CC BY
160
УДК 577.1
В.В. Галиев
аспирант кафедры химии ФГБОУВПО «Новосибирский государственный
педагогический университет»
А.О. Цырульников
аспирант кафедры химии ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный
педагогический университет»
СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕТАГЕНОМНОЙ
ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ ПОЧВЫ
В данной статье проведен обзор и практическое сравнение различных методов извлечения метагеномной ДНК из почвенных микроорганизмов. Выбор метода извлечения ДНК является важным звеном в проведении научной работы с метагеномными образцами, так как именно от качества выделенной ДНК зависит вся дальнейшая исследовательская деятельность. В работе впервые были сравнены представленные методы извлечения применительно к серым лесным почвам окрестностей г. Новосибирска.
Ключевые слова: ДНК; микроорганизмы; метагеномные образцы; почва.
Введение
В XX веке микроорганизмы позволили производить огромное количество химических соединений, разработанные методики культивирования микроорганизмов подтолкнули к развитию нового сектора экономики - биотехнологической промышленности.
Однако общеизвестно, что культивировать возможно лишь незначительную часть известных науке видов микроорганизмов. Следовательно, еще более значительное количество разнообразных продуктов, синтезируемых бактериями и имеющих коммерческий интерес, предстоит еще ввести в производство.
Такое положение вещей ставит исследователей перед необходимостью поиска методики работы с большим количеством видов микроорганизмов без их культивирования. В последние годы были хорошо отработаны технологии создания рекомбинантных генов, позволяющие, в том числе, встраивать
интересующие исследователей нуклеотидные последовательности из некультивируемых микроорганизмов в культивируемые (E. coli, B. subtilis).
Целью данного исследования являлся подбор максимально эффективного метода извлечения суммарной ДНК микроорганизмов из почвенных образцов, пригодной для дальнейшего исследования с помощью ПЦР амплификации.
Материалы и методы исследования
Образцы почвы были собраны под кроной Betula Pendula в лесу смешанного типа в окрестностях НГУ леса Новосибирского Академгородка и хранятся в замороженном состоянии (-20 0С) при естественной влажности.
В работе проведено сравнение методов, ранее успешно примененных различными группами исследователей.
Экстракция почвенной ДНК
Метод 1(с использованием протеиназы К и SDS [1])
Почва (0.5 г) была суспендирована в 1.5 мл литического буфера (100 мМ трис-HCl (pH 8.0), 100 мМ Na3PO4 (pH 8.0), 100 мМ Na-EDTA1 (pH 8.0), 1% CTAB2, 1.5 М. NaCl) и 150 мкл раствора протеиназы K (10 мкг/мл).
Суспензию интенсивно перемешивали на горизонтальном шейкере на частоте 225 колебаний в минуту в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем добавили 160 мкл 20%-го SDS3, и пробу выдержали 2 часа в жидкостном термостате при температуре 65оС с легким покачиванием каждые 15 - 20 минут.
Осадок отделяли центрифугированием (10 минут, 6 000 об/мин при комнатной температуре в 1.5 мл пробирке Eppendorf на центрифуге Eppendorf 5415C).
К супернатанту добавляли равный объем смеси фенол/хлоро-форм/изоамиловый спирт (25:24:1). Водную фазу собрали после центрифугирования при 6000 оборотах в течение 10 минут, после чего осаждали изопропанолом (0.6 объема) при 4°C в течение ночи. Осадок
1 Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты.
2 Гексадецилтриметиламмоний бромид.
3 Додецилсульфат натрия.
собирали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 минут, осадок промывали холодным 70% этанолом, высушивали и разбавляли водой до объема 50 мкл.
Метод 2 (СТАВ метод [1])
0.5 г почвы суспендировали в буфере (100 мМ трис-НС1 (рН 8.0), 100 мМ Ка3Р04 (рН 8.0), 100 мМ Ка-ЕБТЛ (рН 8.0), 2% [в/о] СТАВ, 1.5 М КаС1), затем приливали 160 мкл 20% БББ. Образцы выдерживали при 65оС на водяной бане в течение 2-х часов с аккуратным покачиванием каждые 15 - 20 мин.
