CC BY
9
УДК 577.151.35: 577.151.45
Специфичность пенициллинацилаз в реакции снятия защитной группы в N-бензилоксикарбонильных производных аминокислот
И. А. Морозова1, Д. Ф. Гуранда1, Н. В. Панин12, В. К. Швядас123*
'Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Москва, 119991 Россия
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский вычислительный центр, Москва, 119991 Россия
3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии
и биоинформатики, Москва, 119991 Россия
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 02.02.2023
Принята в печать 20.02.2023
DOI: 10.32607/actanaturae.13703
РЕФЕРАТ Изменение структуры N-ацильной группы в производных аминокислот существенным образом влияет как на узнавание, так и на активность пенициллинацилаз в этом ряду субстратов. Тем не менее, как пенициллинацилаза из Alcaligenes faecalis, так и пенициллинацилаза из Escherichia coli способны снимать N-бензилоксикарбонильную защитную группу c производных аминокислот в мягких условиях без использования токсичных реагентов и могут быть использованы в органическом синтезе. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА специфичность пенициллинацилаз, ферментативное снятие защитных групп, N-бензилоксикарбонильные производные аминокислот.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПА - пенициллинацилаза; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; PMSF - фенилметилсульфонилфторид; NIPAB - 6-нитро-3-фенилацетамидобензойная кислота; о-ФА - о-фталевый альдегид; NAC - ^ацетил^-цистеин; Z - N-бензилоксикарбонильная группа.
ВВЕДЕНИЕ
Маскировка функциональных групп является важной частью органического синтеза [1, 2]. Использование ферментов для введения и снятия защитных групп существенно расширяет возможности в этой области, вплоть до применения новых реагентов и изменения условий проведения этих стадий. Так, в химическом пептидном синтезе, проводимом преимущественно в органических растворителях, используется один набор реагентов, а при использовании ферментов, например, для маскировки аминогрупп, возможно применение фенилацетильных [3], фталильных [4], ацетильных [5] защитных групп. Использование биокатализа в органическом синтезе, особенно при получении лекарственных препаратов, направлено также на поиск ферментов, способных катализировать традиционные химические реакции и сделать их более привлекательными с экологической и экономической точки зрения. В качестве примера можно привести отщепление бензилоксикарбонильной за-
щитной группы в аминосоединениях, традиционно проводимое каталитическим гидрированием, восстановлением натрием в жидком аммиаке, а также ацидолизом с помощью бромоводорода в уксусной кислоте [1, 2]. Среди ограничений и недостатков этих методов можно выделить следующие: активно используемый метод гидрирования на палладиевом катализаторе нельзя применить, если в структуре соединения есть органические сульфиды, в том числе остатки цистеина или метионина [6]. Можно проводить деблокирование в присутствии цикло-гексиламина или эфирата трехфтористого бора [7], однако метод не селективен при наличии восстанавливаемых функциональных групп, таких, как C=C, C=O, CN, NO2, формильной, карбамоильной и др. [8]. Следует также принимать во внимание токсичность палладия и отсутствие методов надежного удаления его следов из конечного продукта, что чрезвычайно важно при синтезе лекарственных препаратов [9]. При восстановительном расщеплении натрием в жидком аммиаке [10] одновременно с бензилок-
сикарбонильным остатком отщепляются другие защитные группы, сложные эфиры, хотя бы частично, превращаются в амиды, разрушаются остатки треонина, частично деметилируются остатки метиони-на, происходит расщепление некоторых пептидных связей. При ацидолитическом расщеплении идут побочные реакции переэтерификации, ацетилиро-вания остатков треонина и серина, разрушаются остатки триптофана, нитроаргинина, бензиловые эфиры и амидные группы [11]. Наряду с оптимизацией условий проведения этих реакций с целью снижения вклада побочных процессов интерес представляет разработка биокаталитических методов снятия N-бензилоксикарбонильной защиты аминогрупп. При развитии этого направления были обнаружены новые ферменты: уретангидролазы [12, 13], снимающие бензилоксикарбонильную защиту ферменты в Sphingomonas paucimobilis, Burkholderia phenazinium и Arthrobacter sp. [14-16], показана способность пенициллинацилазы из Escherichia coli расщеплять N-бензилоксикарбонильные производные аминокислот [17]. Целью данной работы было изучить как меняется специфичность пенициллин-ацилаз из Alcaligenes faecalis и E. coli при изменении структуры N-ацильной группы (замене фенил-ацетильного остатка на бензилоксикарбонильный) в структуре субстрата и сравнить способности двух ферментов снимать защитную группу.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты
В работе использовали фенилацетилхлорид (Sigma, США); фенилметилсульфонилфторид (Merck, ФРГ); ацетонитрил («Криохром», Россия); N-фенилацетильные производные а-аминокислот синтезировали как описано ранее [18]. Препарат пенициллинацилазы из E. coli выделяли как описано ранее [19], препарат пенициллинацилазы из A. faecalis предоставлен компанией ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», концентрацию активных центров пенициллинацилаз определяли титрованием фенилметилсульфонилфторидом (PMSF) как описано ранее [20, 21].
