CC BY
84
АСТРАХАНСКИЙ ВЕСТНИК ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ
№ 1 (27) 2014. с. 149-158.
УДК: 631.523; 575.224; 635.64; 632.38; 097.3; 545.113; 631.528; 575.116
СПОНТАННЫЙ МУТАЦИОННЫЙ ВЗРЫВ, ВОЗНИКНОВЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ РАСТЕНИЙ К ВИРУСУ И ВОЗМОЖНОСТЬ СЕЛЕКЦИИ НА ВИРУСОУСТОЙЧИВОСТЬ БЕЗ ПРИМЕНЕНИЯ ГИБРИДИЗАЦИИ И МЕТОДОВ ТРАНСГЕНЕЗА
Юрий Иванович Авдеев Астраханский Государственный Университет,
Андрей Юрьевич Авдеев Всероссийский научно-исследовательский институт орошаемого овощеводства и бахчеводства, aguav-61@mail,ru
Solanum lycopersicum L., спонтанные мутации, вирус, интеграция, резистентность, мутационный взрыв, гены, признаки, наследование, МГЭ, транспозоны, ретротранспозоны, транспозиции, мутагенез, реверсии, селекция.
У томата Solanum lycopersicum L. в мутантной линии Новичок-мини-]-2 при спонтанном мутационном взрыве в течение 3-х лет фиксировали по 12-14 разных мутаций с частотой 16,75-18,5%, гены которых своей локализацией охватывали не менее 4-6 хромосом. Возникновение гомозиготной устойчивости к экзогеномному вирусу кистевой деформации верхушки стебля томата (ВКДВСТ), который вызывал и сопровождал массовое появление мутаций, зафиксировано со средней частотой 1,08%. Устойчивость наследовалась в поколениях и полно доминировала у гибридов F1. Возникновение резистентности к вирусу авторы связывают с его интеграцией или его фрагментов в форме ДНК в геном томата, экспрессией генов провируса и продуцированием его белков в клетках хозяина. Аналогичное явление известно и зафиксировано как защитный механизм бактерий от фагов. Интеграция провируса или его фрагментов в геноме томата, кроме факта возникновения резистентности, доказывается «приобретением» мутантными линиями наследуемых признаков - увеличения длины стебля в 1,5-2 раза (ген sp+) и сложной кисти (ген s), которые свойственны симптомам вирусной болезни и управляются генами вируса. На основании исследований авторы полагают, что возникновение и эволюция устойчивости к вирусу идет не через случайные геномные изменения ДНК самих растений, а через посредство интеграции в их геном готовых вирусных геномов и их фрагментов в форме ДНК при заражении вирусом.. Будучи перенесенными и «закрепленными» в форме провирусов или их фрагментов и, являясь частью генома растений, они становятся генами устойчивости к данным вирусам, могут передаваться путем скрещивания, претерпевать структурные изменения путем делеций, дупликаций, вставок и т.д., менять свою активность, эффективность и эволюционировать за счет естественного или искусственного отбора. Предполагается, что так произошли доминантные гены устойчивости к ВТМ (Tm, Tm-2, Tm-2a), вирусу желтого скручивания томата (Ty-1, Ty-2), вирусу огуречной мозаики (CMV) и др. Селекция на резистентность к вирусам может вестись путём целенаправленного придания сортам необходимых генов описанным методом без применения гибридизации и существующих методов трансгенеза.
SPONTANEOUS MUTATIONAL BURST, OCCURRENCE OF RESISTANCE TO VIRUS AND POSSIBILITY BREEDING TO VIRUS INFECTIONS WITHOUT USING HYBRIDIZATION AND TRANSGENIC METHODS
Yuiry Ivanovitch Avdeyev,
Astrakhan State University,
Andrey Yurievitch Avdeyev,
All Russian scientific research institute of irrigative vegetable and melon growing
Solanum lycopersicum L., spontaneous mutations, a virus, integration, resistance, mutational burst, genes, properties, inheritance, MGE, transposons, retrotransposons, transposition, mutagenesis, reversion, breeding.
