CC BY
84
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10305 УДК635.21:631.524:582.281.144
СРАВНЕНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ МОНИТОРИНГА ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА КАРТОФЕЛЯ PHYTOPHTHORAINFESTANS*
Е.А. СОКОЛОВА1, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (e-mail: [email protected]) М.А. КУЗНЕЦОВА2, кандидат биологических наук, зав. отделом (e-mail: [email protected])
A.Н. РОГОЖИН2, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник (e-mail: [email protected])
B.Н. ДЕМИДОВА2, кандидат биологических наук, научный сотрудник;
Т.И. УЛАНОВА2, технолог Т.И. СМЕТАНИНА2, технолог
Е.В. РОГОЗИНА3, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: [email protected])
Э.Е. ХАВКИН1, доктор биологических наук, зав. лабораторией (e-mail: [email protected])
всероссийский институт сельскохозяйственной биотехнологии, ул. Тимирязевская, 42, Москва, 127550, Российская Федерация
2Всероссийский институт фитопатологии, ул. Институт, вл. 5, р.п. Большие Вяземы, Одинцовский р-н, Московская обл., 143050, Российская Федерация
3Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР), ул. Б. Морская, 42-44, Санкт-Петербург, 190000, Российская Федерация
Резюме. Цель работы - соотнести результаты молекулярных исследований изолятов Phytophythora infestans с их характеристиками, полученными традиционными фитопатологическими методами. Изоляты отбирали с листьев картофеля из полевой коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова в 2013-2015 гг. Вирулентность линий P. infestans определяли на долях листьев, используя набор растений-дифференциаторов из Международного картофельного центра (CIP, Lima, Peru), распознающий 22 патотипа P. infestans. Агрессивность линий оценивали в тесте с клубнями картофеля, устойчивость к металаксилу - на клубнях картофеля сорта Santé. Изоляты и монозооспоровые линии, выделенные из изолятов, собранных в 2015 г., группировали на основе профилей факторов вирулентности (сумма генов, выявленных с помощью растений-дифференциаторов). У изолятов 2013 г. и монозооспоровых линий 2015 г. преобладали патотипы с фактором вирулентности от 7 до 11, имевшие ген вирулентности 8, а у изолятов 2014 г. - патотипы с фактором вирулентности от 6 до 9, у которых отсутствовал ген вирулентности 8. Показатели типа спаривания, зарегистрированные при фенотипическом анализе и с помощью CAPS маркера W16, совпадали в 90 % случаев. Молекулярный метод определения этого показателя надежен и позволяет получить результаты намного быстрее, чем традиционный фитопатологический. Аллельный состав генов авирулентности (Avr генов), идентифицированных методом клонирования и секвенирования, мало соответствовал профилю факторов вирулентности. Показатели вирулентности не были связаны с устойчивостью к металаксилу и агрессивностью в тесте с клубнями картофеля. Агрессивность, как показатель реальной вредоносности P. infestans, не соответствовала потенциальной вредоносности (профилям факторов вирулентности и Avr генов). Ключевые слова: Phytophthora infestans, фитофтороз картофеля, типы спаривания, агрессивность, Rpi гены устойчивости к P. infestans, факторы вирулентности, Avr гены авирулентности. Для цитирования: Сравнение фенотипических и молекулярно-генетических методов мониторинга возбудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestans/Е.А. Соколова, М.А. Кузнецова,
А.Н. Рогожин и др. //Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. №3. С. 24-27. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10305.
Фитофтороз, вызываемый оомицетом Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, остается первостепенной агрономической и экономической проблемой производства картофеля. Устойчивое картофелеводство нуждается в простых и надежных методах для обнаружения изменений в наборе штаммов P. infestans, колонизующих растения картофеля, оценки агрессивности этих штаммов и прогноза потерь урожая. В силу высокого разрешения и оперативности методов молекулярного мониторинга популяций P. infestans интерес представляет возможность их использования еще на начальной фазе заражения. Соответствие показателей, полученных независимыми методами, служит непременным условием успешного молекулярного мониторинга патогена.
Цель работы - соотнести результаты молекулярных исследований изолятов P. infestans с их характеристиками, полученными традиционными фитопатологическими методами.