Определение ккат и KM гидролиза N-ацильных производных аминокислот под действием пенициллинацилаз
Кинетические эксперименты проводили в тер-мостатируемой ячейке спектрофотометра Shimadzu UV-1601 при 400 нм и 25оС в 0.01 M фосфатном буфере pH 7.5 в присутствии 0.1 M KCl. Значения константы Михаэлиса (KM) для гидролиза N-фенилацетильных и N-бензил-
оксикарбонильных производных аминокислот определяли как константы конкурентного инги-бирования гидролиза цветного субстрата NIPAB этими соединениями при анализе зависимости наблюдаемой константы Михаэлиса гидролиза NIPAB от концентрации N-фенилацетильного или N-бензилоксикарбонильного производного аминокислоты. Определение каталитических констант ферментативного гидролиза N-фенилацетильных и N-бензилоксикарбонильных производных аминокислот проводили при насыщающей концентрации субстрата (численно равной 10 и 20 KM) для определения максимальной скорости ферментативной реакции. За протеканием реакции следили при помощи отбора проб и спектрофотометрической регистрации образующихся аминогрупп после модификации о-фталевым альдегидом. В типичном эксперименте раствор N-ацильного производного аминокислоты в 0.01 M фосфатном буфере pH 7.5, содержащем 0.1 M KCl, помещали в термостатиру-емую ячейку при 25оС и при перемешивании добавляли необходимое количество фермента. Через определенное время отбирали пробы (15-30 мкл) реакционной смеси, смешивали их с 50 мкл 10 мМ раствора PMSF в изопропаноле для остановки реакции, разбавляли до нужной концентрации и анализировали при помощи ВЭЖХ. Для определения начальных скоростей ферментативного гидролиза обычно отбирали 8-10 проб, степень превращения субстрата при этом не превышала 10%.
ВЭЖХ-анализ с предколоночной модификацией аминогрупп о-фталевым альдегидом
Модификацию первичных аминогрупп проводили следующим образом: к 900 мкл 0.5 мМ раствора аминосоединения в 0.4 М боратном буфере pH 9.6 при 25оС добавляли 50 мкл метанольного раствора, содержащего NAC (40 мМ) и о-ФА (20 мМ). Смесь перемешивали, через 15 мин разбавляли элюен-том для хроматографии, центрифугировали в течение 3 мин при 12000 об/мин и анализировали. Хроматографическая система состояла из модуля подачи элюента Waters M6000, инжектора типа Reodyne 7 125 с петлей объемом 50 мкл, колонки для обращенно-фазовой хроматографии Nucleosil C1-8 Chrompack Varian (250*4 мм, 5 мкм) и детектора Waters M481 LC. Хроматограммы регистрировали на программно-аппаратном комплексе для сбора и обработки хроматографических данных Мультихром («Амперсенд», Россия). Скорость потока 1 мл/мин. Образующиеся изоиндолы анализировали при 340 нм с использованием в качестве подвижной фазы 6 мМ фосфатного буфера pH 6.8, содержащего ацетонитрил (10-40% по объему).
ov
соон
Пенициллинацилаза pH 7.5
N-защитные группы
H,N
+
чОН
CO-
COON
[т, n] ■■
0, 1 фенилацетильная
1, 0 бензилоксикарбонильная
Рис. 1. Реакции снятия фенилацетильной и бензилоксикарбонильной защитных групп, катализируемые пеницил-линацилазами
ПА Escherichia coli
а
Ci %
Asp
Asn
Val
■t Ala
Arg Glu
50 100 150 200
K , мкМ (фенилацетильная группа)
Рис. 2. Корреляция между значениями констант Миха-элиса (KM) в реакциях гидролиза N-фенилацетильных (ось абсцисс) и N-бензилоксикарбонильных (ось ординат) производных аминокислот, катализируемых пенициллинацилазой из E. coli
у р
Ci
м
1.5
1.0
0.5
ПА Alcaligenes faecalis
Asp
Arg
Asn
Val
Glu
Ala
0.0
10
20
30
KM, мкМ (фенилацетильная группа)
Рис. 3. Корреляция между значениями констант Миха-элиса (Км) в реакциях гидролиза ^фенилацетильных (ось абсцисс) и ^бензилоксикарбонильных (ось ординат) производных аминокислот, катализируемых пенициллинацилазой из A. faecalis
Прямой ВЭЖХ-анализ компонентов реакционной смеси
ВЭЖХ-анализ компонентов реакционной смеси без предколоночной модификации образующихся аминогрупп проводили при помощи хроматографи-ческой системы Waters, колонки Kromasil Eternity-5-C18 column (Eka Chemicals, Швеция) с использованием 6 мМ фосфатного буфера pH 3.0, содержащего ацетонитрил (30% по объему) и 0.1 г/л додецилсуль-фата натрия, при 210 нм и скорости потока 1 мл/мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Схема ферментативного гидролиза N-фенил-ацетильных и N-бензилоксикарбонильных производных аминокислот представлена на рис. 1. Необходимо отметить отличие продуктов в этих двух реакциях: при снятии N-фенилацетильной защиты и выделении аминокислоты со свободной аминогруппой образуется фенилуксусная кислота, в то время как при снятии N-бензилокси-карбонильной защиты наряду с аминокислотой накапливается бензиловый спирт и выделяется СО2.
