Сравнение гликоокислительной модификации актина из мышц кролика и разных видов моллюсков Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА

УДК 557. 353. 23

М. А. Федорова, Н. В. Кулева

/

СРАВНЕНИЕ ГЛИКООКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ АКТИНА ИЗ МЫШЦ КРОЛИКА И РАЗНЫХ ВИДОВ МОЛЛЮСКОВ

В настоящее время получены экспериментальные доказательства активной роли актина в механизме осуществления биологической подвижности: при взаимодействии с миозином имеет место специфическое изменение конформации определенных участков молекулы (субдомена 2) и структуры актиновой нити в целом [5]. Нарушение структуры фибриллярного актина (Ф-актин) за счет действия поперечно-сшивающих агентов, таких как альдегиды, и расщепление субтилизином участка ДНКазной петли в субдомене 2 молекулы актина приводит к ингибцрованию подвижности в тесте «подвижность in vitro» [3-5].

Актин является также одним из основных белков цитоскелета, и его содержание в немышечных клетках очень высоко. С актиновыми структурами цитоскелета связаны поддержание формы, движение и деление клеток, эндоцитоз, передача медиаторов, свертывание крови, процессы, предшествующие оплодотворению, и многие другие. Предполагается также участие цитоскелета в регуляции активности ионных каналов, в процессах передачи сигнала с рецепторов на геном, транскрипции и регуляции активности ферментов. В отличие от актиновых нитей стабильного сократительного аппарата скелетных мышц, микрофиламенты цитоскелета способны собираться и разбираться в зависимости от физиологического состояния клетки.

В лаборатории общей биохимии кафедры биохимии СПбГУ в течение нескольких лет проводится работа по изучению гликоокислительной модификации актина [3, 4], но она в основном посвящена модификации актина скелетных мышц (а- изоформа). Это исследование показало, что гликоокислению в значительно большей степени подвержен актин в глобулярной форме (Г-актин). В скелетных мышцах актин представлен фибриллярной формой. Поэтому актуально изучить гликоокисление актина немышечных клеток, где существует динамическое равновесие между Г- и Ф-формами актина.

В связи с этим в данной работе предполагается исследовать гликоокисление немышечной /5-формы актина. Удобной модель»} для изучения гликоокисления /3-актина является /3-подобный актин из мышц моллюсков. Эта ткань, согласно данным литературы [18-20], содержит /3-подобную форму актина, которая может быть выделена и очищена имеющимися в нашем распоряжении методами.

Гликоокислительная модификация белков может происходить при гипергликимии как in vitro, так и in vivo, например при сахарном диабете [23]. При повышенном со- \

© М. А. Федорова, Н. В. Кулева, 2003

держании, сахара внутри клетки, наблюдаемом при галактоземии, отмечено снижение способности актина активировать миозиновую АТФазу [1]. Однако увеличение концентрации сахара одновременно приводит и к увеличению активных форм кислорода, таких как супероксид-анион, перекись водорода, гидроксильный радикал. Было бы интересно рассмотреть отдельно эффекты свободных радикалов. Известно, что на функциональные свойства актина эпителиальных клеток влияет радикал N0, продуцируемый в избытке ферментом NO-синтазой [8, 9].

Поэтому задачей настоящей работы было сравнить влияние: а) гликоокислительной модификации а- и /3-подобных форм актина на его функциональные и структурные свойства; б) окислительной модификации а- и (3-подобного актина, вызываемой N0, на его функциональные и структурные свойства.

Материалы и методы. Выделение и очистку /3-актина из мышц моллюсков Patinopecten jessoensis, Tridonta borealis, Astarte elliptica, Mytilus edulis производили методом, описанным С. Ю. Хайтлиной для моллюска Patinopecten yessoensis [18 ]. Выделение и очистку a-формы актина из скелетных мышц кролика производили стандартным методом [24]. Концентрацию белков определяли микробиуретовым методом [17]. Идентификацию а- и /3-подобной изоформ проводили с помощью сравнительного анализа протеолитических фрагментов, полученных при переваривании белков субтилизином в соотношении 1:50 [7]. Определение полипептидного состава производили с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (по: V. К. Laemmli [21]).

Обработку актина гликирующими (глицеральдегидом в конечной концентрации 10 ммоль/л, ри-бозой в конечной концентрации 50 ммоль/л, АДФ-рибозой в конечной концентрации 50 ммоль/л) и окислительными (нитропруссид в конечной концентраций 1 ммоль/л) агентами проводили при инкубации белка (концентрации 3—4 мг/мл) с перечисленными выше агентами в течение двух дней при температуре 37°С. Инкубационная среда включала HEPES (1 ммоль/л) и азид натрия (3 ммоль/л) при pH 7,0. По прошествии двух дней модифицированный и контрольный (равные объемы актина и описанного выше буфера без добавления модифицирующего агента) образцы интенсивно диализовали в течение суток против того же буфера при 4 °С.

