CC BY
44
УДК: 615.28+577.16: 616-006-092.9
Способность модифицированных витаминов Е и C модулировать терапевтическое действие циклофосфана
А.А. Иванова1, В.В. Иванов1, Н.В. Чердынцева1, Б.А. Шепилова1, Т.В. Кагия2
НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск1 Центр изучения здоровья, г. Киото, Япония2 634009, г. Томск, пер. Кооперативный, 5, e-mail: [email protected]
На мышах линии C57B1/6 с карциномой легких Льюис проведено экспериментальное исследование способности новых модифицированных витаминов с антиоксидантными свойствами - гликозидов витамина Е (TMG) и витамина С (AAG) - модулировать терапевтическую активность циклофосфана. Было показано, что применение циклофосфана в дозе 60 мг/кг совместно с TMG и AAG дает в результате выраженный антиметастатический эффект, который сопоставим с эффектом действия одного циклофосфана в максимальной терапевтической дозе 120 мг/кг.
Ключевые слова: экспериментальные опухоли, модификация цитостатиков.
ABILITY OF MODIFIED VITAMINES E AND C MODULATE THERAPEUTICAL EFFECT OF CYCLOPHOSPHANE A.A. Ivanova1, V.V. Ivanov1, N.V Cherdyntseva1, VA. Shepilova1, T.V Kagia2 Cancer Research Center, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk1 Center for Health Science, Kyoto, Japan2 5, Kooperativny Street, 634009-Tomsk, e-mail: [email protected]
The ability of new modified vitamins with antioxidant effect (glucosides of vitamins E (TMG) and C (AAG) to modulate therapeutic activity of cyclophosphan was investigated in experiments with C57B1/6 mice with Lewis lung carcinoma. Cyclophosphan at a dose of 60 mg/kg in combination with TMG and AAG was found to result in pronounced antimetastatic effect comparable with the effect of cyclophosphan alone at a maximum therapeutic dose of 120 mg/kg.
Key words: experimental tumors, modification of cytostatics.
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый за последнее время в области терапии онкологических заболеваний, во всем мире ведется поиск методов, позволяющих повысить эффективность действия используемых цитостатических препаратов, широко применяемых в онкологии [1, 2]. В процессе решения данной задачи было разработано и обосновано применение большого числа различных модифицирующих воздействий, направленных на усиление терапевтического эффекта цитоста-тических воздействий либо на снижение их токсичности [2, 22]. Среди широкого спектра модифицирующих воздействий достаточно широко используются антиоксиданты с неферментативным действием, которые в основном представлены а-токоферолом и аскорбиновой кислотой. Однако результаты по их применению противоречивы, вплоть до имеющихся сведений по прооксидантному действию витамина С [11].
В связи с этим в последние годы интенсивно развивается направление по использованию модифицированных антиоксидантов.
Японскими учеными разработаны и изучаются оригинальные модифицированные антиоксиданты: гликозиды витамина Е - TMG (2-(а-0-глюкопиранозил) метил-2,5,7,8-тетраметилхроман-6-ол) и витамина С - AAG (аскорбиновая кислота-2-гликозид). Благодаря наличию глюкозы в структуре TMG приобретает способность растворяться в воде и проявлять антирадикальную активность не только в биологических мембранах (липидной фазе), но и в цитоплазме клеток, в отличие от его прототипа а-токоферола [18, 24]. В ряде зарубежных работ показано, что TMG оказывает радиопротектор-ное действие и эффективно защищает ДНК от повреждающего действия гамма-излучения [15, 21, 23], способствует более быстрому восстановлению клеток крови и костного мозга после облучения мышей в сублетальной дозе [10]. Нами ранее показано, что TMG повышает уровень спонтанной и ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов [3].