Условия, материалы и методы. Листья, пораженные фитофторозом, собирали в 2013-2015 гг. с сортов и межвидовых гибридов картофеля, растущих в полевой коллекции ВИР (Пушкин, Санкт-Петербург). Они хорошо представляют разнообразие генов расоспецифичной устойчивости к P. infestans (Rpi генов), которые были описаны ранее [1]. Листья с некротическими пятнами помещали между срезами клубней соответствующих генотипов картофеля и в таком виде перевозили в Институт фитопатологии.
Для выделения P. infestans кусочки зараженных листьев помещали между ломтиками клубней восприимчивого сорта картофеля сорта Bintje, свободного от известных Rpi генов. Ломтики предварительно стерилизовали спиртом и пламенем горелки. Полученные «сэндвичи» переносили в стерильные чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой под верхней крышкой и инкубировали 3-4 дня при 18-20 °C. Небольшие кусочки проросшего сквозь ломтики мицелия помещали на ага-ризованную овсяную среду. Чистые культуры сохраняли при 5 °C и один раз в месяц пересевали на ту же среду.
Генотипирование изолятов и линий P. infestans по 12 SSR (simple sequence repeats) локусам [2] подтвердило предположение о том, что на одном растении могут поселяться два и более штамма патогена [3, 4]. Поэтому в дальнейшей работе мы в основном использовали для исследования монозооспоровые линии, выделенные из изолятов, собранных с индивидуальных растений в 2015 г.
Для выделения монозооспоровых линий в пробирку с 10-12-дневной культурой P. infestans наливали 8-10 мл стерильной дистиллированной воды и слегка встряхивали, чтобы отделить конидии от мицелия. Несколько капель суспензии, с учетом концентрации конидий, переносили из этой пробирки в следующую пробирку со стерильной дистиллированной водой. Полученную суспензию разбав-
* Молекулярные исследования изолятов Р. Мев1апз выполнены в рамках Госзадания 0574-2018-0010(№ госрегистрации АААА-А17-117090540058-4). Фитопатологическая оценка изолятов Р. iпfestaпs выполнены в рамках Госзадания 0598-2015-0018.
ляли до 1-2 конидий в поле зрения микроскопа (10x1.5x20) и помещали в холодильник на 1,5-2 ч при температуре 10-12 оС для выхода зооспор. После этого 4-5 капель суспензии зооспор равномерно распределяли по поверхности агари-зованной ржаной среды, разлитой слоем 1-2 мм в чашки Петри. В термостате при температуре 22 оС зооспоры прорастали на 3-4 день. Это контролировали с помощью светового микроскопа - в поле зрения должна быть хотя бы одна проросшая зооспора. Зооспоры осторожно вырезали иглой-лопаткой вместе с субстратом и переносили в пробирки на косой агар с овсяной питательной средой, пробирки возвращали в термостат. При температуре 22 оС мицелий формировался на 8-12 день, однако развивали его не все выделенные зооспоры.
Вирулентность линий определяли на отделенных долях листьев среднего яруса растений [5], используя набор растений-дифференциаторов из Международного картофельного центра (CIP, Lima, Peru), распознающий 22 патотипа P. infestans (гены вирулентности r, R1-R11 и их различные сочетания). Чтобы сгруппировать изоляты и линии P. infestans по этому признаку методом филогенетического анализа, использовали алгоритм Neighbor Joining и пакет программы Statistica 8.
При определении типа совместимости изоляты и линии P. infestans высевали в чашки Петри на ржано-овощной агар на расстоянии 4-5 см один от другого попарно с тестерными штаммами: 2К и 48К (соответственно, А1 и А2 тип спаривания). После инкубации в течение 14 дней в темноте при 18 °С с помощью светового микроскопа определяли наличие или отсутствие ооспор в месте контакта гиф, принадлежащих А1 или А2 типу. В том случае, когда исследуемый штамм образовывал ооспоры с обоими тестерами, его учитывали как А1А2; если ооспоры появлялись в монокультуре, штамм считали самофертильным.