Для оценки изменения функциональных свойств актина после гликоокислительной модификации использовали такой показатель, как степень активации актином Mg2+-аденозинтрифосфотазы стандартизованного препарата миозина [3].

Для выявления структурных изменений использовали следующие показатели: содержание свободных SH-групп, ГШг-групп, СО-групп, триптофановых остатков, битирозиновых сшивок, конечных продуктов глубокого гликирования, пентозидинов. Определение свободных SH-групп проводили по методике Элманас использованием 5,5-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) [15]. Количество свободных NH2-rpynn в белке определяли реакцией с тринитробензолсульфониевой кислотой [16]. Определение содержания карбонильных производных проводили с помощью реакции с 2,4-динитрофенилгидразином [25]. Оценку изменений других параметров проводили флуоресцентными методами [12,* 23].

Результаты и обсуждение. Сравнение структуры молекулы актина из мышц кролика и моллюсков производили сопоставлением их протеолитических фрагментов, образующихся при 30-минутном переваривании субтилизином (1:50). Известно, что Ф-актин устойчив к протеолизу. Однако если субтилизин добавить к актину при высоком соотношении фермент/субстрат, наблюдается протеолиз Ф-актина с формированием тех же продуктов, которые образуются при протеолизе Г-актина, и новых фрагментов. Продукты протеолиза Ф-актина субтилизином идентифицированы 35, 33, 30, 25, 21, 19 и 16 кДа [7].

Препараты актина кролика и моллюсков должны, согласно данным литературы, различаться по содержанию фрагментов с молекулярной массой 21 и19 кДа. Ранее было показано, что именно такое различие наблюдается в исследованных нами препаратах актина из мышц кролика и Patinopecten jessoensis [6]. В настоящей работе было показано, что аналогичные различия имеют место и для препаратов актина из мышц моллюсков Tridonta borealis, Astarte elliptica, Mytilus edulis.

Для изучения функциональных свойств актина использовали актин, полученный из мышц моллюска Patinopecten jessoensis.

Параметром сравнения функциональных свойств актинов была способность активи- ' ровать ^2+-аденозинтрифосфатазу стандартизованного препарата миозина. Мы рассмотрели влияние разных гликоокислительных агентов на степень активации миозино-вой АТФазы актином в глобулярной и фибриллярной формах. При этом также было проведено сравнение модификации актинов разных изоформ, выделенных из скелетных мышц кролика и моллюска. В качестве гликоокислительных агентов был выбран глицеральдегид (ГА), рибоза (РИБ) и АДФ-рибоза (АДФ-РИБ). В качестве агента окислительной модификации использовали нитропруссид, соединение, продуцирующее радикал N0, осуществляющий нитрозилирование белков.

При модификации фибриллярного а- и /3-подобного актина глицеральдегидом происходило повышение степени активации ]У1^2+-АТФазы миозина на 230% (за 100% принята степень активации й^2+-АТФазы стандартизованного препарата миозина) как в случае а-, так и в случае /3-подобной формы. При инкубации Ф-актинов с рибозой и нитропруссидом значительного изменения степени активации не выявлено. Таким образом, различий между фибриллярными актинами а- и /3-подобной формы при их модификации не обнаружено (рис. 1).

При инкубации Г-актина а- и /3- подобной формы в течение двух суток, с последующей полимеризацией с помощью КС1 в конечной концентрации 0,1 моль/л, с различными модифицирующими агентами были выявлены значительные различия между ос- и /3- подобной формами актина. При модификации глицеральдегидом происходит уменьшение степени активации М§2+-АТФазы на 230 и на 200% в случае а- и /3-подобного актинов соответственно. При инкубации с АДФ-рибозой степень активации в случае а- актина увеличивается на 200%, а в случае /3-подобного актина остается на контрольном уровне. При модификации нитропруссидом а-формы актина степень активации остается неизменной, при модификации /3- подобной формы происходит уменьшение степени активации на 265%. Инкубация а-актина с рибозой не изменяет степень активации, инкубация /3-подобного актина с рибозой уменьшает степень активации на 2£0% (см. рис. 1).

Таким образом, очевидно, что влияние гликоокислительных агентов на степень активации миозйновой АТФазы фибриллярным актином практически отсутствует. В случае модификации глобулярного актина наблюдается значительное изменение степени активации, различное для разных агентов гликоокисления и разных изоформ актина. Из рис. 1 видно, что актин из мышц моллюсков (/3-подобная изоформа) подвержен гликоокислительной модификации в значительно большей степени, чем актин из скелетных мышц кролика (а-изоформа).

