CC BY
43
УДК 616-005.444-092.9:612.433’62
A.A. Stratonnikov1, G.A. Meerovich1, V.M. Derkacheva2, V.G. Pereverzev, A.V. Ryabova1, E.A. Lukyanets2
SPECTROSCOPIC INVESTIGATIONS OF CONJUGATES OF ALUMINUM PHTHALOCYANINE DERIVATIVES IN VIVO
1Natural Sciences Center of A.M. Prokhorov General Physics Institute RAS, Moscow
2Organic Intermediates and Dyes Institute, Moscow
ABSTRACT
The spectral properties of conjugates of aluminum phthalocyanine derivatives with N-methyl-D-glucamine and Rhodamine B 2-aminoethyl ester have been studied in vivo. The introduction in phthalocyanine molecule of amino saccharide and luminophore residues was shown to be a tool to govern their properties as photosensitisers.
Key words: phthalocyanine, photodynamic therapy, conjugate, pharmacokinetics, photosensitiser, rhodamine, amino saccharide.
1 1 2 A.A. CmpamoHHUKoe , Г.А. Меерович , В.М. Деркачева ,
В.Г. Переверзев, A.B. Рябова1, E.A. Лукъянец2
СПЕКТРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОНЪЮГАТОВ ФТАЛОЦИАНИНА АЛЮМИНИЯ IN VIVO
1 Центр естественно-научных исследований Института общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва Институт органических полупродуктов и красителей, Москва
РЕЗЮМЕ
Исследованы спектральные свойства in vivo конъюгатов фталоцнанина алюминия с N-метил^-глюкамином и 2-аминоэтиловым эфиром родамина С. Показано, что введение в молекулу фталоцианина остатков аминосахаров и люминофоров может служить инструментом управления их свойствами как фотосенсибилизаторов.
Ключевые слова: фталоцианин, фотодинамическая терапия, конъюгат, фармакокинетика, фотосенсибилизатор, родамин, аминосахара.
ВВЕДЕНИЕ
Метод фотодинамической терапии в настоящее время занимает важное место в лечении ряда онкологических и неонкологических заболеваний. В клиническую практику введен фотосенсибилизатор (ФС) фотосенс, представляющий собой водорастворимый продукт сульфирования незамещенного фталоцианина алюминия со средней степенью замещения, равной 3, поглощающий в красном диапазоне спектра с максимумом при 675 нм и молярным коэффициентом экстинкции £ свыше 105 [4]. Особенностью фотосенса, как, впрочем, и многих других ФС, является длительное удерживание в организме, что приводит к повышенной кожной фоточувствительности и необходимости соблюдать щадящий световой режим.
Одним из путей преодоления этих недостатков ФС является их направленный транспорт в опухоль. Для этого, в частности, фотосенсибилизаторы конъюгируют с соединениями различной структуры. Получены конъюгаты с полиэтиленгликолем (ПЭГ) прото-порфирина цинка [7], препарата фоскан [5] и тетрапи-разинопорфиразинов [12], а также конъюгаты фталоцианина кремния с поликапролактоном [11].
Особое внимание уделяется конъюгатам с сахарами [6], белками [9], стероидами [10] и т.д., транспортная часть которых имеет специфические рецепторы на внешней мембране клетки. Так, существенное повышение селективности накопления наблюдалось у конъюгатов перфторфенилпорфиринов с негидроли-зующимися сахарами [6], хлорина е6 с поли^-лизином [8], производных порфирина с белками раз-
личного строения и низкомолекулярным ПЭГ [14]. С другой стороны, представляет интерес изучение конъюгатов с другими красителями - совмещение в одной молекуле 2 хромофоров, имеющих интенсивное поглощение в видимой области, что позволяет расширить спектр действия фотосенсибилизаторов для ФДТ.
В данной статье обсуждаются результаты спектральных исследований in vivo полученных нами конъюгатов тетра-4-сульфофталоцианина алюминия с №метил^-глюкамином и 2-аминоэтиловым эфиром родамина С (рис. 1). Выбор родамина в качестве конъюгирующего агента обусловлен, в частности, тем, что его производные накапливаются преимущественно в митохондриях клетки. Это позволяет использовать подобные конъюгаты в качестве маркера для определения внутриклеточной локализации фотосенсибилизатора [13]. Мы полагали, что привязка производного родамина к сульфогруппам фталоциа-
CH
I ■
OH H OH OH
R = R1 = SO,—N—CH,—C—C—C—C—CH2OH
H OH H H
© ©
В
Рис. 1. Конъюгаты тетра-4-сульфофталоцианина алюминия:
А - общая структурная схема;
Б - заместители в тетракис-4-[Ы-метил-^ф-глюка)сульфамоил]-фталоцианине гидроксиалю-миния (ФГ);
В - заместители в конъюгате тетра-4-сульфо-фталоцианина алюминия хлорида с аминоэтиловым эфиром родамина С (ФРП).
