CC BY
21УДК 543.421/.424:(547.475.2+547.99.4808:547.93) А.В. Соломонов*, Е.В. Румянцев*, Б.А. Кочергин*, Е.В. Антина*' **
СПЕКТРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ С АЛЬБУМИНОМ И ЕГО БИЛИРУБИНОВЫМ КОМПЛЕКСОМ
(*Ивановский государственный химико-технологический университет, **Институт химии растворов им. Г.А. Крестова РАН) e-mail: [email protected]
С применением электронной абсорбционной спектроскопии, а также эмиссионной флуоресценции исследовано взаимодействие аскорбиновой кислоты (ASC) с альбумином (BSA) и его макромолекулярным комплексом с билирубином (BR*BSA). Взаимодействие между белками и ASC осуществляется путем статического тушения флуоресценции и имеет преимущественно гидрофобный характер. Численные значения констант связывания ASC с BSA и BR'BSA составили 2.2^10 и 1.5^10 л/моль соответственно. Средние расстояния между донором (белок) и акцептором (ASC) равны 1.67 и 2.07 нм соответственно. С использованием синхронной флуоресцентной спектроскопии проведен анализ влияния ASC на конформационные изменения белковых молекул.
Ключевые слова: билирубин, аскорбиновая кислота, бычий сывороточный альбумин, электронная спектроскопия, синхронная и эмиссионная флуоресценция, тушение флуоресценции, уравнение Штерна-Фольмера, теория Фёрстера
Сывороточные альбумины - одни из самых распространенных белков в плазме крови. Они обладают уникальной способностью к молекулярному транспорту многих соединений - ли-пидов, витаминов, желчных кислот, лекарственных веществ и др.[1]. Альбумины имеют в своей структуре сайты связывания для различных типов молекул, которые могут вступать во взаимодействие с белком, благодаря специфическим и неспецифическим взаимодействиям, что позволяет быстро выявить реакционные центры в молекуле и определить механизм присоединения. Это имеет важное диагностическое значение при исследовании биомолекул, представляющих интерес в качестве потенциальных лекарственных препаратов [2]. Кроме того, тушение собственной флуоресценции альбуминов под действием веществ различной природы рассматривается как основа для разработки современных тест-систем по определению типа и способности низкомолекулярных соединений к взаимодействию с белками, а также в дизайне лекарственных препаратов и молекулярном распознавании [3]. Благодаря собственной (излучение остатков триптофана) или наведенной (флуоресцентные зонды) флуоресценции белков, а также высокой чувствительности их к изменениям полярности среды для исследования взаимодействия целесообразно использовать флуоресцентную спектроскопию.
Интересной особенностью альбумина является его способность к образованию макромолеку-лярного комплекса с билирубином (ВЯ) - желчным пигментом, линейным тетрапирролом, образующимся при распаде гема крови. В высоких кон-
центрациях данный пигмент является токсичным веществом, а в низких выступает в качестве анти-оксиданта, как было показано в ряде работ [4,5]. BR выступает в качестве антиоксиданта по отношению к аскорбиновой кислоте (ASC) [6], которая сама по себе является мощным антиоксидантом и способна предохранять мембрану клетки от окисления, препятствовать развитию цинги и сердечно-сосудистых заболеваний. Окисление альбуминового комплекса билирубина (BR^BSA) сопровождается проявлением «эффекта белковой защиты», что вызвано вовлечением реакционных центров молекулы пигмента в межмолекулярные взаимодействия с функциональными группами полипептидной цепи [7]. Установлено также, что и аналоги билирубина - порфирины обладают ан-тиоксидантным действием, исследовалась также кинетика перекисного окисления их металлоком-плексов [7]. Таким образом, тип и специфика окружения BR, создаваемого межмолекулярными взаимодействиями, оказывают значительное влияние на проявление биологических эффектов не только самого пигмента, но также белка-носителя и присоединенных к нему молекул.
BR в конформации «ridge-tile»
HO
H
O.
O
HO OH ASC (Z-изомер)
Поэтому целью настоящей работы стало исследование молекулярного комплексообразова-ния BSA и BRBSA с ASK в водных растворах при pH 7.4, поддерживаемым фосфатным буфером.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использованы В SA (Агат-Мед, Россия, М= 66 430.3 Да) марки «х.ч.», BR-BSA (Агат-Мед, Россия, M = 67 014.9 Да) квалификации «х.ч.», ASC «х.ч.» (Химмед, Россия).