Остальные процедуры проводили аналогично первому методу.
Метод 3 (замораживания - оттаивания [1])
0.5 гр. почвы смешивали с 1.5 мл буфера (100 мМ трис-НС1 (рН 8.0), 100 мМ Ка3Р04 (рН 8.0), 100 мМ Ка-ЕБТЛ (рН 8.0), 1% [в/о] СТАВ, 1.5 М КаС1), затем пробу замораживали в жидком азоте (10 мин) и разогревали до 65оС (10 мин), операцию повторяли три раза. Остальные процедуры проводили аналогично первому методу.
Данный метод был дополнен стадией выдерживания при 65оС в течение 2 часов с добавлением 160 мкл БББ (Метод 4). Таким образом, этот метод представлен в исследовании в 2 вариациях, одна из которых дополнена выдерживанием с БББ (Метод 4), а другая без таковой (Метод 3).
Метод 5 (с использованием ТБИС буфера [2])
Почвенную навеску (0.5 г) смешивали с 1.5 мл ТЕКС буфера (100 мМ трис-НС1, 10 мМ ЕБТЛ, 100 мМ КаС1, 1% [в/о] СТАВ, 1 мл 50 мкг/мл протеиназы К, рН 8.0), затем смесь замораживали в жидком азоте и нагревали до 56оС на 10 мин, после чего к смеси добавляли 100 мкл 20% БББ и смесь нагревали до 65оС на 10 минут. Далее - как в первом методе.
Метод 6 (измельчения в жидком азоте [3])
Почвенную навеску (0.5 г) замораживали в жидком азоте и мелко измельчали в ступке пестиком, пыль суспендировали в 1 мл буфера (0.3% БББ, 0.14 М КаС1, 50 мМ ацетат натрия [рН 5.1]). Суспензию смешивали с равным объемом насыщенного водного раствора фенола и перемешивали на микрошейкере в течение 2 мин.
Очистка центрифугированием при 12 000 об/мин проводилась в течение 10 мин. Супернатант смешивали с 2.5 объемами этанола и осаждали при -20оС в течение 16 часов.
После центрифугирования при 14 000 об/мин в течение 6 мин, выделенную ДНК дважды промывали этанолом, а затем высушили. Сухие гранулы растворяли в 50 мкл воды.
Хранение всей извлеченной ДНК при - 20оС.
Сравнение методов экстракции ДНК
Для сравнения методов между собой принимали во внимание 3 критерия:
1. Извлечение ДНК максимальной длины, чтобы работать с наименее поврежденными генами.
2. Извлечение максимального количества молекул ДНК.
3. Выделение наименьшего количества сопутствующих веществ, ингибирующих амплификацию (в частности гуминовых кислот), для облегчения дальнейших процедур очистки.
В большинстве случаев концентрацию ДНК в растворе определяют с помощью спектрофотомерии. В нашем случае это невозможно, поскольку помимо ДНК дополнительно была выделена масса других органических и неорганических соединений (в большинстве представленных гуминовыми кислотами). Помимо прочего для выделения ДНК использовался фенол, от которого трудно отмыть пробу полностью, не потеряв значительного количества ДНК. Фенол даже в следовых количествах интенсивно поглощает свет в той же области спектра, что и нуклеиновые кислоты. Поэтому в нашем случае количество выделенной ДНК с помощью разных методов сопоставили между собой по интенсивности свечения дорожек в УФ свете окрашенного бромистым этидием геля агарозы. Сравнение проводили с помощью прибора Gel Doc Imager System производства компании Bio-Rad (США).
Размер выделенных молекул был оценен с помощью горизонтального электрофореза в геле агарозы.
Параметры проведения электрофореза
Для проведения электрофореза были использованы комплекты для горизонтального электрофореза производства компании Bio-Rad (США).
При сопоставлении количества выделенной ДНК использовался 1%-й агарозный гель, на дорожку наносилось по 1 мкл экстракта, смешанного с 2 мкл красителя (5% SDS, 25% глицерин, 0.025% бромфеноловый синий). Электрофорез проводился 40 минут при напряжении электрического тока 80 Вольт. Силу тока прибор выставлял автоматически, согласно заложенной производителем программе.