нина изменит как фотофизические свойства соединения, так и его локализацию в органеллах клетки. Кроме того, можно ожидать, что родаминовый фрагмент, поглощающий свет в области 500-600 нм, будет передавать энергию возбуждения фрагменту фталоциани-на и увеличит таким образом эффективность генерации последним активных форм кислорода.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Синтез конъюгатов тетра-4-сульфофталоцианина алюминия
Взаимодействием тетра-4-сульфокислоты РсАЮН [2] с хлористым тионилом в присутствии диметил-формамида получен соответствующий сульфохлорид РсА1С1, который при взаимодействии с N-метил^-глюкамином в присутствии неорганического основания в воде образовал конъюгат - тетракис-4-[Ы-метил-№^-глюка)сульфамоил]фталоцианин гидроксиалю-миния (ФГ). Очистка ФГ производилась с использованием многократного переосаждения из водного раствора изопропанолом с последующей отмывкой примесей 10%-ной соляной кислотой и водой. Синтез конъюгата тетра-4-сульфофталоцианина алюминия хлорида с аминоэтиловым эфиром родамина С (ФРп), представляющего собой смесь конъюгатов различной степени амидирования с преимущественным содержанием родаминовой составляющей, равной 2 (ФР2), описан нами ранее [1].
Исследования in vivo накопления конъюгата ФГ проводили на группах мышей-гибридов 1-го поколения F1 (С57В1/6 х DBA/2) с аденокарциномой Эрлиха (ELD), инокулированной в бедро правой задней лапы за 6 дней до опыта. Фотосенсибилизаторы, растворенные в физиологическом растворе, вводили в хвостовую вену в объеме 0,2 мл. Доза фотосенса, которую вводили мышам контрольной группы, составляла 4 мг/кг веса животного, конъюгаты использовали в эк-вимолярных дозах. Концентрацию фотосенсибилизаторов в опухоли исследовали чрескожно спектральнофлюоресцентным методом с использованием спектроанализатора «ЛЭСА-01-Биоспек» [3]. Данные усредняли в каждой группе животных. Концентрацию фотосенсибилизатора в нормальной ткани измеряли в контралатеральной зоне левой лапы. На основе полученных данных определяли в динамике уровень накопления фотосенсибилизатора в опухоли и нормальной ткани, по которому рассчитывали значения селективности его накопления в опухоли по отношению к нормальной ткани.
Для внутривенного введения использовали растворы фотосенса и ФГ в физиологическом растворе и ФР2 в водных дисперсиях 2 неионогенных поверхностно-активных веществ (ПАВ) - полиэтиленгликоля (ПЭГ) и 4%-ного проксанола-268.
Деоксигенацию гемоглобина в присутствии ФР2 исследовали в цельной крови, содержащей 10 мг/л конъюгата. Облучение проводили лазерными источниками с длинами волн 532 нм (в спектральном диапазоне полосы поглощения фрагмента родамина) и
675 нм (в спектральном диапазоне полосы поглощения сульфопроизводного фталоцианина алюминия). Плотность мощности света в обоих случаях составляла 200 мВт/см2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Спектральные и фармакокинетические свойства конъюгата тетра-4-сульфофталоцианина алюминия с N-метил-О-глюкамином (ФГ) in vivo
Результаты сравнительных исследований in vivo накопления в нормальных и опухолевых тканях животного конъюгата ФГ и фотосенса при его самостоятельном и совместном введении с 10-кратным избытком №метил^-глюкамина приведены в таблице.
Из полученных данных следует, что конъюгат фотосенса с №метил^-глюкамином накапливается и длительно удерживается в опухоли. И хотя его клиренс из нормальной ткани несколько ниже по сравнению с клиренсом препарата фотосенс и его смесью с №метил^-глюкамином, селективность накопления конъюгата в опухолевой ткани через 1 сут после введения оказывается заметно выше (4,3), чем при использовании препарата фотосенс (1,7) и смеси (2,1). Повышение селективности накопления может быть объяснено как структурными различиями, в частности, размерами молекул, так и их зарядом; в отличие от анионного фотосенса конъюгат электронейтрален.