Все эксперименты проводили в фосфатном буфере при pH 7.4. Спектры флуоресценции растворов исследуемых соединений регистрировали на спектрофлуориметре «Cary Eclipse» («Varian-Agilent», США-Австралия). Спектры регистрировали в диапазоне длин волн 290-750 нм, длина волны возбуждения составляла 280 нм. Спектры синхронной флуоресценции снимали в диапазоне длин волн 190-750 нм при разнице в длинах волн возбуждения и эмиссии 15 и 60 нм. Скорость регистрации спектров составляла 1200 нм/мин при напряжении детектора в 600 В. Ширина щелей возбуждения и эмиссии во всех случаях составляла по 5 нм. Все эксперименты проводили в термо-статируемой ячейке c модулем переноса тепла Пельтье PTC-2 при 298 ± 1 К.
Электронные спектры поглощения исследуемых растворов регистрировали в диапазоне длин волн 190-800 нм на спектрофотометрах СФ-103, СФ-104 («Аквилон», Россия). Все исследования проводили в кварцевых кюветах с толщиной светопоглощающего слоя 1 см.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Флуоресценция белка, как в свободном, так и в связанном состоянии, в основном, обусловлена остатками тирозина = 305 нм), триптофана (Xfi = 348 нм) и приходится на 336 нм. Следует отметить, что интенсивность флуоресценции белкового комплекса в 2.5 раза меньше, чем самого белка при одинаковых концентрациях веществ. Данное тушение флуоресценции обусловлено комплексообразованием с билирубином BR и взаимодействием триптофана с BR. Важно было определить предельное значение концентрации, при котором не происходит тушения за счет собственных ассоциативных процессов, которое для данных белков составляет -1.75-10-5 моль/л.
При увеличении концентрации ASK в растворе интенсивность флуоресценции BSA и BR-BSA уменьшается (рис. 1, а) согласно закону Штерна - Фольмера [9] :
(1)
- 1 + T()kq [Q] - 1 + KSF [Q] :
F
где ^о, ^ - относительные интенсивности флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя соответственно, т0 - среднее время жизни флуоресценции (в отсутствие тушителя), с; kq — константа скорости тушения флуоресценции, л/(моль-с); [()] - концентрация тушителя, К5у - константа динамического тушения (константа Штерна - Фольмера), л/моль.
а
1000
290
г F0/F
340
390
440
490
Рис. 1. Спектры эмиссионной флуоресценции BSA (c0 = 1.25-10-5 моль/л, 1) в присутствии аскорбиновой кислоты (cASC, моль/л-105 от 1 до 6: 0; 2.04; 4.09; 6.13; 8.18; 3.03; 1.02) при Т = 298 К (а) и соответствующие зависимости относительной флуоресценции BSA (1) и BR-BSA (2) от концентрации тушителя (б) Fig. 1. Fluorescence emission spectra of BSA (c0 = 1.25-10-5 mol/l) in the presence of ascorbic acid (cASC, mol/H05) from 1 to 6: 0, 2.4, 9.4, 6.13, 8.18, 3.03; 1.02) at T = 298 K (a) and the corresponding dependence of the relative fluorescence of BSA (1) and BR-BSA (2) on the concentration of quencher (6)
Зависимости относительной флуоресценции BSA и BR-BSA от концентрации ASC в координатах уравнения Штерна-Фольмера показаны на рис. 1, б. Их линейность сохраняется только на небольшом участке концентраций тушителя, в среднем до 8-10-5 моль/л, после которой наблюдается положительное отклонение от уравнения
Штерна - Фольмера. Это свидетельствует об образовании молекулярных комплексов исследуемых биополимеров с ASC, преимущественно, за счет гидрофобных взаимодействий п-систем триптофана и ASC [10]. Константы динамического тушения KSv, вычисленные по уравнению (1), для BSA и BR-BSA близки по своим значениям, и равны (2.1±0.2)-10 и (1.6±0.2)-104 л/моль соответственно. Принимая время жизни флуоресценции BSA и BR-BSA т0=10-8 с [10], были определены константы скорости тушения kq. Их численные значения составили (2.1±0.2)-10ft и (1.6±0.2)-1012 л/(моль-с) соответственно, что свидетельствует о большей скорости тушения флуоресценции свободного белка. Следует отметить, что величины kq в 10 раз больше диффузионного предела тушения при максимальном разбросе столкновений различных тушителей и биополимеров [11]. Таким образом, тушение флуоресценции BSA и BR-BSA ASC вызвано образованием молекулярных комплексов, а не связано с динамическими столкновениями. В этой связи в дальнейшем была применена теория статического тушения флуоресценции.
