префронтальной коре (-17%) [15].
Результаты изучения влияния пантогама на ЭИП и тревожность мышей обеих линий после острого, субхронического и хронического введений представлены в табл. 1. Характерное для обеих линий животных поведение в группах плацебо сохраняется постоянным при всех режимах введения. Препарат оказал на линию BALB/c эффект увеличения ЭИП (64,2±6,1 баллов в контроле против 83,2+1,8 в опытной группе, р>0,05) лишь после 14-кратного введения.
Напротив, под влиянием бемитила увеличение показателя ЭИП в группе мышей BALB/с происходило уже после однократного введения препарата в дозе 25 мг/кг, тогда как в группе сравнения C57BL/6 исследовательское поведение в опытной группе не отличалось от поведения контрольных групп животных. При этом тревожность под влиянием бемитила (латентное время первого захода) немного снижалась после 7-кратного введения бемитила как у мышей BALB/с (на 2 с), так и у C57BL/6 (на 1,6 с).
Сопутствующие изменения показателей радиоли-гандного связывания (т.н. «кривые насыщения») на NMDA- и БДЗ-рецепторах приведены на рис. 1 и рис. 2, соответственно.
Результаты обработки по Скетчарду этих кривых насыщения для обоих рецепторов приведены в табл. 2 и 3.
15 \
46
1Фшаишш И Фармащшмш
Надо отметить, что величины К в мембранах структур мозга обеих линий мышей практически не различались при различных сроках введения препарата, что указывает на неизменяемость степени сродства мест связывания к лигандам при различных сроках воздействия препаратов.
Что касается плотности мест связывания В для
тах
[3Н]-МК-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа, то у мышей BALB/c эта величина увеличивалась для пан-тогама лишь к 14 дню эксперимента с 2036,8+88,0 фмоль/мг в контроле до 2593+73,1 фмоль/мг в опытной группе. В противоположность этому, бемитил был эффективен исключительно после острого воздействия, увеличивая величину В с 2271+35,4 фмоль/мг
в контрольной группе до 3098+157,1 фмоль/мг в опытной группе. Примечательно, что в мозге мышей линии С57ВЦ/6 изменений в плотности этих рецепторов не наблюдалось ни под влиянием пантогама, ни под воздействием бемитила (Табл.2, Рис.1).
Изучение изменений плотности БД З-рецепторов в префронтальной коре мозга показало, что у мышей линии BALB/c острое и субхроническое введения пантогама и бемитила не влияли на величину В
^ тах,
тогда как при хроническом введении препаратов относительно группы плацебо (3117+53,5 фмоль/мг) наблюдалось снижение Втах до 2340+46,4 фмоль/мг и 2108+58,8 фмоль/мг, соответственно (табл. 3, рис. 2).
Таблица 1
Влияние пантогама (200 мг/кг/день) и бемитила (25 мг/кг/день) при остром, 7- и 14-дневном введении на поведенческие характеристики у мышей линий BALB/C и C57BL/6 (m+S.E.M.)
Группы ЭИП Тревожность
Контроль Пантогам Бемитил Контроль Пантогам Бемитил
Balb/c Острое 65,4±4,1 66,7±4,1 75,8±4,1* 13,1±1,2 12,9±0,7 13,4±1,2
Balb/cсубхроническое 66,7±5,7 76,1±6,3 74,3±5,7 13,3±1,2 14,2±1,4 11,3±1,2*
Balb/c хроническое 64,2±6,1 83,2±1,8* 70,37±6,1 13,5±0,9 14,0±1,99 14,0±0,9
С57Black Острое 74,0±5,0 72,0±3,8 76,7±5,0 5,7±0,4 5,9±0,5 5,9±0,4
С57Black субхроническое 74,3±3,7 77,9±3,0 82,1±3,7 5,5±0,5 5,7±0,4 3,9±0,5*
С57Black хроническое 73,0±4,1 72,22±4,5 73,7±4,1 5,8±0,6 6,1±0,3 5,8±0,6
Примечание. *—достоверное отличие от контрольной группы по t-критерию Стьюдента при р<0,05
Таблица 2
Влияние пантогама (200 мг/кг/день) и бемитила (25 мг/кг/день) при остром, 7- и 14-дневном введении на характеристики рецепторного связывания [3H]-MK-801 ex vivo в мозге мышей BALB/c и C57BL/6 (m+S.E.M.)