In the tomato Solanum lycopersicum L. at spontaneous mutational burst in the line Novichok-mini-2 within 3 years fixed till 12-14 different mutations with frequency of 16,75-18,5 %, the genes of which were localized in more then 4-6 chromosomes. The arisen homozygous resistance to the exogenous virus VKDVST (TCDTSV - tomato cluster deformation of top stem virus), which caused and accompanied with mass occurrence of mutations, it is fixed with average frequency of
1,08%. The resistance inherited in generations and full dominated in hybrid F1. The occurrence of resistance to virus authors connect with it integration or it fragments in the form of DNA into genome of a tomato, genes expression of a provirus and production proteins in cells of the plant. The similar phenomenon is known and fixed as the protective mechanism of bacteria from phages. The integration of a provirus or its fragments into tomato genome, except for the fact of occurrence of resistance, is proved by "acquisition" by the selected mutant lines the inherited traits - increasing in length of a stem in 1,5-2 times (gene sp +) and a compound cluster (gene s), which are peculiar to symptoms of virus illness and are caused by virus genes. On the basis of researches authors believe, that occurrence and evolution of genetic resistance to viruses goes not through casual genome changes own DNA of plants, but through integrations in their genome the ready virus genomes or their fragments in the form of DNA. Being transferred and "fixed" in the form of provirus or fragments and, being a genome parts ofplants, they become genes of resistance to the given viruses. They can be transferred by crossing, undergo structural changes by deletions, duplications, insertions, etc., to change the activity, efficiency and be subjected evolution due to natural or artificial selection. It is supposed, that so there were occurred genes of resistance to TMV (Tm, Tm-2, Tm-2a), to a virus of tomato yellow leaf curl (Ty-1, Ty-2), cucumber mosaic (CMV) etc. Breeding of varieties on resistance to viruses, can be conducted purposefully by the described method without hybridization and. used transgenic methods.
Мутационный взрыв, как новое явление у культуры томата вида Solanum lycopersicum L., было описано нами в предыдущих работах [2,17]. Оно было вначале зафиксировано в 2009 г. одновременно с сильным естественным поражением растений выровненной мутантной линии Новичок-мини-_]-2 вирусом кистевой деформации верхушки стебля томата (ВКДВСТ). Вирус стал основным фактором индуцирования массового появления мутаций, что подтвердилось и в последующих поколениях растений.
Пораженные растения удлиняют стебель в 1.5 -2 раза, а простое цветочное соцветие превращается в разрастающуюся в сложную и многосложную деформированную верхушечную удлиненную кисть или ее рудименты. Болезнь вызывалась экзогенным вирусом, предавалась через семена, а также контактно через листья соседним растениям других сортов [3]. Мутационный взрыв наследовался во всех изучаемых последующих поколениях мутантов. Ежегодно фиксировалось 12 -14 мутаций доминантных и рецессивных признаков, которые были обусловлены генами, локализованными не менее чем в 4 -6 хромосомах. Характер поражения растений томата ВКДВСТ и некоторые из мутаций по форме, размеру, окраске плода и типу кисти можно видеть на рисунках 1 -4. Всего в 2010-2012 г.г. было зарегистрировано 12 рецессивных и 9 доминантных мутаций. Общая частота мутаций колебалась от 16,75 до 28,50 %, а в среднем составила 22,82% за поколение или 1:4,4 растения, в том числе доминантных -12,53 и рецессивных - 10,29% [17]. Частота возникновения мутаций при мутационном взрыве у томата превысила спонтанную 1:10 5-1:106 [7,8], зафиксированную у эукариот в естественных условиях, в том числе у растений, в 22,7 -227,3 тысяч раз. Число стабилизированных потомств составляло от 10 до 20%[2]. В числе более 20 возникавших мутаций были отобраны растения, а затем изучены линии, устойчивые к вирусу ВКДВСТ. В настоящей статье более подробно излагаются и обсуждаются результаты исследований, связанные с возникновением у томата устойчивости к вирусу и возможность создания резистентных сортов к такого типа инфекциям без применения гибридизации и существующих методов трансгенеза.
Методика и условия проведения опытов. Исходная линия томата Новичок-мини-_]-2 вида Solanum lycopersicum L. характеризовалась генами sp (детерминантный куст), о (сливовидный плод), j-2 (отсутствие сочленения в плодоножке), и (однородная окраска незрелого плода). Её выращивали в аридных условиях Астраханской области путём индивидуальных отборов растений и изучения их потомств по стандартной технологии возделывания в условиях орошения [6]. Особенность аридных условий состоит в летних
дневных температурах до 44о, нагрева почвы до 60-65оС, снижения относительной влажности воздуха в полуденные часы до 13-16%.