Определение параметров образования молекулярных комплексов между BSA, BR-BSA и ASC в рамках теории статического тушения было сделано с помощью модификации уравнения Штерна - Фольмера, предполагающего наличие одного типа сайтов связывания молекул тушителя, линейная функция которого представляет собой классическое уравнение Скэтчарда (2) [12]:
\g^- = n\gKb-n\g- 1 ' (2)
F
[Q]-[F].
F0-F F,
эффективнее связывается с BSA по сравнению со связанным в комплекс с билирубином белком.
Однако в общем случае, статическое тушение не всегда связано с комплексообразовани-ем, а с тем, что молекулы тушителя находятся вблизи молекул флуорофора. В связи с этим было использовано понятие «сфера тушения» - пространство вокруг флуорофора, внутри которого вероятность тушения равна единице. Уравнение, описывающее эту ситуацию, является модификацией уравнения Штерна - Фольмера с поправкой на распределение Пуассона:
' \(3)
1+ К roiexp№i F ~ 1 + Â^QJexp юоо
= ЗД]ехр|
где V - объем сферы тушения (F=(4/3)7ii? , R - радиус сферы тушения, м).
Вычисленные параметры тушения (Ksv и kq) находятся в хорошем согласии с полученными ранее. Радиус сферы тушения составил 10.9 ±0.8 и 9.5 ± 0.8 нм для BSA и BR-BSA, соответственно, и превышает сумму максимальных размеров белковой глобулы и ASC, что свидетельствует о достаточно сильном их взаимодействии и первичности тушения перед диффузионным процессом.
Эффективность взаимодействия В SA и BR-BSA с ASC была описана также в рамках модели безызлучательного переноса энергии Фёр-стера [13]:
Fn
R
тл 6 . 6
R0 + г
(4)
К='<
Г F(À)s(Â)À4dÂ
•Ц 5
где n - число сайтов связывания, Кь - константа связывания (константа статического тушения), л/моль; [F] - концентрация флуорофора (в данном случае BSA и BR-BSA), моль/л. Константы статического тушения, рассчитанные с использованием уравнения (2), для BSA и BR-BSA составили (2.2±0.2)-10 и (1.5±0.2)-104 л/моль соответственно. Таким образом, данные флуоресцентной спектроскопии, характеризующие взаимодействие BSA и BR-BSA с ASC, хорошо описываются в рамках модели статического тушения. Тушение происходит в результате образования в основном состоянии нефлуоресцирующего молекулярного комплекса белка с ASC. В образовании комплексов, наряду с универсальными, в том числе гидрофобными взаимодействиями, могут принимать участие донорно-водородные связи между OH- и кето-группами ASC и NH-, N^-группами полипептидной цепи. Следует отметить, что термодинамически комплекс BSA-ASC является более стабильным по сравнению с BR-BSA-ASC, то есть ASC
\ F(À)dЯ ■Ч
где R0, см - фёрстеровский радиус, или характеристическое расстояние, при котором эффективность переноса составляет 50 %; r, см - расстояние между донором и акцептором; Ф - квантовый выход донора (для BSA Ф = 0.15 [14]); п - показатель преломления среды (для водных растворов 1.333 [15]); k2 - фактор взаимной ориентации в пространстве дипольных моментов переходов донора и акцептора (принимается равным 2/3, что соответствует беспорядочной ориентации доноров и акцепторов за счет вращательной диффузии до переноса энергии); E - эффективность переноса энергии; F(X) - спектр эмиссионной флуоресценции флуорофоров; е(Я) - спектр поглощения тушителя. Для нахождения интеграла перекрывания спектры поглощения и флуоресценции (рис. 2) были аппроксимированы гауссовыми кривыми в области от 290 до 550 нм.
Константу скорости переноса энергии kT, с-1 от донора к акцептору определяли по уравнению:
/ „ чб
кт = — ■ т
Rn
(5)
г
290 340 390 440 490 540
Рис. 2. Перекрывание спектра поглощения (1) ASC, с = 2.86-10-5 моль/л и спектра эмиссионной флуоресценции (2) BSA, с = 1.75-10-5моль/л (cASC : cBSA = 1.619) при Т = 298 К
Fig. 2. Overlapping the absorption spectrum (1) ASC (c = =2.86-10-5 mol/l) and the fluorescence emission spectrum (2) BSA, c = 1.7510-5 mol/l (cASC : cBSA = 1.619) at T = 298 K
Рассчитанные значения параметров взаимодействия BSA и BR-BSA с ASC в рамках модели Фёрстера приведены в таблице.
