CC BY
102
В. А. Савинов, А. М. Румянцев, Е. В. Самбук, М. В. Падкина
СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ РЕГУЛЯЦИИ
ГЕНА АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ 1 ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS
Введение
Дрожжи Pichia pastoris являются перспективным объектом молекулярной биотехнологии и широко используются для продукции белков различного происхождения. Для этой цели чаще всего применяют промоторы генов, экспрессия которых регулируется источником углерода. Промотор гена AOX1 является одним из таких промоторов. Его активность индуцируется добавлением метанола в среду. Экспрессия гена AOX1 регулируется на уровне транскрипции, мРНК AOX1 не обнаруживается при выращивании дрожжей на глюкозе и глицерине, но при переносе на среду с метанолом может достигать 5% от суммарной полиА-мРНК [8, 10]. Регуляция экспрессии гена AOX1 в значительной степени похожа на регуляцию экспрессии GAL1 гена дрожжей Saccharomyces cerevisiae: для максимальной экспрессии гена требуется не только отсутствие репрессирующего источника углерода, глюкозы, но и обязательное наличие индуктора. Именно строгая регуляция транскрипции гена AOX1, а также способность промотора AOX1 обеспечивать высокий уровень синтеза алкогольоксидазы 1 обусловили широкое использование данного промотора для гетерологичной экспрессии.
В настоящее время механизм регуляции экспрессии гена AOX1 изучен недостаточно. Известен только один ген, регулирующий экспрессию AOX1 и других генов пути утилизации метанола у дрожжей P. pastoris, MXR1. Он кодирует белок, который взаимодействует с промоторным участком гена AOX1. Этот белок имеет определенную гомологию с белком активатором Adrlp сахаромицетов [15].
Для изучения генетического контроля регуляции гена AOX1 необходимо создание удобной тест-системы. С этой целью может быть использован любой секреторный белок, активность которого можно легко тестировать на колониях дрожжей. Таким белком у дрожжей S. cerevisiae является кислая фосфатаза, представленная семейством изозимов — РЬоЗр, Pho5p, Pho10p и Phollp [3]. У P. pastoris известна одна кислая фосфатаза, продукт гена PHO1.
Для данной работы, которая является первым этапом изучения регуляции экспрессии гена AOX1 в ответ на различные сигналы окружающей среды, был выбран ген репрессибельной КФ2 — PHO5 S. cerevisiae, так как ранее была показана корреляция между активностью КФ на колониях дрожжей и уровнем экспрессии гена PHO5 [6].
Материалы и методы исследования
Штаммы. В работе использовали следующие штаммы дрожжей: GS115 (his4) P. pastoris и YM954 S. cerevisiae (МАТа ade2-101 ura3-52 his3-200 leu2-3,112 lys2-801 trp1 -901 gal4-542), любезно предоставленный Ж. Мале (J. Mallet, France).
© В.А.Савинов, А.М.Румянцев, Е.В.Самбук, М.В.Падкина, 2009
Для амплификации плазмид использовали штамм Escherichia coli DH-5a (F / en-dA1 hsdR17 (r-m+ ) supEJJ thi-1 recAl gyrA (Nalr) relAl A(lacZYA-argF)U169 deoR (4>80dlacA(lacZ)M15)).
Плазмиды. Для создания вектора экспрессии pPIC9-AOX1-PHO5 использовали плазмиду pPIC9 («Invitrogen», США), содержащую промоторную и терминаторную области гена алкогольоксидазы 1, последовательность сигнального пептида а-фактора (MFa1 ) дрожжей S. cerevisiae, полилинкерную область и ген HIS4.
Для проведения ПЦР использовали праймеры комплементарные 5'- и 3'-последовательностям гена PHO5 дрожжей S. cerevisiae. Последовательность прямого праймера 5'-CGGGATCCCGAGATTACCAA-3' содержит сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции BamHI (GGATCC), последовательность обратного праймера 5'-CGGAATTCCAAAACTATTGT-3' содержит сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции EcoRI (GAATTC). ПЦР проводили с использованием Taq полимеразы (Fermentas, Литва). В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК дрожжей
S. cerevisiae. Для амплификации фрагмента ДНК проводили 20-50 циклов реакции по следующей программе: плавление цепей ДНК —при 95°С в течение 60 с, отжиг праймеров — в течение 60 с при температуре 40°С, полимеразная реакция — при 72°С в течение 60 с. После окончания ПЦР пробу инкубировали при 72°С в течение 7 мин.
Трансформацию дрожжей и бактерий [1, 4], выделение ДНК из клеток бактерий и дрожжей [12], электрофорез ДНК в агарозном геле [5] проводили в стандартных условиях стандартными методами. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции, выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей и лигирование фрагментов ДНК проводили в условиях, предложенных фирмой-производителем ферментов и реагентов (Fermentas, Литва).
Мутагенез. Для получения мутантов P. pastoris с отсутствием активности репрес-сибельной КФ клетки штамма GS115 высевали в количестве 103-104 на чашку Петри со средой ПЕП и облучали УФ в течение 30 с (35 мВт/м2), затем культивировали в темноте при 30°С.
Качественное определение активности КФ у дрожжей P. pastoris проводили по стандартной методике, разработанной ранее [6].