Структура цветка изучаемого томата характеризуется коротким столбиком, спрятанным в сросшейся колонке тычинок, что исключает перекрёстное опыление. Критериями отбора мутаций являлись: 1) обнаружение единичных растений - генетических новообразований, в которых был изменен один или несколько отличимых от исходной формы признаков. Обращалось внимание на то, что мутантное растение сохраняет основной комплекс признаков исходной формы, кроме мутантных. 2). В потомстве мутанта отсутствует гибридный тип расщеплений. Это исключает вероятность гибридного происхождения мутантного растения. Все отобранные мутантные, а также не мутантные растения ежегодно описывали по фенотипу, а их потомства анализировали по наличию возникших мутаций.
Для возникающих мутаций у томата нами использованы соответствующие символы генов, принятые в генетике томата для обозначения аналогичных мутаций в мировой коллекции мутантов [21]. Сверка соответствия возникших в опытах мутантных признаков с их описанием в генетической коллекции проведена по полному последнему изданному каталогу Центра генетических ресурсов томата [28]. Все обнаруженные нами мутантные гены, за исключением 2-х, используются в селекции сортов томата, присутствуют в коллекционных образцах и их идентификация не представляет трудностей. Привязка возникших в опыте спонтанных мутантных генов к хромосомам осуществлена согласно классической карте последнего полного варианта её издания [26] c поправкой, которая коснулась локализации гена j-2 в 12, а не в 11 хромосоме, после работ V.A. Tuinen et al [29] и издания TGC в 2006г. [20]. Локализация 4-х генов на хромосоме 2 приводится по генетической карте, пересмотренной и уточнённой G. Bishop et al. [18].
Устойчивые к вирусной болезни растения отбирали индивидуально у потомств мутантных растений в 2011 г. В следующем году потомства отобранных резистентных растений высевали на отдельных делянках рядом (через один ряд) с потомствами пораженных вирусом растений для гарантирования контакта с инфекцией ВКДВСТ.
Результаты исследований и их обсуждение. У мутантных потомств томата Новичок -мини-]-2 в 2011 г. при массовом поражении растений ВКДВСТ в 22 линиях провели отборы и описание здоровых растений, не проявляющих каких-либо симптомов вирусной болезни. Они с трудом обнаруживались в нижнем приземном ярусе общей вегетативной массы сформировавшихся растений, так как не могли конкурировать с пышной буйно разрастающейся вегетативной массой больных растений. Одна линия была со слабой выраженностью симптомов. В 13 линиях сильно выраженные симптомы болезни ВКДВСТ достигли 100%, у остальных, кроме одной, близко к 100%. Из 400 растений (10 линий) отобрано 6 устойчивых или 1,50%. Кроме того, из 1040 растений (11линий), выявлено 7 непораженных растений, что составило 0,67%. Средняя частота возникновения мутантных растений, устойчивых к ВКДВСТ, составила 1,08%. Она сопоставима или же ниже в сравнении с мутациями ряда других изученных признаков томата. Отобранные устойчивые растения не могли являться результатом возникновения безвирусных семян, так как растения, выросшие из них, находясь в тесном контакте с листьями больных растений, обязательно бы перезаразились.
Изучение потомств индивидуальных отборов устойчивых растений в 2012г. показало, что они наследуют резистентность у 100% растений, то есть исходные отборы являлись гомозиготами по данному признаку.
Высокая частота мутаций по учитываемым морфологическим признакам фиксировалась как у больных ВКДВСТ, так и у устойчивых непораженных линий. Мутации затрагивали 13 признаков, в том числе у резистентных растений 10. В опыте мы фиксировали мутации, но не проводили учёт частоты их возникновения по параметрам длины стебля (sp,sp+), типу кисти (s,s+) и скороспелости. У 259 резистентных растений мутации были подсчитаны по 7 признакам. Согласно данным учета частота мутаций по отношению ко всем растениям устойчивых линий составила 27,80%, в том числе: по типу плодоножки (j+) - 0,39%, окраске эпидермиса плода (y+) - 10,04%, полосатой окраске плода (gs) - 4,25%, восстановленной
красной его окраске ^+) - 5,40%, наличию зелёного пятна в основании незрелого плода( u+) -6,18%, округлой форме плода (o+) - 0,77% и увеличенному его размеру - 0,77%. Доминантные признаки возникли с частотой 22,78 %, а рецессивные 5,02%. Мутации известных по локализации генов у резистентных линий зафиксированы в хромосомах: 1(у+), 2(о+), 6^р),
7№&+)Л0(и+), 12(т+).