Для изучения устойчивости изолятов и линий P. infestans к металаксилу в чашки Петри на бумажные фильтры, смоченные дистиллированной водой (контроль) или фунгицидом в концентрации 1, 10 и 100 мг/л, помещали по 10 дисков (3x10 мм) из клубней картофеля сорта Santé. На каждый диск наносили каплю (10 мкл) суспензии зооспорангиев тестируемого изолята или линии. После инкубации в темноте при 18-20 °C в течение 6-7 дней регистрировали спо-роношение. Изолят или линию считали чувствительным(ой) к металаксилу (susceptible, S), если спороношение было полностью подавлено при концентрации фунгицида 1 мг/л, слабоустойчивым (intermediately resistant, IR), если спороношение происходило при 1-10 мг/л, но отсутствовало при 100 мг/л, и устойчивым (resistant, R), если споры появлялись даже при концентрации 100 мг/л.
Уровень агрессивности линий P. infestans определяли в тесте с клубнями картофеля, как описано ранее [3].
В ходе молекулярного анализа геномную ДНК выделяли из мицелия изолятов и линий с помощью набора AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit (Axygen Biosciences, США). Концентрацию ДНК определяли с помощью UV/Vis NanoPhotometer P300 (IMPLEN, Германия) и праймеров производства Синтол (Москва). Амплификацию ДНК проводили в термоциклере MJ PTC-200 (Bio-Rad, США). Для определения типа спаривания использовали CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) маркер W16 [6]. Гены ави-рулентности Avr2 [7], Avr3a [8], Avr4 [9] и Avr-blb1 = ipiO [10] амплифицировали в соответствии с протоколами указанных ранее авторов, ампликоны очищали c помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия), клонировали с использованием pGEM-T Easy Vector System I (Promega, США) и секвенировали на анализаторе нуклеиновых кислот ABI PRISM 3130xl или Нанофор 05. Секвенирование фрагментов
Таблица 1. Определение типа спаривания у изолятов Р. infestans фитопатологическим (Ф) и молекулярным (М) методами анализа (2013-2014 гг.).
Изолят*\ Ф 1 М 1 Изолят* I Ф М
2-13 А2 A2 7-14 А1 A1
4-13 А1 A1 36-14 A2 A2
111-13 А1А2 А2 43-14 A2 A2
7-13 А2 A2 82-14 А1 A1
106-13 А1 A1 109-14 А1 A1
132-13 А1А2 А2 119-14 А1 A1
113-13 А1А2 А2 132-14 А2 A1
131-13 А1 A1 28-14 А1 A2
87-13 А2 A2
*протокол описан подробнее ранее [3]; в нумерации изолятов второе число обозначает год отбора проб
ДНК проводили в Центре коллективного использования оборудования ВНИИСБ «Биотехнология».
Результаты и обсуждение. Показатели типа спаривания при фенотипическом анализе и с помощью CAPS маркера W16 совпадали в 90 % случаев (табл. 1). Можно со всей определенностью утверждать, что молекулярный метод определения типа спаривания надежен и позволяет получать результаты намного быстрее и с меньшими затратами труда, чем традиционный фитопатологический метод. Более того, как показало недавнее исследование [11], аллельный полиморфизм маркера W16 позволяет дифференцировать патотипы P. infestans.
Расы (патотипы) P. infestans традиционно определяют по составу генов вирулентности, выявляемых с помощью набора растений-дифференциаторов, несущих Rpi гены S. demissum [12, 13]. При филогенетическом анализе по числу и составу генов вирулентности наша выборка изолятов и линий распалась на три больших кластера (табл. 2). В первый кластер попали формы с наименьшим средним количеством генов на изолят (фактором вирулентности). Среди них выделяется субкластер 1а - патотип, лишенный генов вирулентности 1, 2 и 4, которые распространены среди других изолятов. В субкластер 1b вошли остальные изоляты и линии с небольшим числом генов вирулентности. Во второй кластер объединили патотипы с фактором вирулентности от 6 до 9, у которых отсутствовал ген вирулентности 8. В третий кластер попали патотипы с фактором вирулентности от 7 до 11, несущие ген вирулентности 8. У изолятов 2013 г. и монозооспоровых линий, выделенных из изолятов, собранных в 2015 г., преобладали гены вирулентности, относящиеся к кластеру 3, у изолятов 2014 г. - гены, характерные для кластера 2.
