CC BY
77
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СПОНТАННАЯ И ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ... 93
УДК 616.248:611.018.53:577.112
1 2 о 13 1
А.В.Караулов , НЮ. Анисимова , Ю.И. Должикова , С.И.Сокуренко ' , В.ФЛиков ,
Т.В. Борисова , М.В. Киселевский2
СПОНТАННАЯ И ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ ЛЕЙКОЦИТАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ В СТАДИИ ОБОСТРЕНИЯ
Первый Московский государственный медицинский университет имени ИМ. Сеченова, Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 383 КБ ФМБА России
Контактная информация:
Караулов Александр Викторович, профессор, член-корр. РАМН, заведующий кафедрой клинической иммунологии и аллергологии
адрес: 119992, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2; тел. +7(495)395-64-97; e-mail: [email protected]
Статья поступила: 19.08.2010, принята к печати 16.09.2010.
Резюме
Цитокины играют важную роль в патогенезе астмы, участвуя в формировании аллергического воспалительного ответа. Особое значение при аллергических заболеваниях имеет определяемый цитокинами баланс двух основных типов Т-хелперов: Th1 и Th2. Целью настоящего исследования было изучение уровня сывороточных цитокинов, а также их спонтанной и индуцированной продукции лейкоцитами периферической крови у больных бронхиальной астмой в стадии обострения. Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют
о том, что у больных бронхиальной астмой в стадии обострения отмечаются повышенные концентрации в крови, как про- так и противовоспалительных цитокинов. Данные изменения цитокинового профиля сопровождаются увеличением спонтанной продукции медиаторов воспаления, при этом стимуляция синтеза и секреции цитокинов у больных бронхиальной астмой, в отличие от здоровых доноров не всегда приводит к повышению их индуцированной продукции.
Ключевые слова: цитокины, бронхиальная астма.
A.V Karaulov1, N.Yu. Anisimova2, Yu.I. Dolzhikova2, S.i. Sokurenko1,3, V.F. Likov1, T.V. Borisova1, M.V. Kiselevskf
SPONTANEOUS AND INDUCED CYTOKINES PRODUCTION BY PERIPHERAL BLOOD LEUKOCYTES
1IN PATIENTS WITH BRONCHIAL ASTHMA
JI.M. Sechenov State Medical University, Moscow
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
3Hospital№83, Moscow
Abstract
The role of cytokines in asthma pathogenesis is well documented. The balance between two types T-helpers, Th1 and Th2, is the main player in allergic diseases. The aim of our study was to measure the level of serum cytokines depending on spontaneous or induced release by peripheral blood leukocytes in patients with bronchial asthma at the acute condition of disease. The data obtained indicate that the level either pro-inflammatory or anti-inflammatory cytokines was increased in patients with bronchial asthma at the acute condition of disease. We observed the elevate level of spontaneous production of inflammatory mediator. Moreover, the stimulation of cytokines synthesis and release in patients with bronchial asthma does not resulted in increased induced level of cytokines in differ from healthy donors.
Key words: cytokines, bronchial asthma.
Введение
Цитокины играют важную роль в патогенезе астмы, участвуя в формировании аллергического воспалительного ответа. Особое значение при аллергических заболеваниях имеет определяемый цитокинами баланс двух основных типов Т-хелпе-ров: Th1 и Th2 [5; 7].
Исследования последних десятилетий показали, что в механизм развития астмы вовлечены многочисленные цитокины и хемокины [1-6; 13] В то время как провоспалительные цитокины, такие как ИЛ-1, ФНО-a и ИЛ-6, индуцируют воспалительные процессы, цитокины Th2- типа (ИЛ-4, ИЛ-
5, ИЛ-9) и ИЛ-13 участвуют в развитии аллергических состояний [13].
Особое значение при астме придается ИЛ-4, который регулирует аллергические реакции за счет индукции дифференцировки Т12 клеток и синтеза ^Е [14]. ИЛ-5 участвует в эозинофильном воспалении, его значимость в этом процессе подтверждается тем, что блокада этого цитокина моноклональными антителами ингибирует эозинофильную инфильтрацию дыхательных путей. [7; 9; 10].