К особенностям мутаций, изученных в 2012 г., следует отметить факт: в устойчивой линии №257 доминантные мутации gs+,u+ возникли одновременно у 14 растений, а у остальных 34 растений исходный генотип gs,u сохранился. Эти гены локализованы соответственно в 7 и 10 хромосомах [26]. Можно предполагать вероятность возникновения сцепленной локализации генов. У отдельных высокорослых линий возникли детерминантные средне- и низкорослые растения. В 2013 г. все резистентные линии сохранились бессимптомными и продолжали мутировать, в т. ч. с появлением новых мутаций - жёлтый плод, ещё более укрупнённый округлый плод, низкий куст, сильно выраженный клювик на вершине плода, удлинённая цилиндрическая форма плода, штамбовые и картофелелистные растения. У гибрида F1 (Устойчивая линия х сорт Обольститель) полно доминировала устойчивость к ВКДВСТ. На фоне сильного естественного поражения альтернариозом (Altemaia solani Sor.) растений большой коллекции сортов и селекционных образцов все устойчивые к ВКДВСТ линии в опытах 2013 г. этой грибной болезнью не поражались.
Исследования показали, что приобретение устойчивости растений к ВКДВСТ не прекращает массовое появление мутаций, Это свидетельствует о том, что причина возникновения мутаций у растений сохраняется.
Известно, что основной причиной моногенных мутаций при спонтанном мутагенезе у эукариот является перемещение по геному мобильных генетических элементов, в частности, транспозонов, являющихся ДНК-овыми структурами хромосом [10]. Поэтому появление точковых моногенных мутаций при спонтанном мутагенезе и мутационном взрыве рассматриваются нами, главным образом, как результат перемещения транспозонов [1,2]. Данное положение обосновывается и тем, что к точковым мутациям относят 3 генетических изменениям гена: 1) делеции; 2) замена пары оснований (трансзиции и трансверсии); 3) инсерции или включения, способные перемещаться у эукариот из одного сайта хромосомы в другой [13]. Первые две причины точковых мутаций исключаются. Поскольку у томата гомозиготы по делециям летальны, то они не могут быть связаны с рассматриваемым явлением. Дупликации генов, повторы нуклеотидов в регуляторных областях, а также вставки нуклеотидов, вызывающие сдвиг рамки считывания, и другие структурные изменения генома, хотя и ведут к появлению мутаций, но их фенотипическое проявление другого типа как при мутациях, так и, особенно, при реверсиях генов. Особенностью реверсий или репараций при точковых мутациях, связанных с заменой пар оснований, является то, что они всегда происходят закономерно с более низкой частотой, чем сами мутации [8] и ревертанты при этом появляются в 10 раз реже, чем сами мутации [13]. У наблюдаемых нами фенотипов с точковыми мутациями генов частота реверсий превосходила частоту самих мутаций, что исключает замену пар оснований ДНК как существенную причину мутаций.
Специфика наблюдаемых нами в течение 4-х лет спонтанных точковых мутаций у растений состоит в блокировании - разблокирования генов (доминантный - рецессивный -доминантный) на уровне целого организма, в том числе в сменяющихся поколениях генотипов мутантов sp-sp+-sp, у+- у -у+, ]+ - ]-2 -/+. Это дает основание считать участием в спонтанном мутагенезе томата транспозонов половых клеток (ТПК). Такое название им дано нами [2,17] в связи с тем, что перемещение ТПК завершается в половых клетках и зиготе, в отличие от описанных транспозонов соматических тканей [13,24], названных контролирующими элементами (КЭ) и проявляющими себя в форме химерной соматической пятнистости органов растений- зерна, листьев, цветка [15,24].
Некоторые исследователи в эволюции растений наибольшую роль отводят ретротранспозонам, являющимися преобладающими в геноме, а также транспозонам [14]. Из последних до недавнего времени у растений были подробно изучены и упоминаются только
КЭ. Различия ретротранспозонов и транспозонов состоят в характере взаимодействия с геномом эукариот. Транспозоны, являются перемещающимися в хромосомах ДНК-овыми структурами [10], а ретротранспозоны при включении их в геномы хозяина в форме ДНК стабилизируются в них и горизонтально не перемещаются, Перемещение возможно через процесс реинтеграции и с низкой частотой [16].