Отличие ацильных групп на один атом кислорода приводит к существенному изменению в эффек-
тивности связывания субстратов в активном центре пенициллинацилаз, это характерно как для пеницил-линацилазы из A. faecalis, так и для пенициллинаци-лазы из E. coli. Изменение в структуре N-ацильной группы не меняет специфичность ферментов к боковому радикалу аминокислоты, о чем свидетельствуют корреляции между значениями константы Михаэлиса в реакциях снятия N-фенилацетильной и N-бензилоксикарбонильной защиты, катализируемых обеими пенициллинацилазами. В то же время оба фермента отличаются по своей специфичности к этому структурному фрагменту: если наименее эффективно связывающимися субстратами пеницилли-нацилазы из E. coli являются производные аспара-гиновой кислоты (рис. 2), то для пенициллинацилазы из A. faecalis это производные аргинина (рис. 3).
При замене фенилацетильного остатка на бен-зилоксикарбонильный сродство обоих ферментов к субстрату снижается более чем на порядок, при этом пенициллинацилаза из A. faecalis проявляет более высокое сродство к новым субстратам (значения KM в интервале 0.08-1.6 мМ).
В то время как сродство обоих ферментов к субстратам зависит от природы боковой цепи амино-
%
100 75 50 25
%
100 75 50 25
ПА Escherichia coli Фенилацетильная группа
Ala Glu Asp Arg Val
- nA Escherichia coli Z-rpynna
%
100 75 50 25 0
ПА Alcaligenes faecalis Фенилацетильная группа
Ala Glu Asn Val
% ПА Alcaligenes faecalis Z-группа
100 75 50 25
Рис. 4. Каталитическая активность пеницил-линацилаз из E. coli (левые рисунки) и A. faecalis (правые рисунки) в реакциях гидролиза N-фенилацетильных и N-бензил-оксикарбонильных производных аминокислот, выраженная как значение каталитических констант по отношению к производным аланина (в процентах): верхние рисунки показывают активность ферментов по отношению к N-фенилацетильным производным аминокислот, нижние - к N-бензилокси-карбонильным производным аминокислот
Ala Glu Asp Arg Val
Ala Glu Asn Val
кислоты, этот структурный фрагмент по-разному влияет на реакционную способность пенициллина-цилаз (рис. 4). Природа боковой цепи аминокислоты в ряду N-фенилацетильных производных аминокислот слабо влияет на каталитическую активность пенициллинацилазы из A. faecalis (верхний правый рисунок), в то время как реакционная способность пенициллинацилазы из E. coli сильно зависит от этого структурного фрагмента и падает в ряду N-Phac-Ala, Glu, Asp, Arg, Val более чем в 20 раз (верхний левый рисунок). При замене фенилаце-тильного остатка на бензилоксикарбонильный снижается реакционная способность ферментов. Так, активность пенициллинацилазы из E. coli падает в 10-49 раз в зависимости от структуры бокового радикала аминокислотного остатка, а пенициллина-цилаза из A. faecalis еще более чувствительна к такому структурному изменению: активность фермента уменьшается на два порядка. Тем не менее, обе пенициллинацилазы способны снимать защитные N-бензилоксикарбонильные группы в производных аминокислот (рис. 5), а введением мутаций в структуру ферментов можно увеличить каталитическую
и \ О
0.8
0.6
0.4
0.2
Z-L-Ala
Бензиловый спирт
20
40 60 Время, мин
80
100
120
Рис. 5. Снятие ^бензилоксикарбонильной защитной группы, катализируемое пенициллинацилазой из А. fаecаlis. Красными точками представлено изменение концентрации субстрата ^-бензилоксикарбонил^-А1а), желтыми - накопление продукта превращения (бензилового спирта). Условия реакции: рН 7.5, 25оС, концентрация субстрата 1 мМ, концентрация фермента 6 мкМ
0
0
0
0
активность к неспецифическим субстратам. Опыт изучения пенициллинацилазы из E. coli показывает, что методами белковой инженерии удается повысить как каталитическую активность, так и сродство фермента к субстратам [22].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование показало, что изменение структуры N-ацильной группы в производных аминокислот существенным образом влияет как на узнавание, так и на активность пеницил-линацилаз в этом ряду субстратов. Тем не менее, как пенициллинацилаза из A. faecalis, так и пе-
нициллинацилаза из E. coli способны снимать N-бензилоксикарбонильную защитную группу в производных аминокислот в мягких условиях без использования токсичных реагентов и могут быть использованы в органическом синтезе. Эффективность такого биокаталитического снятия защитной группы может быть улучшена при использовании современных методов рационального дизайна ферментов. •
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-71-30003).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kadereit D., Waldmann H. // Chem. Rev. 2001. V. 101. № 11. P. 3367-3396.