Полученные значения r лежат в пределах 0.5R0 < r < 2R0, что свидетельствует о высокой вероятности переноса энергии с остатков триптофана исследуемых белков на ASC. Расстояние донор - акцептор и фёрстеровский радиус заметно меньше радиуса сферы тушения. Следует отметить, что замена В SA на BR-BSA вызывает уменьшение констант скорости тушения и связы-
вания, уменьшается эффективность и константа скорости переноса энергии и радиус сферы тушения. Число сайтов связывания ASC на BR-BSA оказывается меньше по сравнению с BR-BSA: для BR-BSA среднее значение п составляет 1.21, а для BSA - 1.62. Вместе с этим наблюдается рост значений фёрстеровского радиуса и расстояния донор-акцептор. Это свидетельствует, как было отмечено выше, о лучшем взаимодействии ASC с BSA по сравнению с его билирубиновым комплексом.
Сравнение полученных данных с результатами работы [10] показывает, что замена трис-HC1 на фосфатный буфер никак не сказывается на константе связывания ASC с BSA. Вместе с тем наблюдается рост значений K$y и kq в 1.3 раза с одновременным увеличением чисел сайтов связывания примерно в полтора раза. Параметры связывания, рассчитанные по теории Фёрстера, также имеют достаточно сильные различия. Эффективность переноса энергии увеличивается в 1.6 раза с одновременным уменьшением R0 и r в 1.9 и 2.2 раза соответственно. Таким образом, отмечается влияние среды на параметры взаимодействия ASC с BSA. Применение фосфатного буфера положительно сказывается на геометрических параметрах связывания, причем энергетика образующихся комплексов практически не меняется.
Таблица
Параметры взаимодействия BSA и BR-BSA с ASC, рассчитанные на основании уравнения Фёрстера
Система E J(k) • 1016, л см3/моль R0, нм r, нм kT • 10-7, c-1 n; [Q]:[F]
BSA + ASC 0.2640 2.488 1.42 1.69 3.59 1.62
BR-BSA + ASC 0.2016 6.017 1.65 2.07 2.53 1.21
Высокая чувствительность откликов флуоресценции остатков триптофана на возникающие межмолекулярные контакты дают возможность изучить структурно-конформационные изменения в белковых глобулах BSA и BR-BSA при взаимодействии с ASC. Согласно [16], синхронная флуоресцентная спектроскопия при разнице в значениях длин волн возбуждения и излучения ДА, в 15 или 60 нм дает ценную информацию о вкладах, определяющих взаимодействие остатков триптофана и тирозина с низкомолекулярным лигандом. С этой целью были зарегистрированы спектры синхронной флуоресценции растворов BSA и BR-BSA с различным содержанием ASC (рис. 3). Добавление ASC вызывает тушение флуоресценции белка. Интенсивность флуоресценции тирозиновых остатков уменьшается примерно на 63% (для BR-BSA на 51%), причем максимум длины волны излучения смещается от 286
до 290 нм, в то время как флуоресценция трипто-фановых остатков уменьшается примерно на 60% (для BR-BSA на 46%), максимум пика также смещается от 278 до 290 нм. Таким образом, происходят аналогичные уменьшения доли флуоресценции тирозина и триптофана. В BSA триптофа-новые группы расположены в гидрофобных доменах IB и IIA (Trp-158, Trp-235), в то время как остатки тирозина расположены в субдоменах IA (Tyr-54, Tyr-108), IB. (Tyr-163, Tyr-171, Tyr-173, Tyr-179 и Tyr-180) и IIA (Tyr-286) [17]. Полученные результаты позволяют предположить, что ASC может связываться с BSA в этих областях и некоторые виды флуорофорных групп могут иметь равный доступ к тушителю. Кроме того, при добавлении ASC наблюдались заметные бато-хромные сдвиги максимумов флуоресценции обоих аминокислотных остатков. Эти смещения указывают на то, что конформация белков изменяется
и остатки триптофана и тирозина оказываются расположенными в менее гидрофобной среде.