Роль влияния вируса на геном растений исследована недостаточно. Тем не менее, вирус хорошо известен как мутагенный фактор, активатор и как переносчик мобильных генетических элементов у дрозофилы и других эукариот [9,15] и его стрессовое влияние на геном объясняет индуцирование перемещений транспозонов в наших опытах. Однако возникновение мутаций устойчивости томата в ВКДВСТ несомненно имеет другую природу, что заслуживает обсуждения.
Из данных проведенных экспериментов следует, что само проявление заболевания -поражение растений ВКДВСТ - не является причиной возникновения мутаций. Причина состоит во взаимодействии геномов вируса и растения, которое повлекло за собой нарушение геномного баланса растения и вызвало поток мутаций или мутационный взрыв. Такой формой взаимодействия геномов томата и вируса могла быть и, по-видимому, имела место интеграция вируса ВКДВСТ в форме ДНК в геном томата Новичок -мини -]-2, что резко нарушило геномное равновесие.
Подтверждением интеграции вируса в геном томата в нашем опыте служит приобретение мутантными растениями и линиями признака сложной кисти (ген s), а также значительное увеличения длины стебля растений томата (ген sp+). Носителем генов этих признаков является ВКДВСТ, так как аналогичные фенотипические изменения наблюдаются у растения томата при поражении их вирусом. Кроме того, само возникновение резистентности растений к вирусу ВКДВСТ в нашем опыте подобно известной закономерности возникновения резистентности к фагу при лизисе бактерии. Профаг, находящийся в геноме бактерии, обеспечивает ей иммунитет к исходному фагу [13].
В наших экспериментах вместе с устойчивостью к ВКДВСТ одновременно приобретались гены ж и sp+. На рис. 1, 2 и 4 можно видеть типичные симптомы болезни и признак сложной кисти, стабилизировавшейся в потомстве отдельных резистентных и поражаемых линий.
Предполагается, что интеграция вируса ВКДВСТ в форме ДНК произошла в хромосоме 2, где локализован ген ж+. Именно в ней происходило наибольшее число мутаций на участке 30 -70сМ. В тоже время, очевидно, не каждая интеграция вируса и его фрагментов приводила к возникновению устойчивости к ВКДВСТ, так как гены, обуславливающие симптомы болезни вируса - сложная кисть, длинный стебель, передавались также и сильно поражаемым растениям. Имеются основания предполагать, что гены, обуславливающие специфические признаки - длинный стебель и сложная кисть, были «захвачены» провирусом при его разинтеграции из генома L. pimpinellifolium. Сильное заболевание этого дикого вида ВКДВСТ было зафиксировано нами в коллекции томата ВИР [3].
Горизонтальный перенос вирусом генов ж и sp+ отличается от явления горизонтального перенесения гена gs (полосатость плодов, хр.7) у томатов, которое мы описали в ранних наших работах и связали с ретротранспозоном [4, 5]. В описанном случае не наблюдалось каких-либо признаков вирусного или иного заболевания. Ген gs горизонтально передавался ряду сортов без других генетических влияний при полном сохранении их исходного генотипа. Как правило, вначале фиксировалось появление гена gs на плодах одного побега, на одной - двух кистях, одном или нескольких плодах (рис.5), а затем появлялись gs- растения. Аналогичное редкое явление было зафиксировано нами и по гену и+ в генотипе растений с геном и , а также по гену /+ в генотипе растений с геном /-2 (рис.6). Описанный тип «заражения» растений томата генами gs, u+, ]+ отличается от системного единовременного поражения всего растения и контактирующих растений вирусом ВКДВСТ, а также от массового возникновения мутаций.
Наши исследования дают основание по-новому взглянуть на эволюцию генов устойчивости к вирусным болезням и на возможности селекции на иммунитет к ним. Существует огромное количество вредоносных вирусов, с одной стороны, а в генофондах
растений обнаружены гены устойчивости к некоторым из них. Все они природного происхождения. Существующая теория их происхождения и эволюция как процесс многократных случайных мутаций непосредственно в геноме растений, не может объяснить появление у растений структурно - сложных генов. Использование индуцированного мутагенеза не способно решить задачу создания иммунных растений. Результаты проведенных исследований позволяют полагать, что возникновение устойчивости и эволюция этого признака идет через интеграцию в геномы растений готовых структур вирусов в форме ДНК. Благоприятная интеграция вируса или его фрагмента в форме ДНК в хромосому растения -хозяина обуславливает экспрессию определенных генов и образование белков вируса в клетках растений, создает иммунитет к конкретному вирусу. Природа такой резистентности изучена недостаточно, но ясно, что растения с синтезом протеинов вируса в течении всей вегетации готовы противостоять внедрению вируса.