Таблица 3
Влияние пантогама (200 мг/кг/день) и бемитила (25 мг/кг/день) при остром, 7- и 14-дневном введении на характеристики рецепторного связывания [3^-Флунитразепама ex vivo в мозге мышей BALB/c и C57BL/6 (m+S.E.M.)
Группы Параметр NMDA-рецепторы
Контроль Пантогам Бемитил
Balb/c Bmax 2271±35 2078±138 3098±157*
Острое Kd 12,07±0,36 13,88±1,66 11,86±1,14
Balb/c Bmax 2051±49 1871±75 1955±71
7дней Kd 10,26±0,60 8,74±0,9 9,09±0,84
Balb/c Bmax 2037±88 2593±73* 1824±78
14дней Kd 8,4±0,78 10,58±0,58 9,1±0,82
С57Black Bmax 2659±270 2526±113 2645±120
Острое Kd 8,9±1,06 11,1±0,96 10,17±0,92
С57Black Bmax 2724±44 2319±51 2589±60
7дней Kd 9,7±0,39 8,97±0,5 9,14±0,73
С57Black Bmax 2602±57 2767±64 2652±71
14дней Kd 8,34±0,39 7,63±0,39 9,23±0,51
Группы Параметр Бензодиазепиновые рецепторы
Контроль Пантогам Бемитил
Balb/c Острое Bmax 2915±25 2735±75 2949±66
Kd 1,87±0,05 1,96±0,19 1,89±0,15
Balb/c 7 дней Bmax 3015±44 3167±71,9 3259±66
Kd 2,02±0,1 1,83±0,15 2,22±0,15
Balb/c 14 дней Bmax 3117±54 2340±46* 2108±59*
Kd 1,57±0,1 1,89±0,13 2,02±0,19
С57Black Острое Bmax 3656±94 3789±61 3761±33
Kd 1,98±0,18 1,91±0,1 2,02±0,06
С57Black 7 дней Bmax 3603±27 4039±59* 3048±111*
Kd 2,1±0,05 2,5±0,24 2,56±0,3
С57Black 14дней Bmax 3613±103 3241±106* 2616±87*
Kd 1,89±0,15 1,99±0,18 1,96±0,18
Примечание *—достоверное отличие от контрольной группы по При- Примечание. * - достоверное отличие от контрольной группы по I-критерию Стьюдента прир<0.05 терию Стьюдента при р<0,05
нСсишоМиШ
ШИ1Ш1ИМ0И!И5И£ИМ1И[ИИ
Balb/c-A
■*■ KOHfTpOJb
Пантогам Бемитил
10
Концентрация [G-3H 1МК-801, нМ
2000-1
£ 1500-
= 1000-
к 500-
C57BL/6-A
■*■ Контроль Пантогам
10
Концентрация [G-3H 1МК-801, нМ
15
20
Balb/c- В
Контроль -■- Пантогам -*- Бемитил
10 20 30
Концентрация [G-3H]MK-801, нМ
40
2500л
2000-
"-1500-
5 1000-
500-
C57BL/6- В
Концентрация [G-3H1МК-801, нМ
Balb/c- С
C57BL/6- С
5 10 15
Концентрация [G-3H JMK-801, нМ
5 10 15
Концентрация [G-3H 1МК-801, нМ
Рис. 1. Влияние пантогама (200 мг/кг/день) и бемитила (25 мг/кг/день) при различной продолжительности введения острое (A), 7 дней (B), 14 дней (C) на связывание с NMDA-рецепторами в мозге мышей BALB/c и C57BL/6
N»1.2015!