Состав аллелей четырех исследованных Avr генов не соответствовал составу одноименных генов вирулентности, определяемых с растениями-дифференциаторами (см. табл. 2). Следует отметить, что эти Avr гены гомологичны лишь небольшой части известных сейчас 11 генов вирулентности [14, 15]. Другой причиной наблюдаемого несоответствия может быть тот факт, что часть растений-дифференциаторов содержит более одного Rpi гена [16]. Кроме того, использованный набор дифференциаторов не содержал Rpi генов, характерных для видов, иных, чем S. demissum, например, Rpi-blb1, который распознает ген ipiO I, II [14]. Между тем, эти Rpi гены присутствуют в гибридах картофеля, с которых собирали изоляты P. infestans [1]. Поэтому необходимо расширить спектр клонируемых Avr генов и определить их функциональную активность.
Наши фитопатологические наблюдения не выявили связи между профилями генов вирулентности изолятов (патотипами) и их агрессивностью в тесте с клубнями картофеля [3].
Таблица 2. Фитопатологическая и молекулярная характеристика изолятов и монозооспоровых линий
Кластер1 Изоляты и мо-нозооспоровые линии Устойчивость к металаксилу2 AVR ген3 Ген вирулентности Фактор вирулентности Агрес- сив-ность4
Монозооспоровые линии из изолятов, собранных в 2015 г.
3 18/1-1 - 18/1-5 Ч AVR2K avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 11 СА-ВА
3 42/2-1 - 42/2-5 Ч AVR2K 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11 9 УА
3 42/3-1; 42/3-2 Ч AVR2K/avr2 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11 9 УА-ВА
3 43/1-1 - 43/1-3 Ч AVR2K/avr2 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11 9 СА
3 53/1-1 Ч AVR2K/avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 10 УА
3 53/1-2 - 53/1-5 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 11 СА-ВА
1b 87/2-2 Ч AVR2K/avr2 1, 2, 3, 7, 8 5 УА
avr3a EM, avr4
3 103-1 - 103-4 Ч AVR2K/avr2 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 10 СА-УА
avr3a EM, avr4, IpiO
3 107-1 Ч AVR2K 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10 8 СА
3 107-2 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11 9 НА
2 117/2-1- 117/2-2 Ч - СУ AVR2K 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11 9 СА-УА
2 117/2-3 Ч 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 11 8 СА
1b 109/1-1 Ч avr2 1, 2, 3, 5, 7, 8 6 УА
2 109/1-2 avr3a EM, avr4 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11 9 СА
3 120-1 - 120-5. Ч AVR2K 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11 9 СА-ВА
11/1-1 - 11/1-5. Ч avr2 н.д. СА
3 11/2-1 Ч avr2 1, 3, 4, 7, 8, 10, 11 7
3 11/2-2 1, 2, 3, 4, 7, 8, 10, 11 8
Изоляты, собранные в 2013 г.
2 2-13 Ч AVR2K N/avr2 1, 2, 3, 4, 10, 11 6 н.д.
1b 4-13 Ч AVR2K 2, 3, 4, 8, 10 5 СА
3 111-13 Ч avr2 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11 9 н.д.
2 7-13 Ч avr2 1, 2, 4, 5, 6, 10, 11 7 н.д.
3 106-13 СУ AVR2K/avr2 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11 9 УА
2 132-13 Ч avr2 1, 2, 3, 4, 10, 11 6 УА
3 113-13 СУ avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 11 НА
1a 131-13 СУ AVR2K /avr2 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11 7 СА
IpiO I,II
avr3aEM, avr1
3 87-13 СУ avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 11 УА
IpiO I,II;
avrSm1(avr9)
Изоляты, собранные в 2014 г.