Тот факт, что гликоокислительной модификации подвержен актин в глобулярной форме, а не в фибриллярной, видимо, ..говорит о том, что модификации в структуре молекулы, вызванные агентами гликоокисления, затрагивают сайты, необходимые для эффективной полимеризации актиновых мономеров в полимерную структуру фибриллярного актина.

Кроме того, была прослежена динамика изменения активации миозиновой АТФазы глобулярным актином разных изоформ,*При модификации глицеральдегидом снижение степени активации АТФазы происходит значительно быстрее в случае актина из мышц гребешка, чем в случае актина из скелетных мышц кролика. Таким образом, видно, что. изменение функциональных свойств актина /3-подобной изоформы происходит значительно быстрее и глубже, чем у а-изоформы актина.

Затем было выяснено, с модификацией каких функциональных групп связаны изменения функциональных свойств актина при гликоокислительной (под действием гли-

Рис. 1. Влияние гликоокислительной и окислительной модификации на степень активации миозиновой АТФазы фибриллярным (А) и глобулярным (Б) актином кролика (*) и моллюсков (**) после инкубации с глицеральдегидом (ГА), рибозой (РИБ), АДФ-рибозой (АДФ-РИБ) и нитропруссидом (НП); м —миозин,

* актин кролика, ** актин моллюсков (то же для рис. 2-4).

По оси ординат: степень активации миозиновой АТФазы (в % к активности стандартизованного препарата миозина, равной 0,01 мкмоль Фн/ мг/ мин).

церальдегида) и окислительной (под действием нитропруссида, продуцирующего N0) модификациях. 4

Гликоокислительная модификация приводит к значительному увеличению содержания битирозиновых сшивок (на 710% для а-актина и на 436% для /3-подобного актина), конечных продуктов глубокого гликирования (на 1040% для а-актина и на 386% для /3-подобного актина) и, в частности, пентозидинов (на 748% для а-актина и на 728% для /3-подобного актина), карбонильных производных (на 750% для а-актина и на 550% для ^-подобного актина). Кроме того, происходит значительное тушение триптофано-вой флуоресценции ч(на 51% для а-актинга и на 76% для /3-подобного актина). В то же время изменения в содержании свободных N112- и БН-групп обнаружено не было (рис. 2, 3, 4).

Окислительная модификация, обусловленная действием N0, приводила к повышению содержания карбонильных, производных лишь в актине /9-подобной изоформы (на 190%). Увеличение содержания битирозиновых сшивок наблюдалось лишь у а-изоформы (450%). Образование конечных; продуктов глубокого • гликирования

1

Я 0,8 І

і 0,6 В 0,4 &

5 0,2 К от ^ 0

I

К**

ГА*

ГА*<

НП*

НП**

Я

І 41 І 3,5

І з

І 2,5

І 2 ^15

сч *»•>

К*

К** ГА*

ГА** НП* НП**

Рис. 2. Влияние гликоокислительной и окислительной модификаций на количество свободных ЭН-Групп (А) и КНг-групп (23) в актине кролика и моллюсков после инкубации с глицеральдегидом и нитропруссидом.

(КПГГ) и пентозидинов происходило в незначительной степени. Тушение триптофа-новой флуоресценции было выражено в меньшей степени, чем в случае гликоокислительной модификации, и в большей степени касалось /3-подобной формы актина (на 56%). Изменения содержания свободных МНг-групп не происходило. Отличительной чертой действия N0 является значительное, блокирование ЭН-групп, более выраженное для /3-подобной формы актина (на 50% для о;-актина и на 81% для /3-подобного актина; см. рис. 2, 3, 4).

Таким образом, было показано, что модификация с помощью глицеральдегида приводит как к собственно гликированию (образование КПГГ), так и к окислению (увеличение содержания карбонильных производных, битирозиновых сшивок, уменьшение содержания немодифицированного триптофана), т. е. является комплексным гликоокис-лительным процессом.

Модификация с помощью N0 приводит главным образом к изменению количества свободных ЭН-групп (Б-нитрозилирование) и тушению триптофановой флуоресценции.