48
1ФШШ1ШШ И Фшащшмш
ЗООО-i
Balb/c-A
L» 2000-
i.® с
в s
1000-
Контроля ♦ Пантогам Бемитил
3000-
У
® Д 2000-
» s 1«
1000-
C57BU6-A
■*• Контроль Пантогам Бемитил
4000-1
5 10
Концентрация [3Н]- Flunitrazepam [пМ]
Balb/c-B
3000-
£¡
с ® в х
\ гот-
1000-
Контроль -"- Пантогам Бемитал
5 10
Концентрация [ЭН]- Flunitrazepam [пМ]
4000л
га s я с 4> 3000-
О о- а
Í 1
в i ÍFÍ 2000-
■—' о х S 1-е- га со
л п
m о 1000-
C57BL/6- В
— Контроль ♦ Пантогам -*- Бемитил
5 10
Концентрация [ЭН]- Flunitrazepam [пМ]
3000л
Balb/c- С
200»
с® в s
и
S юоо
Контроль Пантогам -*- Бемитал
5 10
Концентрация [3Н]- Flunitrazepam [пМ]
4000-1
п s ю 3000-
в м
0 HS
1 g
в S ÍF i 2000-
" о ш s я а 1 п
£ и 1000-
С57ВЦ6- С
■*■ Контроль ♦ Пантогам -*- Бемитал
5 10
Концентрация [3Н]- Flunitrazepam [пМ]
5 10
Концентрация [3Н]- Flunitrazepam [пМ]
Рис. 2. Влияние пантогама (200 мг/кг/день) и бемитила (25 мг/кг/день) при различной продолжительности введения острое (А), 7 дней (В), 14 дней (С) на бензодиазепиновые рецепторы в мозге мышей BALB/c и C57BL/6
15 \
49
1Фшаишш И Фармащшмш
А
Дни введения
Б
Дни введения
Тревожность
Рис. 3. Динамика выраженности поведенческих и рецепторных характеристик мышей BALB/c (А) и C57BL/6 (Б) под влиянием пантогама (200 мг/кг/день)
А
Дни введения
Б
ЭИП
Тревожность
Дни введения
+ ЭИП
Тревожность
Рис. 4. Динамика выраженности поведенческих и рецепторных характеристик мышей BALB/c (А) и C57BL/6 (Б) под влиянием бемитила (25 мг/кг/день)
В группе мышей C57BL/6 плотность мест связывания [3Н]-флунитразепама после острого введения не изменилась по сравнению с контролем под действием обоих исследуемых препаратов. При субхроническом и хроническом введениях бемитил приводил к уменьшению Втах с 3602,5+27,2 фмоль/мг до 3047,5+111,0 фмоль/мг и с 3613+102,7 до 2616+86,7 фмоль/мг, соответственно. Под влиянием пантогама у мышей C57BL/6 наблюдалась разнонаправленная динамика: увеличение плотности мест связывания БДЗ-рецепторов с 3602,5+27,2 фмоль/мг до 4039+58,6 фмоль/мг при субхроническом введении и уменьшение мест связывания с 3613+102,7 фмоль/мг до 3241+106,4 фмоль/мг при хроническом введении (табл. 3, рис. 2).
Обсуждение
В соответствии с концепцией о составляющих фармакологических эффектов психотропных препаратов [16] у пирацетама обнаруживаются медленно развивающийся ноотропный («специфический») и быстро проявляющиеся «неспецифические» анксиолитиче-ский и психостимулирующий [4, 5, 17]. С помощью методов нейровизуализации рецепторов in vivo, в частности, позитронно-эмиссионной томографии, обнаружено снижение БДЗ-рецепторов в префронтальной коре мозга больных с проявлениями тревоги и паническими расстройствами [18]. Аналогичные данные
получены при модельной патологии эмоциональной и когнитивной сфер в экспериментах на животных, в которых показана связь поведенческих компонентов с БДЗ- и NMDA-рецепторами мозга мышей [5, 6, 15].