При определении размера выделенных молекул с целью увеличить расстояние между молекулами разного размера использовался 0.3%-й агарозный гель, нанесенный на основание из 1%-го агарозного геля (для стабилизации формы). Прочие параметры - как в первом случае.
В качестве маркера был использован Hind III - гидролизат ДНК фага лямбда производства компании «СибЭнзайм».
Сравнение по коэкстракции сопутствующих веществ
При выборе метода извлечения ДНК из почвы и прочих объектов исследований важным критерием является коэкстракция побочных продуктов, способных ингибировать амплификацию, так как экстракт, выделенный с наименьшим количеством сопутствующих веществ, проще очистить для дальнейших исследований.
Для сравнения методов на предмет коэкстракции сопутствующих продуктов был применен метод спектрофотометрии, в диапазоне длин волн от 200 до 600 нм.
В кювету (3 мл) налили 2 мл деионизированной воды и добавили 10 мкл экстракта, выделенного из почвы. Замеры производились в сравнении с кюветой, содержащей чистую деионизированную воду. Таким образом были поочередно произведены замеры всех 6 экстрактов, после чего графики были наложены друг на друга с помощью специальной программы, поставляемой производителем с прибором.
Результаты и обсуждения Сравнение по объему экстрагирования ДНК из почвенной навески
1 2 3 4 5 6 М
- —?ЗТНП
Рис. 1. Электрофорез экстрактов почвы в 1%-м агарозном геле. 1. Метод № 1. 2.Метод № 2. 3.Метод № 3. 4.Метод № 4. 5.Метод № 5. б.Метод № 6. М. Маркер - Hind III - гидролизат ДНК фага лямбда (X)
Как видно на рис. 1, наиболее яркое свечение наблюдается на дорожке под номером 6, куда наносили 1 мкл экстракта ДНК, полученного методом измельчения в жидком азоте. По всей видимости, интенсивное растирание при низких температурах наиболее полно разрушило клетки в исследуемом образце. Чуть менее значительное свечение наблюдается при экстрагировании ДНК с помощью ТЕКС буфера (дорожка №5). Причиной, вероятно, является более высокая концентрация протеиназы К, чем в первом методе, а также комплексное использование термошока и химического разрушения клеток с помощью БББ. Прочие методы показали примерно равный массовый выход ДНК из навески 0.5 г.
Сравнение по размеру молекул ДНК
М 1 2 3 4 5 6
Рис.2. Электрофорез экстрактов почвы на 0.3%-м агарозном геле.
1.Метод № 1. 2.Метод № 2. 3.Метод № 3. 4.Метод № 4. 5.Метод № 5.
6.Метод № 7. М. Маркер - Hind III - гидролизат ДНК фага лямбда (X)
Как показал электрофорез, в 0,3%-м геле агарозы (рис. 2), существенной разницы в размере экстрагированных молекул ДНК не выявлено. Все пробы показали наличие фрагментов размером около 23 тысяч пар нуклеотидов и некоторого количества высокомолекулярной ДНК, незначительно вошедшей в гель.
Сравнение по экстракции сопутствующих веществ Как видно из спектров поглощения света в диапазоне от 200 до 600 нм (рис. 3), наибольшую оптическую плотность, а следовательно, наибольшее количество коэкстрагированных веществ имеет экстракт ДНК, выделенный с помощью метода заморозки - оттаивания, дополненного инкубированием с SDS (метод № 4). Следующий (в порядке уменьшения оптической плотности) — метод заморозки и оттаивания без инкубирования с SDS (метод № 3). Вероятно, резкая смена температур ведет к интенсивному разрушению комплексов, образованных органическими соединениями и почвенными частицами, а SDS, являясь сильным ПАВ, усиливает этот эффект. Относительно средние объемы коэкстракции показали методы CTAB (метод № 2) и с использованием TENC буфера (метод № 5).