Гликозид аскорбиновой кислоты имеет ряд преимуществ по сравнению с аскорбиновой
кислотой, он характеризуется высокой устойчивостью к нагреванию и окислительной дегидратации в водных растворах, является эффективной ловушкой ОН- радикала и защищает ДНК [17, 19]. Нами в проведенных экспериментах было показано, что AAG эффективно защищает кровь и костный мозг при облучении мышей в дозе 5,6 Гр и способствует их более быстрому восстановлению. Также получены данные о том, что введение AAG животным, получавшим циклофосфан в токсической дозе 250 мг/кг, предотвращает снижение числа лейкоцитов крови, спленоцитов и клеток костного мозга [9]. Принимая во внимание данные о широком спектре модифицирующих свойств TMG и AAG, целесообразно оценить их влияние на терапевтическую эффективность цитостатиче-ских препаратов.
Целью исследования явилось изучение способности модифицированных витаминов TMG и AAG повышать эффективность циклофосфана.
Материал и методы
Эксперименты проводились на мышах линии С57В1/6, массой 20-22 г, разводки лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется). Животных содержали на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей [4].
В качестве опухолевой модели использовали штамм гематогенно метастазирующей в легкие карциномы Льюис (LLC), полученный из банка опухолевых штаммов РОНЦ РАМН (г. Москва). LLC имплантировалась мышам подкожно в разовой дозе 1х106 клеток. Данная опухолевая модель является адекватной для изучения противоопухолевой и антиметастатической активности препаратов [5].
При терапии экспериментальных опухолей циклофосфан инъецировали внутрибрюшинно двукратно в дозе 120 и 60 мг/кг на 3-и и 7-е сут после трансплантации опухоли. Контролем служила группа мышей, которым по аналогичной схеме инъецировали эквиобъемное количество физиологического раствора.
Водорастворимые гликозиды витамина Е и С были любезно предоставлены проф. Т.В. Кагия (Киото, Япония). TMG вводили внутрибрюшинно в концентрации 100 мг/кг, AAG вводили внутрижелудочно при помощи зонда в концентрации 50 мг/кг. Все препараты вводили в течение 10 дней, начиная со 2-го дня после имплантации опухолевых клеток. Животных выводили из опыта на 20-е сут, забивали под эфирным наркозом, соблюдая правила работы с лабораторными животными [7]. Антимета-статическое действие препаратов оценивалось по следующим показателям: доля животных с метастазами, среднее число метастазов на 1 животное, суммарная площадь метастазов. Вычисляли индекс ингибиции метастазирования (ИИМ, %), процент торможения роста метастазов (ТРМ, %) и торможение роста опухоли (ТРО, %) по формулам:
ИИМ = А В - А В /А В ,
к к о о к к
где Ак Ао - % мышей с метастазами в контрольной и опытной группах; Ак Вк - количество метастатических колоний в легких (в тех же группах).
ТРМ = - S / Зк,
к о к
где Sk, So - площадь метастазов в контрольной и опытной группах.
ТРО = М - М/ М,
к о к
где Мк, Мо - масса опухолевого узла в контрольной и опытной группах.
Все полученные данные подвергались математической обработке с использованием методов вариационной статистики. Вычислялось среднее значение, среднее квадратичное отклонение, ошибка среднего значения. Значимость различий показателей между группами оценивали с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Применение ЦФ в дозе 120 мг/кг приводило к торможению роста опухоли на 34,8 % (табл. 1) и практически полному подавлению метастазирования. Введение циклофосфана в дозе 60 мг/кг
Таблица 1
Влияние модифицированных витаминов TMG и AAG на противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана в дозе 60 мг/кг при терапии карциномы легких Льюис у мышей C57BI/6 (X±m)
Контроль Метастазы ТРМ, % ИИМ, % Клеточность селезенки, 106/мл ТРО, %
Количество, шт. Площадь, мм2
16,7 ± 1,9 28,8 ± 4,7 - - 325,0 ± 13,3 -
ЦФ, 120 мг/кг 1,5 ± 0,5* 0,045 ± 0,005* 99,8 99,9 231,0 ± 9,3* 34,8
ЦФ, 60 мг/кг 6,5 ± 1,2* 8,2 ± 3,4* 71,6 74,3 294,0 ± 10,1 8,7
ЦФ(60)+TMG, 100 мг/кг 2 ± 0,8** 0,6 ± 0,3** 91,5 83 341,0 ± 31,9** 15,2
ЦФ(60)+ЛЛа 50 мг/кг 6,5 ± 1,5 2,9 ± 1,7** 89,9 61 421,0 ± 38,9** 0
Примечания: * - различия статистически значимы с контролем (р<0,05); ** - различия статистически значимы с ЦФ, 60 мг/кг (р<0,05).