Из всего вышесказанного можно заключить, что характер модификации актина из скелетных мышц кролика и из мышц гребешка различен. Для актина /3-подобной изоформы характерно гораздо более быстрое и глубокое нарушение функциональных свойств. Кроме того, актин /3-подобной изоформы сильнее подвержен как гликоокислению, так и н&трози л и ров анию с помощью N0. Гликирующее воздействие глицераль-

300, 250 200 150 ^ 100 50 О,

І

к*

к**

ГА*

ГА**

1

нп*

ШГ"

и

и

и

I

200

150

100

50

0

В

250

200

150

100

50

О-

Г*1

1

;т~] ■ , п

К*

К**

ГА*

>

ГА*11

НП*

НП**

ш

к*

к**

ГА*

ГА*"

НП*

нп**

г

200

150

100

50

О

1

К*

к**

ГА*

ГА**

НП*

НП**

Рис. 3. Влияние гликоокислительной и окислительной модификации на количество трип-тофановых остатков (Л), битирозиновых сшивок (Б), конечных продуктов глубокого глики-рования {ВУ, пентозидинов (Г) в актине кролика и моллюсков после инкубации с глицёраль-дегидом и нитропруссидом.

1,8

1,6

1Л

1,2

1

0,8 0,6

0,4

0,2

0

К*

К**

ГА*

ГА**

нп*

нп**

Рис. 4- Влияние гликоокислительной и окислительной модификации на количество карбонильных производных в актине кролика.и моллюсков после инкубации с глицеральдегидом и нитропруссидом.

дегида приводит к одинаковым изменениям в актинах обеих изоформ. Но в случае /3-подобного актина эти нарушения выражены в большей степени. Но при окислительном воздействии (окисление с помощью N0 и в результате аутоокисления гли-церальдегида) характер изменений в структуре актина разных изоформ существенно отличается. Для /3-подобного актина более сильно выражено тушение триптофановой флуоресценции и уменьшение числа свободных SH-групп. Для актина ai-изоформы при окислительной модификации образование битирозиновых сшивок и карбонильных производных происходит в большей степени, 'Чем в /3-подобном актине.

Видимо, такие различия в характере модификации актина разных изоформ обусловлены различиями в структурной организации актиновой молекулы. Возможно, что в молекуле /3-подобного актина сайты, ответственные за полимеризацию и, как следствие, за функциональные свойства фибриллярного актина, более экспонированы на поверхности белковой глобулы и, таким образом, более доступны для модификации. Подобные предположения согласуются с данными литературы о том, что в молекуле /3-подобного актина нуклеотидсвязывающая щель имеет более открытую конформацию [20].

Полученные данные соответствуют данным других авторов. В экспериментах in vivo на /3-актине, выделенном из клеток слизистой кишечника больных с воспалением желудочно-кишечного тракта, было показано, что такого рода заболевания приводят к гиперпродукции радикала N0 и, как следствие, к нарушению структурных свойств ци-тоскелетного актина: происходит уменьшение содержания свободных SH-групп и немо-дифицированных остатков триптофана [8, 9].

Кроме того, в последнее, время получено большое количество данных по гликоокислительной модификации актина скелетных мышц млекопитающих in vivo (модель сахарного диабета, галактоземии, действие ионизирующей радиации). Было показано, что при повышении содержания сахара в крови и при усиленной выработке свободных радикалов происходит нарушение функциональных свойств актина, хотя изменений в структурной организации выявлено не было [1]. В работе итальянских исследователей [14] in vitro было показано влияние «критических» остатков метионина на степень полимеризации актина. Однако в этой работе был использован «мягкий» оксидант хлорамин Т, который действует избирательно на остатки метионина и цистеина. Модификация цистеина, как было отмечено в обзоре литературы, практически не влияет на функциональные свойства актина [13]. При модификации «критических» метионинов

имеет место изменение конформации актиновой молекулы, приводящее к увеличению ее гидрофобности. Наши данные, показывающие различие между а- и /3-подобной формами актина в отношении ее гликоокислительной и окислительной модификации, также указывают на важное значение конформации актиновой молекулы при действии повреждающих агентов.

Авторы приносят благодарность ведущему научному сотруднику Института цитологии РАН С.Ю.Хайтлиной за предоставление мышц Patinopecten jessoensis.

Статья рекомендована проф. В. Н. Кокряковым.

Работа выполнена при поддержке Научной программы «Университеты России» (грант УР И. 01. 017 (2003)).

Summary

Fedorova М. A., Kuleva N. V. A comparison of glycooxidative modification of rabbit muscle actin and actin of different mollusk species.

A comparison of the influence of glycooxidative (glyceraldehyde, ribose, ADP-ribose) and oxidative (NO) agents on structural and functional properties of rabbit skeletal muscle actin and actin of different species of mollusk was carried out. /З-like actin of mollusk muscle was used as a model of non-muscle /3- actin.