В продолжение изучения механизмов действия но-отропных препаратов была изучена динамика эффектов пантогама и бемитила. Пантогам (пантокальцин) — первый отечественный ноотроп, внедрённый в клиническую практику в 1977 году, мишенью первичного действия которого являются рецепторы у-аминомасля-ной кислоты (ГАМК). Кроме ноотропной активности, препарат обладает мягким седативным эффектом [8]. Бемитил (метапрот) отечественный актопротектор, положительно влияющий на условно-рефлекторное поведение в норме и при стрессорном воздействии в тесте УРПИ [10], а также антиастеническим (психостимулирующим) компонентом в клинике [9]. Влияние этого препарата на нейрорецепторы мозга ранее не изучалось.
В настоящей работе мыши BALB/c были использованы в качестве модели с повышенной тревожностью и с дефицитом исследовательского поведения в тесте открытого крестообразного лабиринта, а также меньшей плотностью NMDA-рецепторов в гиппокампе и БДЗ-рецепторов в префронтальной коре мозга в сравнении с инбредными мышами C57BL/6 [15]. Кроме того, в недавно опубликованной работе было показано, что исследовательское поведение мышей этих линий в лабиринте и уровень проявленной при этом тре-
15C
1QC
SC
14
14
15C
1CC
SC
14
14
50
ФДШОМШ И ФМЩШМШ
вожности существуют статистически независимо друг от друга, на основании чего было предположено, что и механизмы их регуляции могут различаться [19].
Сравнительная динамика влияния пантогама на поведение и рецепторы представлена на рис. 3. Обращает внимание, что выраженность ЭИП и величина Bmax для NMDA-рецепторов нарастают постепенно, достигая уровней статистической значимости к 14-му дню эксперимента. Аналогичная зависимость для ЭИП была характерна и для пирацетама [5], но плотность NMDA-рецепторов была выше уже после острого и 7-кратного введения пирацетама. Возможно, быстрое изменение плотности этих рецепторов в случае пирацетама объясняет наличие у него стимулирующего компонента действия, тогда как более поздний подъём Bmax лежит в основе ноотропного эффекта. Дополнительным свидетельством в пользу данного предположения могут служить полученные данные о динамике эффектов бемитила (рис. 4): на мышах BALB/c препарат способствовал росту плотности NMDA-рецепторов и ЭИП лишь после однократного введения, тогда как длительное воздействие оказалось малоэффективным.
Таким образом, динамика эффективности исследовательского поведения в крестообразном лабиринте и количества NMDA-рецепторов в гиппокампе отражают специфические «медленные» эффекты пантогама как ноотропного препарата. Напротив, быстрый и не-
продолжительный подъем этих показателей после введения бемитила демонстрирует наличие скорее психостимулирующего, чем ноотропного компонента его психофармакологического профиля.
Выводы
1.
2.
Одно-, семи- и четырнадцатикратное введение пан-тогама в ежедневной дозе 200 мг/кг (в/б) мышам BALB/c вызывает медленное увеличение плотности NMDA-рецепторов в гиппокампе и постепенное нарастание специфического ноотропного эффекта. У мышей C57BL/6 количество NMDA-рецепторов и ЭИП не изменялись.
Бемитил в ежедневной дозе 25 мг/кг (в/б) при тех же режимах введения увеличивает ЭИП и плотность NMDA-рецепторов у мышей BALB/c лишь в результате однократного введения, что можно отнести к психостимулирующему компоненту его действия. В данных условиях пантогам не воздействует на уровень тревожности мышей обеих линий, хотя плотность БДЗ-рецепторов снижалась к 14-му введению.
4. Неспецифичное локальное снижение тревожности в обеих линиях мышей к 7-му дню эксперимента не сопутствует поступательному уменьшению плотности БДЗ-рецепторов в коре мозга к 14-му дню наблюдения.
3.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8. 9.
Литература
I. Банщиков В.М., Березин Ф.Б. О механизме действия психотропных веществ (быстрый и медленный компонент психофармакологического эффекта). // Журнал невропатологии и психиатрии. 1966. №10. С. 1561 — 1565.