Ь-13 также как ИЛ-4 модулирует продукцию ^Е, но, в отличие от ИЛ-4, это не влияет на диффе-ренцировку Т-клеток [15]. ИЛ-9 менее исследован, чем другие Т12-цитокины, но, он способен усиливать эффекты других Т12-цитокинов [16].
Причины, по которым Т12-клетки играют более важную роль при аллергических заболеваниях, таких как астма, остаются неизвестными.
Однако предполагается, что это явление может быть следствием недостаточного контакта организма с инфекцией. Отсутствие стимулирующего действия бактериальных факторов, в частности, эндотоксинов, может изменить баланс между Th1 и Th2 клетками Генетические полиморфизмы также могут быть одним из факторов предрасположенности к дисбалансу между Thl- и Й2-клетками [12].
Несмотря на большое количество исследований, посвященных изучению цитокинового профиля у больных бронхиальной астмой, до настоящего времени отсутствуют четкие представления о характере и степени изменений продукции рассматриваемых эндогенных биорегуляторов. Очевидно, это связано с различиями в исследуемых группах больных и, прежде всего, с состоянием пациентов на момент обследования.
Кроме того, следует отметить, что в большинстве работ оценивался только уровень сывороточных цитокинов, который не всегда может быть достаточно информативным.
Поэтому целью настоящего исследования было изучение уровня сывороточных цитокинов, а также их спонтанной и индуцированной продукции лейкоцитами периферической крови у больных бронхиальной астмой в стадии обострения.
Материалы и методы
Для определения цитокинового профиля использовали образцы сыворотки крови больных бронхиальной астмой (n=15) и здоровых доноров (n=16). Определение спонтанной и стимулированной продукции цитокинов клетками крови проводили с использованием наборов реагентов «Цито-кин-Стимул-Бест» («Вектор Бест», РФ).
В соответствии с инструкцией цельную кровь разводили в 5 раз, одну часть инкубировали в культуральной среде без добавок (спонтанная продукция цитокинов), а другую в среде с комплексным митогеном ФГА, конканавалин А и липополи-сахарид (индуцированная продукция цитокинов).
Культивирование проводили в СО2-ин-кубаторе при 37 °С и 4,5% СО2 в течение 24 ч при встряхивании. Затем образцы центрифугировали 10 мин при 3000 об./мин и отбирали супернатант. Полученные супернатанты и сыворотки хранили при температуре -70°С.
Определение концентрации свободных ци-токинов осуществляли с использованием наборов реагентов для ИФА фирмы «Вектор Бест», РФ, в соответствии с инструкцией производителя.
Статистический анализ осуществляли с использованием непараметрических критериев, определяя медиану и размах 25-го и 75-го квартилей данных в группах больных и здоровых доноров.
Сравнение показателей 2 групп проводили, используя U-критерий Манна-Уитни. Достоверными считали различия показателей концентрации цитокинов при Р<0,05.
Результаты и обсуждение
Исследования цитокинового профиля сыворотки крови больных бронхиальной астмой в период обострения позволили выявить достоверное повышение концентраций как провоспалительных цитокинов ИЛ-10, ФНОа, ИЛ-6 (Р равен 0,003; 0,011;
0,011 соответственно), так и противовоспалительного ИЛ-4 (Р=0,038), а также амбивалентного ИЛ-17 (Р=0,025); при этом в крови здоровых доноров отме-
чались только следовые недетектируемые количества провоспалительных цитокинов, тогда как у больных концентрация соответствующих медиаторов повышалась до 74-94 пг/мл (рис. 1).
Для оценки цитокининдуцирующей активности проводился сравнительный анализ концентрации цитокинов в среде инкубации иммунокомпе-тентных клеток крови больных бронхиальной астмой и здоровых доноров.
Как показано на рис. 2, спонтанная продукция клетками крови больных бронхиальной астмой в стадии обострения провоспалительных цитокинов ИНФу и ИЛ-10 превышала соответствующие показатели в контрольной группе (Р=0,006 и 0,045 соответственно).
