CC BY
50
УДК 579.695; 546.85; 502.55; 661.63
'А.З. Миндубаев, 2К.А. Сапармырадов, 2Ф.К. Алимова
'Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН,
[email protected] 2Казанский (Приволжский) федеральный университет
СРАВНЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СТРЕПТОМИЦЕТОВ
ИЗ РАЗЛИЧНЫХ БИОТОПОВ
Пять штаммов стрептомицетов сравнивались на предмет антагонистического подавления тест-организмов из различных таксономических групп. Стрептомицеты были выделены из различных местообитаний, что определило различия в их антибиотической активности. В частности, штамм Streptomyces species А8, выделенный из токсичного осадка, в отличие от остальных, совершенно не подавлял рост высших растений.
Ключевые слова: Streptomyces; антибиотическая активность; фитотоксичность.
Введение
Одна из форм антагонистических отношений -антибиоз - в основе своей имеет способность одного вида организма выделять токсические вещества, угнетающие жизнедеятельность других. Как известно, актиномицеты рода Streptomyces экскре-тируют во внешнюю среду множество продуктов своего метаболизма, в том числе и антибиотики (Егоров, 2004). Целью настоящего исследования стало сравнение антибиотической и фитотокси-ческой активности пяти штаммов стрептомице-тов, выделенных из различных источников, таких как клубни картофеля, образцы почв Республики Татарстан и Монголии. Один штамм выделен из экзотического источника - осадков сточных вод с добавлением токсичного ксенобиотика белого фосфора (Миндубаев, Яхваров, 2014). Последний штамм является одним из первых известных живых организмов, выработавших устойчивость к белому фосфору (Болормаа и др., 2014; Миндубаев и др., 2015а), и принимает участие в его биодеградации.
Материалы и методы исследования
В работе использовались изоляты Streptomyces: ^р. 1, S. sp.2, выделенные из клубней картофеля, S. sp.77 из почвы Восточно-Гобийского аймака (Монголия), S. sp.532 и X sp.547 из чернозема Черемшанского района Республики Татарстан, S. sp.749 из дерново-подзолистой почвы г. Елабуги (Республика Татарстан), & sp. А8 из осадка водоочистных сооружений г.Казани, в который была добавлена эмульсия белого фосфора в концентрации 0.01%, и в котором микрофлора оставалась угнетенной длительное время (о последнем субстрате и выделенных из него стрептомицетах подробнее сказано в работе (Миндубаев и др., 2015а)).
Для определения антибиотической активности в качестве тест-организмов использованы бактерии Bacillus megaterium и Pseudomonas putida, пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Для определения фитотоксичности использовались семена сорных растений щирица запрокинутая (Amaranthus retroflexus) и лебеда голостебельная (Atriplex nudicaulis), а также одноклеточная зеленая водоросль (Chlorella vulgaris).
Использованные среды: среда Гаузе 1 (г/л) (Гаузе и др., 1983), среда Гаузе 2 (г/л) (Гаузе и др., 1983), среда Лурия-Бертани (LB), среда Тамия (г/л) (Кузнецов, Владимирова, 1964).
Культуральная жидкость (КЖ) была проверена на антибиотическую активность по отношению к Bacillus megaterium, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida. Фитотоксичность определяли и оценивали по методу Алимовой (Алимова и др., 1993) по действию КЖ Streptomyces на семена сорных растений - щирицы и лебеды. Актиномицеты выращивали на среде Гаузе-2 в течение 3-7 суток в колбах объемом 200 мл с постоянным перемешиванием 100-150 об/мин. Отбирали по 150 семян и замачивали в культуральной жидкости (КЖ) или почвенной вытяжке в двух разведениях: 1:100, 1:10. Через 24 часа семена раскладывали на увлажненную фильтровальную бумагу в чашки Петри. Контролем служили семена, замоченные в водопроводной воде и стерильной питательной среде. Через 24 часа подсчитывали всхожесть семян, на 3 сутки подсчитывали энергию прорастания и измеряли длину проростков и корней семян. На 7 сутки измеряли длину проростков и корней семян и определяли сухую и сырую массу проростков и корней.
Фитотоксичность КЖ актиномицетов оценивали по длине, сырой и сухой массе корней и
28
российский журнал прим экологии
проростков сорняков лебеды и щирицы. Семена обрабатывали 3-х и 7-ми суточной КЖ актиноми-цетов, стерильной средой Гаузе как источника питательных веществ. В качестве контроля использовались вода и стерильная минеральная среда Гаузе 2.