2. Sartori G., Maggi R. // Chem. Rev. 2010. V. 113. P. 1-54.
3. Didziapetris R.J., Drabnig B., Schellenberger V., Jakubke
H.-D., Svedas V.K. // FEBS Lett. 1991. V. 287. P. 31-33.
4. Costello C.A., Kreuzman A.J., Zmijewski M.J. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. № 42. P. 7469-7472.
5. Simons C., van Leeuwen J.G.E., Stemmer R., Arends
I.W.C.E., Maschmeyer T., Sheldon R.A., Hanefeld U. // J. Mol. Catal. B Enzym. 2008. V. 54. № 3-4. P. 67-71.
6. Sewald N., Jakubke H.-D. Peptides: Chemistry and Biology. 2nd еd. Weinheim: Wiley, 2009. 594 p.
7. Yajima H. // Chem. Pharm. Bull. Japan. 1968. V. 16. P. 1342.
8.Medzihradszky K., Medzihradszky-Schweiger H. // Acta Chem. Acad. Sci. Hung. 1965. V. 44. P. 15-18.
9. Ojha N.K., Zyryanov G.V., Majee A., Charushin V.N., Chupakhin O.N., Santra S. // Coordination Chem. Rev. 2017. V. 353. P. 1-57.
10. Sifferd R.H., Vigneaud V. // J. Biol. Chem. 1935. V. 108. P. 753.
11. Wunsch E., Drees F. // Chem. Ber. 1966. V. 99. P. 110.
12. Matsumura E., Shin T., Murao S., Sakaguchi M., Kawano T. // Agric. Biol. Chem. 1985. V. 49. № 12. P. 3643-3645.
13. Matsumura E., Yamamoto E., Kawano T., Shin T.H., Murao S. // Agric. Biol. Chem. 1986. V. 50. № 6. P. 1563-1571.
14. Patel R.N., Nanduri V., Brzozowski D., McNamee C., Banerjee A. // Adv. Synth. Catal. 2003. V. 345. P. 830-834.
15.Chu L.N., Nanduri V.B., Patel R.N., Goswami A. // J. Mol. Catal. B Enzym. 2013. V. 85-86. P. 56-60.
16. Maurs M., Acher F., Azerad R. // J. Mol. Catal. B Enzym. 2012. V. 84. P. 22-26.
17. Alvaro G., Feliu J.A., Caminal G., Lopez-Santin J., Clapes P. // Biocatal. Biotransformation. 2000. V. 18. № 3. P. 253-258.
18. Guranda D.T., van Langen L.M., van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. // Tetrahedron: Asymmetry. 2001. V. 12. P. 1645-1650.
19. Ясная А.С., Ямскова О.В., Гуранда Д.Ф., Щербакова Т.А., Тишков В.И., Швядас В.К. // Вестник МГУ. Серия 2. Химия. 2008. Т. 49. С. 127-133.
20. Швядас В.К., Марголин А.Л., Шерстюк С.Ф., Клесов А.А., Березин И.В. // Биоорган. химия. 1977. Т. 3. С. 546-554.
21. Svedas V., Guranda D., van Langen L., van Rantwijk F., Sheldon R. // FEBS Lett. 1997. V. 417. P. 414-418.
22. Shapovalova I.V., Alkema W.B.L., Jamskova O.V., de Vries E., Guranda D.T., Janssen D.B., Svedas V.K. // Acta Naturae. 2009. V. 1. P. 94-98.