Литература

1., Бакланова М. Ю., Залесова 3. С., Федорова М. А., Кулева Н. В., Иванов С. Д. Механизмы модификации внутриклеточных белков при гипергликемии и действии ионизирующей радиации // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2002. Вып. 3 (№19). С. 2^-31. 2. Иванов И. И., Юрьев В. А. Биохимия и патобиохимия мышц. Л., 1961. 3. Кулева Н.В., Коваленко 3. С. Изменение функциональных свойств актина при его гликировании in vivo // Биохимия. 1997. Т. 61, №10. С. 1307-1313. 4. Кулева Н.В., Залесова 3. С. Исследование неэнзиматического гликозилйрования и окислительного повреждения актина in vitro и in vivo // Цитология. 2000. Т. 42, № 1. С. 66-71. 5. Кулева Н. В. Молекулярные механизмы действия моторных белков мышц и немышечных клеток: Автореф. докт. дис. СПб., 2000. 32 с. 6. Федорова М. А., Кулева Н. В. Сравнение структурно-функциональных свойств актина мышц кролика и мышц моллюска My a arenaria // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2002. Вып. 4 (№27). С. 132-136. 7. Хайтлина С. Ю. Молекулярные механизмы динамики актиновых структур клетки: Автореф. докт. дис. СПб., 1997. 44 с. 8. Вапап A., Zhang Y., Keshavarzian A. Carbonylation and disassembly of the F-actin cytoskeleton in oxidant induced barrier dysfunction and its prevention by epidermal growth factor and transforming growth factor a- in a human colonic cell line // Gut. 2000. Vol. 46. P. 830-837. 9. Ba-nan A., Fitzpatrick L., Zhang Y., Keshavarzian A. OPC-Compounds prevent oxidant-induced carbonilation and depolymerization of the F-actin cytoskeleton and intestinal barrier hyperpermeability // Free Rad Biol. Med. 2001. Vol. 30, №3. P. 287-298. 10. Baynes J. W., Thorpe S. R. Role of oxidative stress in diabetic complication: a new perspective on old paradigm // Diabetes. 1999. Vol. 48. P. 1-9. 11. Cervantes-Laureant D., Jacobson E. L., Jacobson М. K. Glycation and glycooxidation of histones by ADP-ribose // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 10461-10469. 12. Davies K. J. A., Delsignore М. E. Protein damage and degradation by oxygen radicals // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. P. 9908-9913. 13. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D. et al. Actin carbonylation: From a simple marker of protein oxidation to relevant signs of severe functional impairment // Free Rad. Biol. Med. 2001. Vol. 31, N9. P. 1075-1083. 14. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D. et al. Methionine oxidation as a major cause of the functional impairment of oxidized actin j j Free Rad. Biol. Med. 2002. Vol. 32. P. 927-937. 15. Ellman G. L. Tissue sulfhydril groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. Vol. 82. P. 70-77. 16. Habeeb A. Determination of free amino groups in proteins by trini-trobenzenesulfonic acid // Analyt. Biochem. 1966^. .Vol. 14. P. 328-336. 17. Ithaki N. F., Gill H. M. A micro-biuret method for estimating proteins j I Analyt. Biochem. 1964. Vol. 9. P. 401-408. 18. Khaitlina S. Yu. Polymerization of /З-like actin from scallop adductor muscle // FEBS Lett. 1986. Vol. 198, N 2. P. 221-224.

19. Khaitlina S. Yu. Functional specificity of actin isoforms // Int. Rev. Cytol. 2001. Vol. 202, N1. P. 35-99.

20. Khaitlina S., Antropova O., Kuznetsova Ir., Turoverov K., Collins J. H. Correlation between polymerization and conformation in scallop /0-like actin and rabbit skeletal muscle a-actin // Arch. Biochem. Biophys. 1999. Vol. 368, N1. P. 105-111. 21. Laemmli V. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685. 22. Margulis B.A., Galaktionov K., Podgor-naya О. I., Pinaev G. P. Major contractile protein of mollusk: tissue polymorphysm of actin, tropomyosin

and myosin light chains is absent // Cop. Physiol. 1982. Vol. 72, N3. P. 473-476. 23. Monnier V.M., Vsh-wanath V., Frank K. E. et al. Relation between complications of I diabetes mellitus and collagen-linked fluorescence // New England J. Med. 1986. Vol. 314. P. 403-408. 24. Spudich B.H., Watt S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction // J. Biol. Chem. 1971. Vol. 246. P. 4866-4871. 24. Stadman E. R., Levine R. L. Protein oxidation // Annu. N. Y. Acad. Sci. 2000. Vol. 97. P. 190-207.

Статья поступила в редакцию 14 июня 2003 г.'