Наличие в культуральной жидкости фитоток-синов определяли по ростовым эффектам (по количеству проросших семян и длине проростков и корней). Токсичными считают культуры, вызывающие снижение всхожести семян или угнетения роста проростков и корней не менее чем на 30% по сравнению с контролем.
Также определяли фитотоксичность по действию КЖ Streptomyces на одноклеточную зеленую водоросль C. vulgaris, культура которой была любезно предоставлена из музея института экологии КФУ. Актиномицеты выращивали в чашке Петри на среде Гаузе-1. Хлореллу выращивали на среде Тамия, затем добавляли к акти-номицетам и чашки выставляли в светотеплицу с температурой 26 °С. Через 3-5 сутки инкубирования в светотеплице микроорганизмы - продуценты фитотоксических веществ образуют ясно выраженные зоны отсуствия роста хлореллы.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel. Использовали дисперсионный анализ. Для сравнения нескольких групп между собой применяли критерий Стьюдента. Кроме того, были проведены регрессионный и корреляционный анализы.
Секвенирование фрагмента гена 16S РНК Streptomyces sp. A8 с целью установления его видовой принадлежности, проводили в ЗАО Евроген (г. Москва).
Результаты и их обсуждение
Была исследована антибиотическая активность актиномицетов на бактерии B. megaterium и P. putida, и дрожжи S. cerevisiae. В результате
Таблица 1. Антибиотическая активность актиномицетов
Тест-культуры S. sp. 749 S. sp. A8 M. sp. 77 S. sp. 1 S. sp. 2
Bacillus megaterium + + + - -
Pseudomonas putida - - + - -
Saccharomyces cerevisiae + - - - -
Примечание: зона ингибирвания:
+ есть активность, - нет активности.
были выявлены штаммы актиномицетов, подавляющие их рост (табл. 1).
По полученным нами данным выделенные из разных субстратов штаммы актинмицетов подавляют рост B. megaterium.
Нами исследовалось влияние культуральной жидкости актиномицетов различных изолятов рода Streptomyces, выделенных на территории РТ и Монголии, на угнетение корней и проростков сорных растений - щирицы и лебеды и одноклеточной водоросли хлореллы. В результате проведенного опыта установлено, что подавляющим действием на водоросль обладали штаммы акти-номицетов, представленные в таблице 2.
Таблица 2. Фитотоксичность изолятов культуральной жидкости актиномицетов по отношению к C. vulgaris
Наименование изолята Результаты
S. sp.77 + + +
S. sp.A 8 + + +
S. sp.532 + + +
S. sp. 1 + +
S. sp. 547 +
S. sp. 2 +
Для разведения КЖ в 1:10 и 1:100 показано достоверное ингибирующее влияние на щирицу и лебеду.
Испытания на энергию прорастания семян A. nudicaulis и A. retroflexus, обработанных КЖ актиномицетов, полученной на минеральной среде Гаузе 2 с разведением 1:100, 1:10 показали, что наилучшая всхожесть наблюдалась у семян щирицы запрокинутой с КЖ (разведение 1:10) & sp., & sp. А8 и & sp. 2 и у семян лебеды го-лостебельной с КЖ (разведение 1:10) S. sp. А8. Таким образом, штамм, выделенный из ОСВ с белым фосфором, единственный, не оказывающий фитотоксическое действие на высшие растения (Болормаа и др., 2014).