Эволюция признака устойчивости растений к вирусу после интеграции его в форме ДНК в геном растений может идти во многих направлениях. Провирус может стать постоянным геном или сочетанием небольшого блока генов в составе генома растений, претерпевать рекомбинации, дупликации, усиливать или ослаблять свои свойства, передаваться путем скрещивания другим растениям и видам. Устойчивость к разным вирусам и штаммам может накапливаться в отдельных растениях. При этом могут происходить многократные мутации генов устойчивости, в т.ч. не только за счет изменения структур генов, но и перемещения транспозонов в хромосомах. Это может менять эффект устойчивости генов к вирусам, изменять свойства устойчивости к новым штаммам.
С другой стороны, эволюция генов устойчивости подвергается отборам эволюционирующих вирусов, которые меняют свои свойства вирулентности. В результате мутаций, гибридизации, рекомбинаций, появляются их новые виды и штаммы. При взаимодействии геномов вирусов и растений в потомстве последних в результате естественного отбора сохраняются наиболее эффективные ДНК-включения провирусов, функционирующие как гены или блоки генов растений, обеспечивающими им иммунитет.
Таким образом, возникновение признака устойчивости растений к вирусам может происходить как быстрый одномоментный акт включения вируса или его фрагментов в форме ДНК в геном растения в процессе системного заражения растения- хозяина. При этом если интеграция ДНК вируса в геном хозяина происходит несколько раз, что возможно у эукариот [15], то может возникнуть несколько генов устойчивости, в т.ч. в разных хромосомах. Дальнейшая судьба «вирусных генов» устойчивости в растениях будет зависеть от случайных факторов эволюции их геномов.
Авторы считают, что так произошли и эволюционировали многие гены устойчивости, в частности, у томата к вирусу табачной мозаики (Tm,Tm-2, Tm-2a), вирусу желтого скручивания ^у^Ду^), вирусу огуречной мозаики (CMV) и другие. Как показали исследования по генной инженерии, для создания защитного механизма против вирусов оказалось достаточным перенести в геном растений ген его белковой оболочки. Например, ген, кодирующий капсидный протеин вируса желтого листового скручивания (TYLKV), перенесенный в томат, приводит к устранению симптомов заболевания. Растения в потомстве экспрессировали огромное количество протеина и были устойчивы к TYLKV [27]. Высокая устойчивость томата к вирусу огуречной мозаики была достигнута путем трансформации гена протеина оболочки этого вируса в растения. Продуктивность растений резко возрастала, увеличивался и вес плода. Подобный результат повышения устойчивости к вирусам получен авторами после трансгенеза в растения генов протеина оболочки разных вирусов и у бахчевых растений [22]. Технология по трансгенезу генов протеина оболочки вируса используется в селекции различных культур [27].
Наши исследования показали, что генетическая устойчивость к вирусу может возникнуть спонтанно в результате естественного заражения или, несомненно, при искусственном инфицировании растений. Одним из условий успеха, вероятно, является свойство вируса передаваться через семена подобно вирусу ВКДВСТ. В случае направленной селекции после инфицирования в потомствах растений важно выделить те линии, в которых отмечается
массовое появление мутаций. Для этого заготавливают семена от индивидуальных сильно пораженных растений. Потомства каждого из 40 -50 потомств высевают по 50-80 растений и анализируют на появление у растений отдельных признаков, свойственных вирусному заболеванию, а также массового появления мутаций. У всех сортов томата легко обнаружить доминантные - sp+t/+,u+,o+,y+,d+, и рецессивные - spj-2,u,o,elj-2,bk,d,... мутации. Массовое появление растений с мутациями или мутационный взрыв, а также обнаружение у растений отдельных признаков вирусного заболевания (проявление генов вируса), может произойти только при сильном стрессе - нарушении геномного баланса, что связано не просто с заражением растения, а с интеграцией вируса в форме ДНК в геном растений. В таких потомствах следует искать устойчивость к данному вирусу. Дополнительным индуцирующим фактором стресса у томатов являются высокие температуры в период высадки рассады (2 декада июля). Предлагаемый вариант селекции отличается от существующего селекционно -генетического подхода тем, что устойчивость к вирусу не ищут в генофонде культуры, а ее там может и не быть, а создают на основе новой предлагаемой биотехнологии селекции без применения гибридизации и существующих методов трансгенеза.