Наиболее низкие значения коэкстракции показали методы с использованием протеиназы К (метод № 1) и метод измельчения в жидком азоте (метод № 6). В случае с методом выделения протеиназой К относительно низкая коэкстракция объясняется, вероятно, отсутствием стадии резкой смены температур; в случае с растиранием в жидком азоте (самый низкий показатель коэкстракции) можем предположить, что водный раствор фенола лучше осаждает примеси органических веществ из почвы, чем смесь фенол/холоформ/изоамилового спирта.
После сопоставления методов между собой была проведена повторная экстракция почвенной ДНК методами измельчения в жидком азоте (метод № 6) и методом с использованием ТБКС буфера (метод № 5) в трех повторах для сопоставления между собой в целях установить статистическую достоверность эффективности выделения ДНК (рис. 4).
Кривая спектрального сканирования
200,00 300,00 400,00 500,00 600,00
Длина волны (нм)
Рис.3. Сравнительные кривые спектрального сканирования экстрактов почвы.
1.Метод № 1. 2.Метод № 2. З.Метод № 3. 4.Метод № 4. 5.Метод № 5. б.Метод № 6
Как показало повторное исследование, в трех случаях из трех объем выделенной ДНК с размером фрагментов около 23 тысяч нуклеотидных пар, был существенно выше при использовании метода №6, чем в случае метода с использованием ТБКС буфера (метод №5). Однако ДНК большего размера в
82
случае метода №6 была выявлена только на дорожке 2, а при выделении с помощью метода №5 ДНК размером существенно большим, чем 23 тысячи пар нуклеотидов, наблюдаются во всех трех случаях (дорожки 4,5 и 6).
М 1 2 3 4 5 6 М
mSiFS r__I _
Зтк.а-
Рис. 4. Сравнение результатов выделения ДНК почвенных организмов методом измельчения
в жидком азоте (метод № 5) и методом с использованием TENC буфера (метод № 6) 1,2,3 - экстракт ДНК, выделенной измельчением в жидком азоте; 4,5,6 - экстракт ДНК, выделенной с использованием TENC буфера; М. Маркер - Hind III - гидролизат ДНК фага лямбда (X)
Выводы
Согласно полученным данным, наиболее значительное количество ДНК выделяется методом измельчения в жидком азоте, он же является и наиболее чистым методом относительно других, экстрагируя наименьшее количество сопутствующих веществ, что в дальнейшем упростит очистку экстракта для последующей амплификации. По всей видимости, тщательное растирание глубокозамороженной почвы позволяет разрушить максимальное количество содержащихся в ней клеток. Однако, как показало последующее сравнение, данный метод не всегда способен выделить фрагменты размером более 23 тысяч нуклеотидных пар; разрушение ДНК, очевидно, происходит ввиду грубых механических воздействий, что в некоторых случаях является недопустимым.
Метод № 6 показал средние значения с точки зрения чистоты от сопутствующих веществ и оказался вторым с точки зрения объема выделенной ДНК. Однако этот метод продемонстрировал стабильный выход ДНК с большим размером фрагментов и рекомендуется для выделения нуклеотидных цепочек значительного размера.
Метод № 1 (с использованием протеиназы К) - единственный, в котором не используется жидкий азот, - показал приемлемый выход ДНК при экстракции из почвенных образцов. В то же время является относительно чистым методом и может быть применен при отсутствии возможности использования жидкого азота в работе.
Список литературы
1. Jia Xia, Han Shi-jie, Zhao Yong-hua, Zhou Yu-mei. Comparisons of extraction and purification methods of soil microorganism DNA from rhizosphere soil // Journal of Forestry Research 2006 - № 17(1). - P. 31-34.
2. Roh, C. H., Villatte, F., Kim, B. G., andSchmid, R D. // Electrophoresis. - 2005. - V. 26. - P. 3055-3061.
3. Tatiana Volossiouk, E. Jane Robb, and Ross N. Nazar. Direct DNA Extraction for PCR-Mediated Assays of Soil Organisms // Applied and environmental microbiology. - 1995. -P. 3972 -3976.