Спектральные и фотодинамические свойства конъюгата тетра-4-сульфофталоцианина алюминия с родамином С (ФР2). Спектроскопия поглощения конъюгата ФР2 in vivo
Уровень накопления конъюгата ФР2 в ткани оценивали по спектрам поглощения. Обнаружено, что при одной и той же дозе введения конъюгата его поглощение в тканях существенно зависит от состава вводимого раствора, а именно, добавок проксанола-268 или полиэтиленгликоля, выполняющих солюбилизирующие, деагрегирующие и транспортные функции (рис. 2).
Уровень и скорость выведения конъюгата ФР2 из опухоли существенно зависит от состава вводимого раствора (рис. 3). Использование дисперсии полиэти-ленгликоля приводит к относительно быстрому выведению конъюгата из опухоли (за 18 ч его концентрация снижается практически втрое). Дисперсия на основе проксанола-268, наоборот, приводит к более длительному удержанию конъюгата в опухоли.
Было обнаружено также, что конъюгат ФР2 достаточно быстро выводится из нормальной ткани: за 18 ч его концентрация снижается примерно в 6 раз.
Индекс селективности накопления конъюгата ФР2 в опухоли по сравнению с нормальной тканью через сутки после внутривенного введения составляет примерно 4 при использовании полиэтиленгликоля и доходит до 10 при использовании проксанола-268, то
Рис. 2. Спектры поглощения опухоли мыши через 18 ч после внутривенного введения конъюгата ФР2 в дозе 10 мг/кг:
1 - в 4% - ной дисперсии проксанола-268;
2 - в дисперсии с ПЭГ.
Рис. 3. Динамика поглощения конъюгата ФР2 в опухоли после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг:
1 - в 4% - ной дисперсии проксанола-268;
2 - в дисперсии с ПЭГ.
есть заметно выше по сравнению с характерными значениями для фотосенса (2-3 при сравнимой дозе введения).
Изучение флюоресценции конъюгата ФР2
Спектры флюоресценции (рис. 4) конъюгата ФР2 выявили интересную особенность исследуемого соединения: в его молекулах осуществляется внутримолекулярная передача энергии от родаминового остатка к фрагменту фталоцианина. Действительно, при возбуждении в полосу поглощения родамина наблюдается флюоресценция в области 690 нм, характерная для производных фталоцианина. Это заключение
1800160014001
4 -
І 12(Ю' і ' g 1000-X •
ЕЕ
5 800! 600400200
- і • і і
$00
Длина волны, нч
Рис. 4. Спектры флюoреcценции кoнъюгaтa ФР2 в плазме крoви в кoнцентрaции 2 мг/л при ho3-буждении лaзерoм с длинoй нскіньї 532 нм
В связи с этим лазер периодически выключали и практически в тот же момент фиксировали степень оксиге-нации без облучения. При облучении образца крови с конъюгатом лазером с длиной волны 675 нм степень оксигенации в течение 300 с упала до значений, составляющих 0,25 от первоначального значения, что говорит о высокой фотодинамической активности фталоциани-новой части конъюгата. При использовании лазера с длиной волны 532 нм с такой же плотностью мощности за 300 с облучения степень оксигенации упала до значений, составляющих 0,83 от первоначального значения. Это свидетельствует о том, что фотодинамический процесс протекает и при облучении излучением, поглощаемым родаминовым фрагментом, хотя и с существенно меньшей интенсивностью.
Обнаруженный эффект свидетельствует о том, что молекула родамина в ковалентном конъюгате играет роль светопоглощающей антенны. Другими словами, поглощение на 532 нм осуществляется фрагментом
Нагапление ганъюгата тетрa-4-cульфoфтaлoциaнинa алюминия с N-метил-D-глюкaминoм (ФГ) в oпуxoлевoй и вдрмальвдй ткани мыши
Время после введения, ч Концентрация в опухолевой ткани, Ст Относительное изменение концентрации Концентрация в нормальной ткани, CN Относительное изменение концентрации Селективность накопления
Фотосенс в дозе 4 мг/кг водного раствора
1 1,205 1 0,99 1 1,217
24 0,58 ФДT 0,48 0,34 0,34 1,71
72 0,137 0,138
168 0,143 0,144
Смесь фотосенса в дозе 4 мг/кг и ^метил^-глюкамина (1:10)
1 1,37 1 0,94 1 1,46
24 0,732 ФДT 0,53 0,35 0,37 2,09
168 0,23 0,24
0,165 0,175
Конъюгат ФГ в дозе 8 мг/кг
1 0,124 1 0,07 1 1,77
24 0,151 ФДT 1,22 0,035 0,5 4,3
72 0,035 0,5
168 0,029 0,4
подтверждено исследованиями фотодинамической активности растворов конъюгата в цельной крови.
Исследование фотодинамического эффекта ФР2 в цельной крови
Во время облучения лазером с длиной волны 532 нм мы не могли вести мониторинг оксигенации, поскольку эта длина волны находится в полосе поглощения гемоглобина, используемой для оценки степени оксигенации.