не оказывало существенного влияния на рост первичного опухолевого узла, однако снижало количество и площадь метастазов по сравнению с контрольной группой, индекс ингибиции мета-стазирования составил 74,3 %, торможение роста метастазов - 71,6 %. Введение TMG совместно с циклофосфаном в дозе 60 мг/кг приводило к более выраженному торможению роста (ТРМ -91,5 %) и числа (ИИМ - 83 %) метастазов, чем в группе, получавшей только цитостатик. Введение AAG совместно с циклофосфаном в дозе 60 мг/кг приводило к торможению роста метастазов на 89,9 %, метастазирование не изменялось (ИИМ - 61 %). Следует обратить внимание, что в отношении первичного опухолевого узла не выявлено модифицирующего влияния TMG и AAG на эффективность циклофосфана
Антиметастатическая эффективность терапии при введении циклофосфана в дозе 60 мг/кг совместно с антиоксидантами TMG и AAG сопоставима с действием одного циклофосфана в дозе 120 мг/кг. Это свидетельствует о способности TMG и AAG усиливать терапевтическое действие малой дозы цитостатика в отношении метастазов до эффекта максимальной терапевтической дозы.
Поскольку совместное применение цикло-фосфана с TMG или AAG более выраженно ингибирует метастазирование, но не влияет на первичную опухоль, можно полагать, что в данном случае имеет место не прямое действие цитостатика на опухолевые клетки, а торможение метастазирования, опосредованное через иммунную систему. Известно, что уровень витаминов С и Е в крови является
важным параметром, определяющим полноценное функционирование иммунной системы, которое нарушается при их недостатке [13, 14]. Применение аскорбиновой кислоты и а-токоферола при токсических поражениях организма способствует увеличению числа лимфоцитов в периферической крови, усиливает гуморальный иммунный ответ, повышает пролиферативный ответ лимфоцитов в реакции бласттрансформации, а также стимулирует реакцию гиперчувствительности замедленного типа, то есть оказывает иммуномодулирующее действие [6]. Модифицированные витамины обладают подобным действием, о чем свидетельствуют наши данные об их способности защищать клетки селезенки от токсического действия циклофосфана (табл. 1) и о способности TMG повышать уровень спонтанной и ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов [3]. Все это указывает на возможный вклад эффекторов иммунной системы, активированных под влиянием TMG и AAG, в ингибицию процесса метастазирования.
Повышение эффективности цитостатичес-кой терапии опухоли при использовании TMG и AAG в определенной мере может быть связано и с собственным антиметастатическим действием антиоксидантов, поэтому было изучено влияние TMG и AAG на рост и метастазирова-ние экспериментальной опухоли без введения циклофосфана.
TMG и AAG не оказывали влияния на рост первичного опухолевого узла. Введение AAG приводило к выраженному снижению количества и площади метастазов в легких в сравнении
Таблица 2
Влияние модифицированных витаминов TMG и AAG на рост и метастазирование карциномы легких Льюис у мышей C57BI/6 (X±m)
Группы Масса опухоли, Метастазы ТРМ, ИИМ,
животных г Кол-во, шт. Площадь, мм2 % %
Контроль 5,49 ± 0,32 19,5 ± 2,3 10,7 ± 1,5 0 0
TMG 4,96 ± 0,2 24,5 ± 2,17 9,7 ± 0,8 9,3 0
AAG 5,69 ± 0,24 12,2 ± 2,8* 5,4 ± 1,7* 49,5 37,4
Примечание: * - различия статистически значимы с контролем, р<0,05.