Рассмотрено влияние комплекса метаболитов штаммов на развитие тест-растений. Наибольшее ингибирующее действие на длину корней лебеды голостебельной оказал штамм X sp. 749 (разведение 1:100). Также ингибирующим действием обладали следующие штаммы: X sp. М. 77, X sp. 1 (1:10), X sp. 2 (1:100, 3 день) (рис. 1). Наибольшее ингибирующее действие на длину проростков лебеды голостебельной оказал штамм X sp. 749 (1:100), хорошим ингибирующим действием обладали
Фитотоксическое воздействие изолятов Streptomyces на длину корней A. nudicaulis на 3 и 7 сутки
I
0,1 0,01 0,1
0,01 0,1 0,01 0,1 0,01 0,1 0,0
3 день 7 день
M.77 A8 S.1 S.2
Фитотоксическое воздействие изолятов Streptomyces на длину проростков A. nudicaulis на 3 и 7 сутки
0,01
F
0,1 0,01 0,1
0,01
3 день 7 день
Фитотоксическое воздействие изолятов Streptomyces на длину корней A. retroflexus на 3 и 7 сутки
0,01
0,01 0,1 0,01
3 день 7 день
Фитотоксическое воздействие изолятов Streptomyces на длину проростков A. retroflexus на 3 и 7 сутки
С 100
s
s
0 50
5 S
а 0
я
1 -50
0,01
0,°1
h
0,01
I 3 день 17 день
Рис.'. Фитотоксическое воздействие Streptomyces на длину корней (вверху) и проростков (внизу) A. nudicaulis на 3 и 7 сутки
Рис. 2. Фитотоксическое воздействие Streptomyces на длину корней (вверху) и проростков (внизу) A. retroflexus на 3 и 7 сутки
0
0
-100
0,01
0,1
0
0
-50
-200
а -100
-300
-150
U -400
-200
-500
-250
-600
-300
M.77
S.1
S.2
S.749
S.749
0
0,1 0,01
0,1
0,1 0,01
-100
0,1
0
0,01 0
0,1 0,01
« -200
S -300
-400
-500
-600
M.77
S.1
S.2
S.749
M.77
S.1
S.2
S.749
также штаммы X sp. 77, £ sp. 1 (3 сутки) (рис. 1).
Рассмотрим воздействие штаммов на рост проростков лебеды. Наиболее стимулирующим действием обладал штамм X sp. А8 (разведение 1:100), а ингибирующим действием - штамм S. sp. 749 (разведение 1:100).
Рассмотрим воздействие актиномицетов на рост корней (вверху) и проростков (внизу) щирицы запрокинутой. Из рисунка 2 видно, что наиболее выраженным ингибирующим действием обладал штамм & sp. 749 (разведение 1:10).
Вес растений замерялся на 7-е сутки после обработки КЖ. В контрольном варианте сырая масса корней сорняка составила 0.36 г, при обработке стерильной средой Гаузе - 0.39 г. Сырая масса проростков составила 0.40 г, при обработке стерильной средой Гаузе - 0.41 г.
Угнетение роста и развития тест-растения связано с наличием среди метаболитов исследованных актиномицетов фитотоксинов. Некоторые токсины вызывают внешне слабо выраженное угнетение роста растений, которое, однако, от-
ражается на биохимических процессах, протекающих в тканях. В таких растениях нарушается химический состав. При большом скоплении токсинов происходит отравление почвы (утомление). На таких почвах развитие растений угнетается, продуктивность снижается, поэтому фитотоксич-ность стрептомицетов представляет не только научный, но и практический интерес.
Штамм А8, выделенный из ОСВ с химическим токсикантом белым фосфором, резко отличается от четырех других штаммов отсутствием выработки фитотоксинов. Столь резкое отличие может быть объяснено двумя основными причинами. Во-первых, высшие растения не встречаются в среде обитания А8 (сточные воды), поэтому адаптации к конкурентной борьбе с ними ему не требуются. В таком случае, фитотоксичноссть у предковых форм А8 отсутствовала еще до внесения белого фосфора в ОСВ. Во-вторых, присутствие белого фосфора делает среду настолько токсичной, что А8 не нуждается в выработке собственных токсинов - конкурентная борьба в такой
3!
российский журннл ориклнлной экологии
среде сильно ослаблена по причине невозможности роста в ней большинства организмов. В этом случае штамм утратил фитотоксичность под влиянием химического загрязнения среды обитания. Способность штамма А8 угнетать бациллы и зеленые водоросли (организмы, постоянно обитающие в ОСВ) делает более правдоподобной первую причину (рис. 3) (Миндубаев и др., 2014 (а)).
Бациллы тоже вырабатывают устойчивость к экстремально высоким концентрациям белого фосфора - до 0.1% (Миндубаев и др., 2014а, b). Следовательно, конкурентная борьба стрептоми-цетов и Bacillus возможна даже в условиях сильнейшего химического загрязнения, что не может не вызывать удивление. То есть вполне возможно, что отсутствие фитотоксичности у штамма А8 определяется сразу обеими причинами.
Рис. 3. Колонии стрептомицетов в культуре одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris. Штамм А8 (вверху справа) подавляет рост хлореллы на значительном расстоянии.
Последовательность гена 16S РНК позволяет приблизительно определить видовую принадлежность штамма А8. Ранее вид определялся при помощи микроскопии (Миндубаев и др., 2015а), но без молекулярно-генетического анализа нельзя утверждать видовую принадлежность. Сочетая два данных метода, можно определить вид, с точностью около 97-98%. Для 100% уверенности нужно просеквенировать полную геномику.