Незнамов Г.Г., Сбытов Ю.Г. Клинико-математический анализ быстрого и медленного компонентов действия психотропных препаратов у больных с невротическими и неврозоподобными расстройствами. // Пограничные нервно-психические расстройства. Ставрополь. 1989. С. 46—8. Середенин С.Б. Воронина Т.А. Ноотропные и нейропротективные средства. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2007. Т.70, №4. С. 44— 58. Незнамов Г.Г., Кошелев В.В., Воронина Т.А., Трофимов С.С. Экспериментальное и клиническое обоснование комплексного применения пирацетама и гидазепама при лечении психических расстройств у ликвидаторов катастрофы на чернобыльской АЭС. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2002. Т.65, №2. С. 12 — 16.
Ковалёв Г.И., Кондрахин Е.А., Салимов Р.М., Незнамов Г.Г. Действие пирацетама на поведение и рецепторы мозга мышей C57BL/6 и BALB/c — ноотроп-ный и анксиолитический эффекты. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2013. Т.76, №9. С. 3 — 10.
Кoвaлёв Г.И., Фиpcтoвa Ю.Ю. Ноотропные препараты: разные мишени — общий эффект. // Клиническая фармакология и терапия. 2010. С. 72—73. Ковалёв Г.И. Кондрахин Е.А., Салимов Р.М., Незнамов Г.Г. Динамика поведенческих и нейрорецепторных эффектов при остром и многократном введении ноопепта мышам С57BL/6 и BALB/c. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2014. Т.77, №12. С. 9—15.
Копелевич В.М. Пантогам и пантогам актив. Клиническое применение и фундаментальные исследования. Сборник научных статей. Москва. Триа-да-фарм, 2009. — 188 с.
Александровский ЮА. Пограничные психические расстройства. / Москва. Медицина, 2000. — 495 с.
10. Прагина Л.Л., Тушмалова Н.А., Иноземцев А.Н., Смирнов А.В. Влияние бемитила на условнорефлекторную память крыс в норме и при стрессорных воздействиях. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1999. Т.62, №24. С. 9 — 10.
II. Caлимoв P.H. Оценка упорядоченности пути в процессе исследовательского поведения у мышей. // Журнал ВНД. 1988. Т.38, №3. C. 569—571.
12. Салимов Р.М., Ковалев Г.И. Влияние лигандов никотиновых холинорецепторов и ноотропных веществ на спонтанное поведение обследования лабиринта у мышей. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2008. Т.71, №3. С. 3 — 5.
13. Zhou L.M., Gu Z.Q., Costa A.M., et al. (2S,4R)-4-methylglutamic acid (SYM 2081): a selective, high-affinity ligand for kainate receptors. // J.Pharmacol.Exp.Ther. 1997, Vol. 280, №1, P 422-427.
14. Золотарев Ю.А., Фирстова Ю.Ю, Абаимов Д.А и др. Равномерно меченные изотопами водорода лиганды глутаматного и дофаминового рецепторов. // Биоорганическая химия. 2009. Т.35, №3. С. 323-333.
15. Кoвaлёв Г.И., Кондрахин Е.А., Салимов Р.М. Поведенческие и нейрорецепторные различия мышей линий C57BL/6 и BALB/c. // Нeйpoхимия. 2013. Т.30, №2. C. 128-134.
16. Незнамов Г.Г., Сюняков С.А., Давыдова И.А., Телешова Е.С. «Быстрые» и «медленные» компоненты психотропного действия препаратов с ноотропными свойствами. // Журнал неврологии и психиатрии. 2000. Т.100, №6. С 33 — 37.
17. Незнамов Г.Г., Телешова Е.С. Результаты сравнительного изучения ноопепта и пирацетама при лечении больных с легкими когнитивными нарушениями при органических заболеваниях мозга сосудистого и травматического генеза. // Журнал неврологии и психиатрии. 2008. Т.108, №3. С 33-42.
18. Hasler G, Nugent A.C., et al. Altered cerebral gamma-aminobutyric acid type A-benzodiazepine receptor binding in panic disorder determined by [11C]flumazenil positron emission tomography. // Arch Gen Psychiatry. 2008, Vol. 65, №10, P 1166-1175.
19. Collingridge G.L., Volianskis A., Bannister N, et al. The NMDA receptor as a target for cognitive enhancement. // Neuropharmacology. 2013, Vol. 64, №1, P 13-26.
51
етш И Фармащшмш