Для оценки потенциала белоксинтезирую-щей активности проводили сравнительный анализ стимулированной продукции цитокинов иммуно-компетентными клетками крови больных бронхиальной астмой и здоровых доноров.
Представленные на рис. 3 результаты свидетельствуют о повышенной продукции провоспали-тельных цитокинов клетками крови больных бронхиальной астмой в стадии обострения после их стимуляции 1П уйто.
При этом было отмечено достоверное увеличение синтеза ИЛ-6 (Р=0,03) и ИЛ-10 (Р=0,016) у больных бронхиальной астмой.
Проведенный сравнительный анализ спонтанной и стимулированной цитокининдуцирующей активности выявил достоверные отличия в продукции только ИЛ-6 (Р=0,001), ИЛ-1 в (Р=0,018) и ИЛ-10 (Р=0,050) интактными и стимулированными им-мунокомпетентными клетками крови больных бронхиальной астмой.
В то время как у здоровых доноров стимуляция клеток использованным нами способом приводила к достоверному росту продукции широкого спектра про- и противовоспалительных цитокинов ИНФ-у (Р=0,025), ФНО-а (Р=0,014), ИЛ-6 (Р=0,044), ИЛ-10 (Р=0,042), ИЛ-8 (Р=0,048), ИЛ-4 (Р=0,037) и ИЛ-17 (Р=0,014).
Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что у больных бронхиальной астмой в стадии обострения отмечаются повышенные концентрации в крови, как про- так и противовоспалительных цитокинов.
Данные изменения цитокинового профиля сопровождается увеличением спонтанной продукции медиаторов воспаления. При этом следует отметить, что стимуляция синтеза и секреции цито-кинов у больных бронхиальной астмой, в отличие от здоровых доноров не всегда приводит к повышению их индуцированной продукции.
Эти различия, очевидно, обусловлены, исходной стимуляцией лейкоцитов крови больных бронхиальной астмы за счет избыточной продукции эндогенных медиаторов воспаления.
Следовательно, представленные результаты не позволяют однозначно говорить о поляризации иммунного ответа у больных бронхиальной астмой по ТЫ- или ТИ2-типу, поскольку отмечается увеличение как про- так противовоспалительных ци-токинов. Это может быть связано с тем, что при бронхиальной астме в стадии обострения аллергические реакции развиваются на фоне или сопровождаются инфекционными процессами.
Поэтому, может наблюдаться одновременная экспрессия ТЫ - цитокинов, участвующих в механизмах воспаления и ТИ2 - медиаторов, ответственных за формирование аллергических реакций.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СПОНТАННАЯ И ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ... 95
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
£
□ больные бронхиальной астмой
□ здоровые доноры
^достоверное различие между больными и здоровыми донорами
ИЛ-6 ИЛ-8 ИЛ-10 ИФН ФНОа ИЛ-1 ИЛ-4 ИЛ-17
+
*
Рис. 1. Концентрация цитокинов в сыворотке крови больных бронхиальной астмой в сравнении со здоровыми донорами.
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
ЛЙ а ЕН . £ 1- Р"
□ больные бронхиальной астмой
□ здоровые доноры
^достоверное различие между больными и здоровыми донорами
ИЛ-6 ИЛ-8 ИЛ-10 ИФН ФНОа ИЛ-1 ИЛ-4 ИЛ-17
Рис. 2. Спонтанная продукция цитокинов клетками крови больных бронхиальной астмой в сравнении со здоровыми донорами.
6000
5000
4000
с
-Л 3000
2000
1000
к
її
їй
□ больные бронхиальной астмой
□ здоровые доноры
* достоверное различие между больными и здоровыми донорами
ИЛ-6 ИЛ-8 ИЛ-10 ИФН ФНОа ИЛ-1 ИЛ-4 ИЛ-17
*
0
Рис. 3. Индуцированная продукция цитокинов клетками крови больных бронхиальной астмой в сравнении со здоровыми донорами.
96 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СПОНТАННАЯ И ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ...