2 7-14 Ч AVR2K N/avr2 1, 2, 4, 5, 6, 10, 11 7 УА
2 53-14 Ч avr2 1, 2, 5, 6, 7, 10, 11 7 УА
IpiO I,II
AvrSm1(Avr9)
2 36-14 Ч AVR2/avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 9 УА
1b 43-14 Ч AVR2/avr2 1, 2, 3, 6, 7 5 СА
2 82-14 Ч avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 9 ВА
2 109-14 Ч avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 9 УА
2 119-14 Ч avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 9 УА
2 132-14 Ч AVR2K /avr2 1, 2, 3, 4, 10, 11 6 УА
3 28-14 Ч AVR2K /avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 11 ВА
3 Стандарт N161 Ч AVR2K /avr2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 11 УА
avr1
'кластеры патотипов на основе генов вирулентности и фактора вирулентности. 2Ч - чувствительный, СУ - слабоустойчивый, У - устойчивый. 3аминокислотный полиморфизм N3'Kв AVR2; K/N гетерозигота [7, '7].
4уровень агрессивности изолятов P. infestans: НА - не агрессивный (расчетные потери урожая менее 5 %); СА - слабоагрессивный (расчетные потери урожая от 5 до '5 %); УА - умеренно агрессивный (расчетные потери урожая от '6 до 35 %); ВА - высокоагрессивный (расчетные потери урожая более 35 %)[3]; н.д. - нет данных
Ранее при оценке вредоносности различных штаммов P. infestans мы показали, что их генотипы, разделенные на группы на основе SSR анализа, не различаются по патогенности [4]. Отсутствие такой связи между результатами генотипирования изолятов можно объяснить тем, что SSR маркеры и Avr гены представляют совершенно разные участки генома: в первом случае это районы, богатые housekeeping генами, а во втором - это участки, богатые подвижными элементами генома и практически лишенные housekeeping генов [14, 18]. Однако и при группировке штаммов P. infestans по патотипам (см. табл. 2) мы не обнаружили связи показателей потенциальной вирулентности с устойчивостью к металаксилу и агрессивностью в тесте с клубнями картофеля.
В борьбе с фитофторозом картофеля первостепенная задача - создание технологий для отслеживания значительных изменений в составе патотипов Р. iпfestaпs, колонизующих растения картофеля и прогноза потерь урожая картофеля на основе этих данных. Молекулярное генотипирование позволяет оперативно идентифицировать штаммы Р. iпfestaпs, а анализ состава генов авирулентности патогена (Ауг генов) дает уникальную возможность уже в самом начале болезни охарактеризовать потенциальную вредоносность этих штаммов. Сопоставление Ауг генов у различных штаммов Р. iпfestaпs с профилем Rpi генов колонизованных растений позволит спрогнозировать, какие сорта картофеля окажутся наиболее восприимчивыми к болезни.
Выводы. Молекулярный метод определения типа спаривания надежен и позволяет получить результаты намного быстрее и с меньшими затратами труда и средств.
На этом этапе исследования нам пока не удалось установить соответствие между факторами вирулентности, выявленными с помощью растений-дифференциаторов, и Луг генами, состав которых мож-
но достаточно быстро определить молекулярными методами. Фитопатологические наблюдения не выявили связи между спектром генов вирулентности изолятов и линий и их агрессивностью. Исследованные Луг гены соответствуют лишь части факторов вирулентности. Предстоит расширить спектр клонируемых Луг генов и определить их функциональную активность.
Литература.
1. Упреждающая селекция: использование молекулярных маркеров при создании доноров устойчивости картофеля к фитофторозу на основе сложных межвидовых гибридов / О. А. Фадина, М. П. Бекетова, Е. А. Соколова и др. // Сельскохозяйственная биология. 2017. Т. 52. № 1. С. 84-94. doi: 10.15389/agrobiology.2017.184.rus
2. Efficient multiplex simple sequence repeat genotyping of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans / Y. Li, D. E. L. Cooke, E. Jacobsen, etc.//Journal of Microbiological Methods. 2013. Vol. 92. Pp. 316-322. doi: 10.1016/j.mimet.2012.11.021.
3. Фитопатологическая и молекулярная характеристика изолятов Phytophthora infestans, собранных с устойчивых и восприимчивых генотипов картофеля/М. А. Кузнецова, Б. Е. Козловский, М. П. Бекетова и др.//Микология и фитопатология. 2016. Т. 50. С. 175-184.