с контролем (р<0,05), в то время как введение TMG не оказало видимого влияния на данный показатель (табл. 2). Более выраженный эффект AAG на метастазирование в легкие может быть обусловлен тем, что аскорбиновая кислота является основным компонентом антиоксидантной защиты в этом органе [20, 25].
Известно, что гликолиз является основным источником энергии в клетках опухоли и снижение поглощения и метаболизма глюкозы вызывает окислительный стресс, более выраженный в трансформированных, чем в нормальных клетках [16]. Известно, что аскорбиновая кислота транспортируется в опухолевые клетки в окисленной форме (дегидроаскорбиновой кислоты) с участием транспортеров глюкозы [8]. В условиях окислительного стресса, индуцированного действием метаболитов цитостатика, введение AAG способствует большему поступлению дегидроаскорбиновой кислоты в опухолевые клетки, в результате чего блокируется активность одного из ключевых ферментов гликолиза - гексокиназы [12]. Нарушение метаболизма глюкозы приводит к гибели опухолевых клеток, что, в свою очередь, приводит к снижению количества и площади метастазов. Эффект TMG может быть связан с его иммуномодулирующим действием, обусловленным снижением токсических проявлений циклофосфана на клетки иммунной системы.
Таким образом, результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что использование модифицированных антиоксидантов в комплексной терапии злокачественных опухолей может быть более целесообразно на фоне удаления первичного опухолевого очага, когда
создаются более благоприятные условия для реализации антиметастатического действия препаратов [2]. Полученные данные указывают на перспективность использования модифицированных антиоксидантов в комплексной терапии злокачественных новообразований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Богуш Т.А., Богуш Е.А., Степанов А.А. Современные подходы к повышению эффективности противоопухолевой химиотерапии путем индивидуальной оптимизации лечения и избирательного снижения побочных токсических проявлений цитостатиков // Антибиотики и химиотерапия. 2000. Т. 45, № 1. С. 32-38.
2. Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П. Препараты из растений в комплексной терапии злокачественных новообразований. Томск, 2000. 130 с.
3. Кокорев О.В., ЧердынцеваН.В. Особенности иммунотроп-ной активности водорастворимого аналога антиоксиданта витамина Е - TMG // Биоантиоксидант. М., 2002. С. 272-273.
4. Лабораторные животные / Под ред. Н.Н. Каркищенко. М., 2003. 220 с.
5. Методические рекомендации по доклиническому изучению средств, обладающих способностью ингибировать процесс метастазирования и повышать эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей / Министерство здравоохранения, Фарм. комитет. М., 1992. 16 с.
6. Плецитый К.Д. Экспериментальный анализ иммуностимулирующих свойств витамина А // Бюллетень экспериментальной биологии. 1985. № 11. С. 600-602
7. Софьина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А., Кляйн А. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. М.: Медицина, 1979. 296 с.
8. Agus D.B., Vera J.C., Golde D.W. Stromal cell oxidation: a mechanism by which tumors obtain vitamin C // Cancer Res. 1999. Vol. 59, № 18. P. 4555-4558.
9. Cherdyntseva N., Ivanova A., Ivanov V et al. Glucoside of ascorbic acid modifies efficacy and toxicity of chemotherapy and gamma irradiation // 13th Ann. meeting on the sensitization of cancer treatment. Kyoto (Japan). 2007. P. 17.
10. Cherdyntseva N.V., Shishkina A.A., Butorin I.Y. et al. Effect of Tocopherol-monoglucoside (TMG), a water soluble glycosylated derivate of vitamin E, on hematopoetic recovery in irradiated mice // J. Radiat Res. 2005. Vol. 46, № 1. P. 37^1.