родамина с последующей передачей энергии триплетному состоянию фталоцианиновой части молекулы, взаимодействующей далее с молекулой кислорода.
ВЫВОДЫ
Проведенные исследования in vivo конъюгатов фталоцианина алюминия с №метил^-глюкамином и 2-аминоэтиловым эфиром родамина С показывают, что введение в молекулу фталоцианина остатков ами-носахаров и люминофоров может служить инстру-
ментом управления их свойствами как фотосенсибилизаторов.
Исследования, проведенные в данной работе, были выполнены при финансовой поддержке Научнотехнической программы Правительства г. Москвы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2003-2006 г.г. (Г.А. Мее-рович, Е.А. Лукьянец) и гранта РФФИ № 06-02-17468 (А.А. Стратонников, А.В, Рябова).
ЛИТЕРАТУРА
1. Деркачева В.М., Михаленко С.А., Соловьева Л.И. и др. Синтез конъюгатов фталоцианинов с рода-минами // Журнал общей химии (в печати).
2. Кузнецова Н.А., Негримовский В.М., Деркаче-ва В.М. и др. Фотокаталитическая деструкция сульфо-замещеных фталоцианинов и их аналогов в водных средах // Журнал общей химии. - 1997. - Т. 67, № 3. -С. 499-505.
3. Лощенов В.Б., Стратонников А.А., Волкова А.И., Прохоров А.М. Портативная спектроскопическая система для флюоресцентной диагностики опухолей и контроля за фотодинамической терапией // Росс. хим. журнал. - 1998. - Т. XLII, № 5. - C. 50-3.
4. Лукьянец Е.А. Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии // Росс. хим. журнал. -1998. - Т. XLII, № 5. - С. 9-16.
5. Reuter T., Koebler A.C., Zillmann U. et al. Comparison of the In Vivo Efficiency of Photodrin II-, mTHPC-, m-THPC-PEG- and m-THPCnPEG-Mediated PDT in a Human Xenografted Head and Neck Carcinoma // Lasers Surg. Med. - 2001. - .29. - P. 314-22.
6. Chen X., Hui L., Foster D.A., Drain C.M. Synthesis and Photodynamic Activity of Porphyrin-Saccharide Conjugates: Targeting and Incapacitating Cancer Cells // Biochemistry. - 2004. - 43. - P. 10918-29.
7. Fang J., Sawa T., Akaike T. et al. Enhancement of hemo therapeutic response of tumor cells by a heme oxygenase inhibitor, pegylated zinc protoporphyrin // Int. J. Cancer. - 2004. - 109. - P. 1-8.
8. Hamblin M.R., Miller J.L., Rizvi I. et al. Targeted photodynamic therapy for infected wounds in mice // Br. J. Cancer. - 2003. - 89. - P. 937-43.
9. Huang J.-D., Wang S., Lo P.-C. et al. Halo-genated silicon (IV) phthalocyanines with axial poly(ethylene glycol) chains. Synthesis, spectroscopic properties, complexation with bovine serum albumin and in vitro photodynamic activities // New J. Chem. - 2004. - 28. - P. 348-54.
10. Khan E.H., Ali H., Tian H. et al. Synthesis and biological Activities of Phthalocyanine-Estradiol Conjugates // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2003. - 13. - P. 1287-90
11. Lee P.P.S., Ngai T., Huang J.-D. et al. Synthesis, Characterization, Biodegradation, and in Vitro Photodynamic Activities of Silicon(IV) Phthalocyanines Conjugated Axially with Poly(e-caprolactone) // Macromolecules. - 2003. - 36. - P. 7527-33.
12. Mitzel F., FitzGerald S., Beeby A., Faust R. The Synthesis of Arylalkyne-Substituted Tetrapyrazinopor-phyrazines and an Evaluation of Their Potential as Photo-sensitisers for Photodynamic Therapy // Eur. J. Org. Chem. - 2004. - P. 1136-42.
13. Pandey S.K., Gryshuk A.L., Graham A. et al. Fluorinated photosensitizers: synthesis, photophysical, electrochemical, intracellular localization, in vitro photosensitizing efficacy and determination of tumor-uptake by 19F in vivo NMR spectroscopy // Tetrahedron. - 2003. -P. 10059-73.
14. Sibrian-Vazquez M., Jensen T.J., Hammer R.P., Vicente M.G.H. Peptide-Mediated Cell Transport of Water Soluble Porphyrin Conjugates // J. Med. Chem. -2006. - 49. - P. 1364-72.
Поступила 19.11.2007.