На основании полученных данных по морфологии, видовая принадлежность штамма А8 была определена как Streptomyces xanthocidicus, но данные по геномике ее не подтвердили. Поэтому правильно продолжать называть штамм Streptomyces sp. A8 (Миндубаев и др., 2015 (b)).
Заключение
Наибольшим ингибирующим действием на рост корней и проростков сорняков Atriplex nudicaulis и Amaranthus retroflexus обладал штамм Streptomyces sp. 749. Подавляющим действием на водоросль Chlorella vulgaris обладали штаммы S. sp. 532 и S. sp. 77. Наибольшую антибиотическую активность по отношению к сенной палочке Bacillus megaterium и пекарским дрожжам Saccharo-myces cerevisiae проявил штамм S. sp. 749, а по отношению к Pseudomonas putida - штамм S. sp. М 77, под действием которого рост сократился в 4.5 раз по сравнению с контролем. Вызывает интерес тот факт, что штамм S. sp. А8 совершенно не проявлял фитотоксическое влияние на оба сорняка. Вероятно, это связано с тем, что в среде обитания этого штамма (осадки сточных вод) отсутствуют высшие растения. По этой же причине большинство штаммов стрептомицетов, в том числе S. sp. А8, не подавляли рост пекарских дрожжей. Зато данный штамм эффективно подавляет зеленые водоросли и бациллы - организмы, близкие к обитающим в сточных водах. По всей видимости, влияние внесенного в субстрат экстремального токсиканта белого фосфора в данном случае не было оказано. Однако представители рода Bacillus также вырабатывают адаптации к присутствию белого фосфора работе (Миндубаев и др., 2014b), следовательно, бациллы и S. sp. А8 могут конкурировать. Этим так же объясняется угнетающее влияние S. sp. А8 на B. megaterium.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 14-08-31091 мол а.
Список литературы
1. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Изд-во МГУ, Наука, 2004. 528 с.
2. Миндубаев А.З., Яхваров Д.Г. Фосфор: свойства и применение // Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 39. № 7. С. 1-24.
3. Болормаа Ч., Сапармырадов К.А., Алимова Ф.К., Миндубаев А.З. Сравнение показателей фитотоксичности, фун-гицидной и бактерицидной активности стрептомицетов из различных местообитаний // Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 38, № 6. С. 147-152.
4. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Алимова Ф.К., Яхваров Д.Г. Возможность обезвреживания промышленных стоков, содержащих белый фосфор, при помощи микрофлоры // Российский журнал прикладной экологии. 2015. № 3. С. 42-47.
5. Гаузе Г.Ф. Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М.: Наука, 1983. 258 с.
6. Кузнецов Е.Д. Владимирова М.Г. Железо как фактор, лимитирующий рост хлореллы на среде Тамия // Физиология растений. 1964. Т.11, Вып. 4. С. 615 - 619.
7. Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Егоров С.Ю.
Методические указания к выполнению лабораторных работ по теме: экология микроорганизмов. Казань: Изд-во КГУ, 1993. 37 с.
8. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Ахоссийенагбе С.К., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Панкова А.В., Болормаа Ч., Сапармырадов К.А., Яхваров Д.Г. Белый фосфор как новый объект биологической деструкции // Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 40. № 12. С. 1-26.
9. Миндубаев А.З., Алимова Ф.К., Ахоссийенагбе С.К., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г. Метаболиты и устойчивая микрофлора в субстратах с содержанием белого фосфора 0.1% // Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 37, № 3. С. 67-78.
10. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Сапармырадов К.А., Хаяров Х.Р., Яхваров Д.Г. Включение белого фосфора в природный круговорот веществ. Культивирование устойчивой микрофлоры // Бутлеровские сообщения. 2015. Т. 41, № 3. С. 54-81
A.Z. Mindubaev, K.A. Saparmyradov, F.K. Alimova. Comparison of antagonistic properties of Streptomyces from different biotopes.
Five strains of Streptomyces were compared concerning their antagonistic suppression of test-organisms from various taxonomic groups. Streptomyces were isolated from different habitats that determined the difference in their antibiotic activity. In particular, Streptomyces species А8 strain, isolated from the toxic sludge, contrary to the other ones, did not suppress the growth of the higher plants.
Keywords: Streptomyces; antibiotical activity; phytotoxicity.
32
российский журннл ИМ! экологии