Кроме того, следует учитывать амбивалентный характер действия некоторых цитокинов. В частности, ИЛ-6, являясь провопалительным медиатором, способен индуцировать ТЪ2-дифферен-цировку С04+ Т-лимфоцитов и способствует генерации супрессорных ТЫ7-клеток [8].
В свою очередь ИЛ-17, продуцируемый упомянутыми выше ТЫ7-лимфоцитами, усиливает воспаление, индуцируя ИЛ-6, ФНО-а и других белков острой фазы [11; 13].
Вышеизложенное свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения особенностей цитокинового статуса у больных бронхиальной астмой. Эти материалы могут быть использованы для уточнения механизма развития астматических состояний и коррекции лечения в соответствие с преобладанием аллегического или инфекционного компонента у конкретного пациента, а также для разработки перспективных стратегий антицитокиновой терапии бронхиальной астмы.
Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации по государственной поддержке ведущих научных школ (грант НШ-3482.2010.7).
Литература
1. Barnes PJ, Chung K.F., Page C.P. Inflammatory mediators of asthma: an update // Pharmacol. Rev.
- 1998. - 50. - P. 515-96.
2. Barnes P.J. Novel approaches and targets for treatment of chronic obstructive pulmonary disease // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1999. - 160. - S72-S79.
3. Bi Y., Liu G, Yang R. Th17 cell induction and immune regulatoryeffects // J. Cell Physiol. - 2007. - 211.
- 273-8.
4. Borish L.C., Nelson H.S., Lanz M.J. et al. Interleukin-4 receptor in moderate atopic asthma. A phase I/II randomized, placebo-controlled trial // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1999. - 160. - P. 1816-23.
5. Boyton R.J., Altamann DM. Asthma: New developments in cytokine regulation // Clin. Exp. Immunol.
- 2004. - 136. - P. 13-4.
6. Chung K.F, Barnes P.J. Cytokines in asthma // Thorax. - 1999. - 54. - P. 825-57.
7. Greenfeder S, Umland S.P, Cuss F.M. et al. Th2 cytokines and asthma - The role of interleukin-5 in aller-
gic eosinophHHic disease // Respiratory Research. - 2001. - 2. - P. 71-9.
8. Kamimura D, Ishihara K., Hirano T. IL-6 signal transduction and its physiological roles: the signal orchestration model // Rev. Physiol Biochem.and Pharmacol. - 2003. - 149. - P. 1-38.
9. Kips J.C., O'Connor B.J., Langley S.J. et al. Effect of SCH55700, a humanized anti-human interleukin-5 antibody, in severe persistent asthma: a pKHot study // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2003. - 167(12). - P.
1655-9.
10. Leckie M.J, Brincke A., Khan J. et al. Effects of an interleukin-5 blocking monoclonal antibody on eosinophils, airway hyperresponsiveness and the late asthmatic response // Lancet. - 2000. - 356. - P. 2144-8.
11. Mangan P.R, Harrington L.E., O'Quinn D.B. et al. Transforming growth factor-beta induces development of the T(H)17 lineage // Nature. - 2006. - 441(7090). - P. 231-4.
12. Palmer L.J., Cookson W. Using single nucleotide polymorphisms as a means to understanding the pathophysiology of asthma // Respir. Research. - 2001. - 2. - P. 102-12.
13. Park S.J, Lee Y.C. Interleukin-17 regulation: an attractive therapeutic approach for asthma // Respir. Res.
- 2010. - 11. - P. 78-88.
14. Steinke J.W., Borish L. Th2 cytokines and asthma - Interleukin-4: its role in the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin-4 receptor antagonists // Respiratory Research. - 2001. - 2.
- P. 66-70.
15. Wills-KarpM. The gene encoding interleukin-13: a susceptibility locus for asthma and related traits // Respiratory Research. - 2000. - 1. - P. 19-23.
16. Zhou Y, McLane M, Levitt RC. Th2 cytokines and asthma - Interleukin-9 as a therapeutic target for asthma // Respiratory Research. - 2001. - 2. - P. 80-4.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