Биохимический механизм защиты растений от вирусов, по-видимому, связан с выработкой защитных веществ клетками растений в ответ на постоянное присутствие синтезируемого чужеродного белка (белков) и вследствие этого постоянную готовность растения к атакам паразита. Известно, что привнесение белков оболочки вируса в геном растения приводит к ингибированию процесса его разборки, которое необходимо для высвобождения вирусной РНК для последующей её репликации [23 ].
Можно предполагать, что биохимический механизм защиты растений не только к вирусам, но и другим различным патогенам в природных условиях может формироваться подобным образом. Вирус, способный поражать геномы растений и инфекционного гриба, а также интегрироваться в их хромосомы в форме ДНК, может захватывать гены гриба, в т.ч. обуславливающие его вирулентность, и переносить в геном растения. Это создает возможность растениям экспрессировать гены гриба, синтезировать их белки и накапливать защитные вещества, токсичные для паразита. О том, что в принципе такой процесс эволюции и, вероятно, селекции устойчивости возможен, свидетельствуют данные исследований, показавшие, что существует горизонтальный перенос генов между растениями и грибами. Исследователями обнаружено 5 событий переноса генов грибы -растения и 4 с направлением растения -грибы [25].
Использование спонтанного мутагенеза при создании новых сортов на основе вируса ВКДВСТ позволяет в 1,5 -2 раза ускорить и удешевить селекционный процесс. Данный вирус может быть применён для инфицирования разных образцов томата и получения положительного эффекта не только в повышении устойчивости к вирусу, но и для улучшения сортов по более чем 10 хозяйственно-ценным признакам, обусловленным доминантными и рецессивными мутантными генами ]-2, d, c, у, u, o, o+, с1, s, sp, sp+ и др. без изменения базисного генотипа сорта.
Создание одного гетерозисного гибрида томата для защищенного грунта обходится в 9 млн. руб. [12]. При этом в качестве исходного материала, как правило, используются готовые родительские линейные сорта, проводятся скрещивания, а затем испытание, оценка и отбор лучших гибридных комбинаций. Выведение одного наукоемкого линейного сорта томата для открытого грунта обходится дороже. Например, создание во ВНИИОБ сортов Астраханский, Бахтемир и Рекордсмен с комплексной устойчивостью к 3 -4 болезням за 15 лет работы потребовало затрат по каждому сорту в 2 -3,5 раза больше - до 18-30 млн. руб. Селекция одного геномодифицированного сорта обходится от 50 до 300 млн. долл. (1,5-9,0 млрд. руб.) и занимает 6-12 лет селекции [11]. Доработка и применение нового метода селекции на основе проведенных работ по спонтанному мутагенезу позволит снизить затраты на создание сорта не менее чем в 2 раза в сравнении с обычной селекцией и в 150-900 раз в сравнении генноинженерными методами.
Рис.1. Растения, поражённые ВКДВСТ
Рис. 2. Редуцированные кисти поражённых растений ВКДВСТ
НІ В I I і 9 1 Я II
•1«§оА
еоо» О
Рис. 3. Слева ряд (3 плода) исходные, справа плоды некоторых мутантов
Рис. 5. Кисть, несущая нормальные плоды и плоды с геном gs
Рис.4. Справа и слева кисти мутанта №184, в центре 4 кисти исходной формы
У
*
Рис. 6. Кисть линии j-2, несущая один плод с плодоножкой j+
1.Авдеев Ю.И., Авдеев А.Ю. Генетическое обнаружение транспозонов половых клеток у спонтанных мутантов Solanum lycopersicum L. и селекция растений //Астраханский вестник экологического образования. №2 (№24). 2013. С.103-110.
2.Авдеев Ю.И., Авдеев А.Ю.Спонтанный мутационный взрыв в потомстве двукратного мутанта Solanum lycopersicum LV/Селекция на адаптивность и создание нового генофонда (1V Квасниковские чтения) Методическая н.-п. конф. Матер. докл. и сообщений. ВНИИО. 2013. С.7-14.
3.Авдеев Ю.И., Авдеев А.Ю., Кигашпаева О.П., Иванова Л.М. Вредоносные вирусы на томатах в Астраханской области// Вестник российской академии сельскохозяйственных наук. №1. 2013. С.49-52.
4.Авдеев Ю. И., Кигашпаева О.Р. Прыгающий ген gs Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farm //Генетика. Т. 38 №5. 2992. С.607-612.