4. Pathogenecity of East European strains ofPhytophthora infestans vs. resistance of colonized potato plants: the profiles of AVR genes vs. R gene pyramids/E. A. Sokolova, M. A. Kuznetsova, T.I. Ulanova, etc.//SchepersH.T.A.M. (ed.). PAGV-SpecialReport. Wageningen, DLOFoundation. 2017. No. 18. Pp. 259-267. [Электронныйресурс]. URL: www.wur.eu/AAVR(датаобращения: 18.03.2018).
5. Characteristics of the Phytophthora infestans population in Russia / N. V. Statsyuk, M. A. Kuznetsova, I. N. Kozlovskaya, etc. //PPO-Special Report, Wageningen, 2010. No 14. Pp. 247-254. [Электронныйресурс]. URL: www.wageningen.nl.UR/ppo(дата обращения: 18.03.2018).
6. Judelson H. S., Spielman L. J., Shattock R. C. Genetic mapping and non-Mendelian segregation of mating type loci in the oomycete, Phytophthora infestans// Genetics. 1995. Vol. 141. Pp. 503-512.
7. Presence/absence, differential expression and sequence polymorphisms between PiAVR2 and PiAVR2-like in Phytophthora infestans determine virulence on R2plants/E. M. Gilroy, S. Breen, S. C. Whisson, etc.//NewPhytologist. 2011. Vol. 191. Pp. 763-776. doi: 10.1111/j.1469-8137.2011.03736.x.
8 An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm/ M. R. Armstrong, S. C. Whisson, L.. Pritchard, etc. // Proceedings of National Academy of Sciences of USA. 2005. Vol. 102. Pp. 7766-7771.
9. The Phytophthora infestans avirulence gene Avr4 encodes an RXLR-dEER effector/P. M. J. A. van Poppel, J. Guo, P. J. I. van de Vondervoort, etc. // Molecular Plant-Microbe. Interactions. 2008. Vol. 21. Pp. 1460-1470. doi: 10.1094/MPMI-21-11-1460.
10. Phytophthora infestans isolates lacking class I ipiO variants are virulent on Rpi-blb1 potato/N. Champouret, K. Bouwmeester, H. Rietman, etc. //MolecularPlant-Microbe. Interactions. 2009. Vol. 22. Pp. 1535-1545. doi: 10.1094/MPMI-22-12-1535.
11. Evaluation ofPCRmarkers forPhytophthora infestans mating type determination/M. Brylinska, S. Sobkowiak, E. Stefanczyk, etc.//European Journal of Plant Pathology. 2018. [Электронный ресурс]. URL: https://doi.org/10.1007/s10658-018-1445-4 (дата обращения: 18.03.2018).
12. Malcolmson J.F., Black W. New R genes in Solanum demissum Lindl. and their complementary races of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary// Euphytica. 1966. Vol. 15. Pp. 199-203.
13. Bradshaw J.E. Potato breeding at the Scottish Plant Breeding Station and the Scottish Crop Research Institute 1920-2008.//Potato Research. 2009. Vol. 52. Pp. 141-172. [Электронныйресурс]. URL:http://dx.doi.org/10.1007/s11540-009-9126-5(дата обращения: 18.03.2018).
14. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors/V. G. A. A. Vleeshouwers, S. Raffaele, J. H. Vossen, etc.//Annual Review of Phytopathology. 2011. Vol. 49. Pp. 507-531. doi: 10.1146/annurev-phyto-072910-095326.
15. Vossen J. H., Jo K. R., Vosman B. Mining the genus Solanum for increasing disease resistance //R. Tuberosa, ed., Genomics of Plant Genetic Resources. Springer Netherlands. 2014. Pp. 27-46. doi: 10.1007/978-94-007-7575-6.
16. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes / H.-J. Kim, H.-R. Lee, K.-R. Jo, etc. //Theoretical and Applied Genetics. 2012. Vol. 124. Pp. 923-935. doi: 10.1007/s00122-011-1757-7.
17. Чижик В.К., Соколова Е.А., Мартынов В.В. Применение метода SSCP для анализа генетического полиморфизма Phytophthora infestans // Эпидемии болезней растений: мониторинг, прогноз, контроль / под ред. С.С. Санина. Б. Вяземы: ВНИИФ. 2017. С. 280-287.