Рис. 3. Спектры синхронной флуоресценции BSA (c0 = 1.2540"5 моль/л,) при ДХ = 15 нм (а) и ДХ = 60 нм, (б)в присутствии аскорбиновой кислоты (cASC, моль/л-105) от 1 до 6:
0; 2.04; 4.09; 6.13; 8.18; 3.03; 1.02) при Т = 298 К Fig. 3. Synchronous fluorescence spectra of BSA (c0 = 1.2510-5 mol/l) at ДХ = 15 nm (a) and at ДХ = 60 nm (б) in the presence of ascorbic acid (cASC, mol/H05) from 1 to 6 0, 2.4, 4.9, 6.13, 8.18, 3.03; 1.02) at T = 298 K
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что тушение флуоресценции BSA и BR-BSA ASC является результатом образования молекулярных комплексов. Стабилизация комплексов осуществляется посредством статического механизма тушения флуоресценции вследствие преимущественно гидрофобного взаимодействия. Образующиеся комплексы являются среднепрочными (константы связывания составляют ~104 л/моль), что позволяет ASC легко диссоциировать и, в дальнейшем, легко взаимодействовать с высокоспецифическими рецепторами-мишенями. Установлено, что при образовании комплексов конформация белка меняется и происходит перемещение остатков тирозина и триптофана в более гидрофильную область. Выявлено, что ASC эффективнее связывается с BSA по сравнению с BR-BSA. Также получены сведения о влиянии среды на процессы взаимодействия ASC с В SA и BR-BSA.
НИИ Макрогетероциклических соединений, кафедра неорганической химии
Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации для молодых российских ученых - кандидатов наук (№ МК-401.2011.3) и Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (госконтракт № 14.740.11.0617) и гранта РФФИ (грант № 12-03-31309) в НИИ Макрогетероциклических соединений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пшенкина Н.Н // Фармакология. 2011. Т. 12. С. 1067-1091; Pshenkina N. N. // Phaimakologiya. 2011. V. 12. P. 10671091 (in Russian).
2. Bertucci C., Cimitan S. // J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2003. V. 32. N 4. С. 707-714.
3. Böhm J., Schneider G. Protein-ligand interactions: from molecular decognition to drug-design. Wiley-VCH. Germany. 2003. 262 p.
4. Антина Е.В., Румянцев Е.В. Химия билирубина и его аналогов. М.: Изд-во «КРАСАНД». 2009. 352 с.; Antina E.V., Rumyantsev E.V. Chemistry of bilirubin and its analogs. M.: KRASAND. 2009. 352 p. (in Russian).
5. Solomonov A.V., Rumyantsev E.V., Antina E.V. // Russian Journal of Physical Chemistry A. 2010. V. 84. N 12. P. 2061-2065.
6. Соломонов А.В., Румянцев Е.В., Кочергин Б.А., Антина Е.В. // ЖФХ. 2012. Т. 86. Вып. 7. С. 1-6; Solomonov A.V., Rumyantsev E.V., Kochergin B.A., Antina E.V. // Russian Journal Physical Chemistry A. 2012. V. 85. N 7. P. 1048-1052.
7. Chatterjee S., Srivastava T.S. // Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 2000. V. 4. N 2. P. 147-157.
8. Агеева Т.А., Глазкова М.Е., Койфман О.И., Николаева О.И., Румянцева Ю.В. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2011. Т. 54. Вып. 3. С. 104-108;
Ageeva T.A., Glazkova M.E., Koifman O.I., Nikolaeva O.I., Rumyantseva Yu.V. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2011. V. 54. N 3. P. 104-108 (in Russian).
9. Lakowicz J. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd ed. Springer. New York. 2007. 954 p.
10. Xu H., Liu Q., Zuo Y., Bi Y., Gao S. // Journal Solution Chemistry. 2008. V. 38. N 1. P. 15-25.
11. Trnkova L., Bousova I., Rysankova L., Vrabcova P., Drsata J. // Proceedings of ECOpole. 2009. V.3. N 1. P. 27-35.
12. Varlan A., Hillebrand M. // Revue Roumaine de Chimie. 2010. V. 55. N 1. P. 69-77.
13. Förster T., Sinanoglu O. Modern Quantum Chemistry. V. 3. Academic Press. N. Y. 1966. 93 p.
14. Wang N., Ye L., Zhao B.Q., Yu J.X. // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2008. V. 41. N 7. P. 589-595.
15. Stan D., Matei L, Mihailescu C., Savin M., Matache M., Hillebrand M., Baciu I. // Molecules. 2009. V. 14. N 4. P. 1614-1626.
16. Miller J.N. // Proc. Anal. Div. Chem. Soc. 1979. N 16. P. 203-208.
17. Sulkowska A., Rownicka J., Bojkoa B., Pozyckaa J., Zubik-Skupiena I., SuJkowski W. // J. Mol. Struct. 2004. V. 704. N 1-3. P. 291-295.