5.Авдеев Ю.И., Кигашпаева О.П., Авдеев А.Ю. Явление спонтанного горизонтального переноса или миграции гена растений, локализованного на генетической карте. // Матер. межд. н.-п. конф. «Состояние и перспективы развития агрономической науки. - Т. 1. - ДОНГАУ. Пос. Персиановский. 2007-А. С. 75-85.
6.Авдеев Ю.И., Коринец В.В., Байрамбеков Ш.Б., Бочаров В.Н. и др. Рекомендации по возделыванию сельскохозяйственных культур при капельном орошении в Астраханской области. М. -2003. -44с.
7.Айала Ф., Кайгер Д. Современная генетика. Т.3. 1998. -254с.
8. Алиханян С.И., Акифьев А.П., Чернин Л.С. Общая генетика. М. 1985. -446с.
9.Голубовский М.Д. Организация генома и формы наследственной изменчивости у эукариот //В кн. Молекулярный механизм генетических процессов: молекулярная генетика, эволюция и молекулярно-генетические основы селекции. М. Наука. 1985. С.146-162.
10.Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Сибирское университетское издательство. Новосибирск. 2007. -478с.
11.Лебедев В. Миф о трансгенной угрозе //Наука и жизнь. №11. 2003. С.66-73.
12.Литвинов С.С., Лудилов В.А. Проблемы семеноводства овощных и бахчевых культур в России. Изд. РАСХН. ВНИИО. 2009. 22с.
13.Льюин Б. Гены. Пер. с англ. под ред. Георгиева Г.П. М. Мир. 1987. -544с.
14.Сергеев Е.М., Салина Е.А. Мобильные элементы и эволюция генома растений //Вавиловский журнал генетики и селекции. Т.15. №2. 2011. С.382-396.
15. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. Наука. 1984. -472с.
16.Юрченко Н.Н., Коваленко Л.В., Захаров И.А. Мобильные генетические элементы: нестабильность генов и геномов //Вавиловский журнал генетики и селекции. Т.2. 2011. С.261-270.
17.Avdeyev Y.I., Avdeyev A.Y. The spontaneous mutational burst, which has captured genes of six chromosomes Solanum lycopersicum L. International journal of applied and fundamental research. Issue 2. 2013. www.science-sd.com
18.Bishop G., Thomas C. and Jones J. Location of Dwarf on the classical and RFLP maps //TGC Report. №47. 1997. Р.10-12.
19.Brunetti A., Tavazza M., Noris E. et al. High expression of truncated viral rep protein confers resistance to tomato yellow leaf curl virus in transgenic tomato plants //Molecular plant-microbe interactions, 10, 1997. P. 571-579.
20.Chetelat R.T. Revised list of monogenic stocks //Report of the tomato genetics cooperative. №56. 2006. Р.37-56.
21.Chetelat R.T. Revised list of monogenic stocks // TGC Report. № 61. 2011. P. 42-64.
22.Fuchs M., McFerson J.R., Tricoli D.M. et al. Cantaloupe line CZW-30, containing coat protein genes of cucumber mosaic virus, zucchini yellow mosaic virus, watermelon mosaic virus-2 is resistant to these three viruses in the field. //Molecular Breeding, №3. 1997. P.279-290.
23.Hefferon K. L. Transgenic plants//Biotechnology. Agricultural biotechnology. Eds. H.W. Doell, S. Roken. V.8. 2009. P. 144-168.
24.McClintock B. Controlling element and the gene //Cold Spring Harbor Symposium. Quant.Biol. V.21. 1956.
197p.
25.Richards Thomas A., Soanes Darren M., Foster Peter G .et al. Phylogenomic analysis demonstrates a pattern of rare and ancient horizontal gene transfer between plants and fungi // Plant cell. №21. 2009. Р.1987-1911.
26.Rick C.M., Mutschler M., Tanskley S. Linkage maps of the tomato//TGC Report №3. 1987 .Р.5-34.
27.Salamini F. Biotechnology and molecular biology in practical horticulture // Proceeding in the XXV international
horticultural congress. Peat 2. Acta horticulture. №521. 2000. P.15-40. 20.
28.Tomato Genetics resource Center - List of Gene Names and Symbols. http:// tgrs.ucdavis. edu/Data/Acc/Genes.aspx 26.06. 2010. P.1-67.
29.Tuinen V.A., Petters A.H., Koornneef M. Mapping of the pro gene and revision of the classical map of hromosome 11 // TGC Report. N48. 1998. P.62-70..