18. Survey and analysis ofmicrosatellites from transcript sequences in Phytophthora species: frequency, distribution, and potential as markers for the genus / D. P. Garnica, A. M. Pinzon, L. M. Quesada-Ocampo, etc.// BMC Genomics. 2006. Vol. 7. Pp. 245. doi:10.1186/1471-2164-7-245.
COMPARISON OF PHENOTYPIC AND MOLECULAR GENETIC METHODS FOR MONITORING PHYTOPHTHORA INFESTANS, THE CAUSAL AGENT OF POTATO LATE BLIGHT
E. A. Sokolova1, M. A. Kuznetsova2, A. N. Rogozhin2, V. N. Demidova2, T. I. Ulanova2, T. I. Smetanina2, E. V. Rogozina3, E. E. Khavkin1
1All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechmology, ul. Timiryazevskaya, 42, Moskva, 127550, Russian Federation
2All-Russian Research Institute of Phytopathology, ul. Institut, vl. 5, r.p. Bol'shie Vyazemy, Odintsovskii r-n, Moskovskaya obl.,143050,
Russian Federation
3Federal Research Center the N. I. VavilovAll-Russian Institute of Plant Genetic Resources (VIR), ul. Bol'shaya Morskaya, 42-44, Sankt-Peterburg, 190000, Russian Federation
Abstract. The aim of this work was to correlate the results of molecular studies of Phytophthora infestans isolates with their characteristics, obtained by traditional phytopathological methods. The isolates were selected from potato leaves from the field collection of the N. I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources in 2013-2015. The virulence of the P. infestans lines was determined on the leaf fractions using a set of differentiation plants from the International Potato Center (CIP, Lima, Peru) recognizing 22 pathotypes of P. infestans. The aggressiveness of the lines was determined in a potato tuber test, the resistance to metalaxyl - on potato tubers of the variety of Sante. Isolates and monozoosporous lines, isolated from isolates, harvested in 2015, were grouped on the basis of profiles of virulence factors (the sum of genes detected with the help of differentiation plants). In isolates in 2013 and monozoosporous lines in 2015 pathotypes with a virulence factor from 7 to 11 dominated, which had a virulence gene of 8; and in isolates in 2014 pathotypes with a virulence factor from 6 to 9 prevailed, which lacked a virulence gene 8. The mating type indicators, recorded in phenotypic analysis and with the help of the CAPS marker W16, coincided in 90% of cases. The molecular method for determining this index is reliable and allows obtaining results much faster than the traditional phytopathological method. The allelic composition of the avirulence genes (Avr genes), identified by the cloning and sequencing method, did not correspond much to the profile of virulence factors. Virulence indicators were not associated with resistance to metalaxyl and aggressiveness in the potato tuber test. Aggressiveness, as an indicator of the real harmfulness of P. infestans, did not correspond to the potential harm (profiles of virulence factors and Avr genes). Keywords: Phytophthora infestans; potato late blight; mating types; aggressiveness; Rpi genes of resistance to P. infestans; virulence factors; Avr genes of avirulence.
Author Details: E.A. Sokolova, Cand. Sc. (Biol.), Senior Research Fellow (e-mail: [email protected]); M.A. Kuznetsova, Cand. Sc. (Biol.), Leading Research Fellow, Head ofDepartment (e-mail: [email protected]); A.N. Rogozhin, Cand. Sc. (Agr.), Senior Research Fellow (e-mail: rogozhin@vniif. ru); V.N. Demidova, Cand. Sc. (Biol.), Research Fellow; TI. Ulanova, Technologist; TI. Smetanina, Technologist; E.V. Rogozina D. Sc. (Biol.), Leading Research Fellow (e-mail: [email protected]); E.E. Khavkin, D. Sc. (Biol.), Head of Laboratory (e-mail: [email protected]). For citation: Sokolova E.A., Kuznetsova M.A., Rogozhin A.N., Demidova vN., Ulanova TI., Smetanina TI., Rogozina E.V., Khavkin E.E. Comparison of Phenotypic and Molecular Genetic Methods for Monitoring Phytophthora infestans, the Causal Agent of Potato Late Blight. Dostizheniya naukii tekhniki APK. 2018. Vol. 32. No. 3. Pp. 24-27 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10305.