11. D'Andrea G.M. Use of antioxidants during chemotherapy and radiotherapy should be avoided // CA Cancer J. Clin. 2005. Vol. 55, № 5. P. 319-321.
12. Fiorani M., DeSanctis R., Scarlatti F. et al. Dehydroascorbic acid irreversibly inhibits hexokinase activity // Mol. Cell. Biochem.
2000. Vol. 209. P. 145-153.
13. Hodges R., Hood J., Canham J. et al. Clinical manifestations of ascorbic acid deficiency in man // Am. J. Clin. Nutr. 1971. Vol. 24. P. 432-443.
14. Jacob R., Kelley D., Pianalto F. et al. Immunocompetence and oxidant defense during ascorbate depletion of healthy men // Am. J. Clin. Nutr. 1991. Vol. 54. P. 1302S-1309S.
15. Kapoor S., Mukherjee T., Kagiya T., Nair C.K.K. Redox reaction of tocopherol-monoglucoside in aqueous solusions: a pulse radiolysis study // J. Radiat Res. 2002. Vol. 43. P. 99-106.
16. Lin X., Zhang F., Bradbury CM. et al. 2-Deoxy-D-glucose-induced cytotoxicity and radiosensitization in tumor cells is mediated via disruptions in thiol metabolism // Cancer Res. 2003. Vol. 63, № 12. P. 3413-3417.
17. Mathew D., Kagiya T. V, Nair C.K.K. Ascorbic acid monoglycoside as antioxidant and radioprotector // J. Radiat Res. 2007. Vol. 48, № 5. P. 369-376.
18. MuraseH., Moon J.-H., Yamauchi R. et al. Antioxidant activity of a novel vitamin E derivative, 2-(a-D-glucopyranosyl) methil-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol // Free Radical Biol. Med. 1998. Vol. 24, № 2. P 217-225.
19. Nair C.K.K., Parida D.K., Nomura T. Radioprotectors in radiotherapy // J. Radiat. Res. 2001. Vol. 42. P. 21-37.
20. Pathak A.K., Bhutani M., Guleria R. et al. Chemotherapy Alone vs. Chemotherapy Plus High Dose Multiple Antioxidants in Patients with Advanced Non Small Cell Lung Cancer // J. Am. Coll. Nutr. 2005. Vol. 24, № 1. P. 16-21.
21. RajagopalanR., Khalida W., HuigolN.G. et al. Inhibition of gamma radiation induced DNA damage in plasmid pBR322 by TMG, a water soluble derivative of vitamin E // J. Radiat. Res. 2002. Vol. 43. P. 153-159.
22. Robert F., Ezekiel M.P., Spencer S.A. et al. Phase I Study of Anti Epidermal Growth Factor Receptor Antibody Cetuximab in Combination With Radiation Therapy in Patients With Advanced Head and Neck Cancer // J. Clin. Oncol. 2001. Vol. 19, № 13. P. 3234-3243.
23. Satyamitra M., Uma Devi P., Murase H., Kagiya T.V Water soluble vitamin E derivative protects against radiation induced chromosomal damage in mouse born marrow. In: Int. Symp. on Radiation and Homeostasis. Satellite Symp.: Radioprotectors for human health.
2001, Kyoto (Japan). Р 13.
24. ShimanskayaR., Kagiya T., MuraseH. Radioprotective effect of water-soluble vit. E analog (TMG) in vitro and in vivo In: Int. Symp. on Radiation and Homeostasis 2001, Satellite Symp.: Radioprotectors for human health. 2001, Kyoto (Japan). P.12.
25. Wright J.R., Colby H.D., Miles PR. Cytosolic factor with affect microsomal lipid peroxidation in lung and liver // Arch. Biochem. Biophys. 1981. Vol. 206, № 2. P. 296-304.
Поступила 21.01.09