Условия культивирования штаммов. В работе использовали минимальную среду Md и полные среды YPD, ПЕП стандартного состава [2]. Для выращивания штамма GS115, несущего мутацию в гене HIS4, в минимальную среду добавляли 20 мг гистидина на 1 л среды. Для индукции экспрессии гена PHO5, находящегося под контролем промотора гена AOX1, клетки P. pastoris переносили на минимальную среду, содержащую в качестве источника углерода вместо глюкозы метанол в концентрации 1%. Для подавления активности КФ у дрожжей P. pastoris использовали среду ПЕПФО с KH2PO4 в концентрации 500 мг/л.
Результаты исследования и их обсуждение
Создание удобной тест-системы для изучения регуляции гена AOX1 дрожжей P. pastoris предполагало конструирование плазмиды на основе вектора pPIC9, содержащей репортерный ген PHO5 под контролем промотора AOX1 и получение штамма P. pastoris, лишенного активности КФ.
Для получения плазмиды pPIC9- A OX1-PHO5 синтезировали последовательность гена PHO5, фланкированную сайтами рестрикции BamHI и EcoRI, методом ПЦР по матрице хромосомной ДНК дрожжей S. cerevisiae. Встраивание этого фрагмента ДНК
АР
рВИ322
5'АОХ1 939 ВатНІ Бі^аі 1223 ЕсоШ З'АОХІ (ТТ)
З'АОХІ
НШ4
ВатНІ
ЕсоШ
ВатНІ
РН05
1400 Ьр
ЕсоШ
Рис. 1. Схема конструирования плазмиды pPIC9-A0X1-PH05 на основе вектора pPIC9, содержащей кодирующую последовательность гена РН05 под контролем промотора гена АОХ1.
в вектор рР1С9 осуществляли по сайтам ВатН1 -ЕсоЯ1 таким образом, чтобы кодирующая часть гена РН05 оказалась под контролем промотора АОХ1 и последовательность сигнального пептида Ы¥а1, обеспечивающая секрецию гетерологичных белков, была замещена оригинальной сигнальной последовательностью КФ2. Схема конструирования представлена на рис. 1.
Последовательность гена РН05, фланкированную сайтами рестрикции ВатН.I и ЕсоЯ1, получали методом ПЦР по матрице хромосомной ДНК дрожжей 5. сетеу1в1ае. Встраивание этой последовательности в вектор рР1С9 осуществляли по сайтам ВатН1 -ЕсоЯ1 таким образом, чтобы кодирующая часть гена РН05 оказалась под контролем промотора А0Х1.
Структуру полученной плазмиды рР1С9-А0Х1-РН05 анализировали, обрабатывая ее эндонуклеазами рестрикции ВатН1 и Ба11. На электрофо-реграмме (рис. 2) присутствуют фрагменты ДНК, соответствующие теоретически ожидаемым.
Следующий этап — получение у штамма GS115 мутантов с отсутствием или снижением активности КФ. Появление мутантов индуцировали с помощью УФ. Среди примерно 1500 клонов были выявлены 4 мутанта с различной степенью снижения активности КФ. Один из них — 4-GS115, у которого активность КФ отсутствовала, был выбран в качестве реципиента для трансформации.
Клетки штамма 4-GS115, несущего мутацию Ыэ4, приводящую к потребности в гистидине, трансформировали линеаризованным ВдШ-фрагментом плазмиды рР1С9-А 0Х1-РН05, что обеспечивает встраивание фрагмента в локус АОХ 1 за счет гомологичной рекомбинации с промотором и терминатором гена АОХ 1. В связи с тем, что плазмида рР1С9-А0Х1-РН05 содержит маркерный ген дикого типа Н1Б4, трансформанты отбирали на селективной среде по восстановлению способности синтезировать гистидин и далее анализировали активность КФ у трансформантов на разных средах.
Активность КФ у штаммов Р. равіогів в средах различного состава
Среда Наличие активности КФ у штаммов Р. равіогів
вві 15 (РНОІ) 4-08115 4-08115 [А0Х1-РН05]
ПЕП + — —
ПЕПФО — — —
Мс1 + гистидин — — —
Мс1 + метанол — — +
Оказалось, что у этих трансформантов активность КФ появляется только после индукции промотора АОХ1 метанолом (таблица). Этот факт свидетельствует о том, что КФ2 секретируются на поверхность колоний Р. разіогіз, следовательно, сигнальный пептид КФ2 5. сегеуізіае успешно работает в клетках Р. разіогіз.
10000
8000
6000
5000
4000
Рис. 2. Рестрикиционный анализ плазмид.
Дорожки: 1 —плазмида pPIC9-A0X1-РН05; 2 —вектор pPIC9 (8023 п.о.), обработанный рестриктазой ВатН1; 3 — плазмида pPIC9- А0Х1-РН05, обработанная рестриктазой ВатН1 (ок. 9100 п.о.); 4 — плазмида pPIC9-А0Х1-РН05, обработанная рестриктазой Ба11 (3300 и 5800 п.о.); 5 — ДНК-маркер.
Заключение
Метилотрофные дрожжи P. pastoris первоначально привлекли внимание в качестве возможного источника относительно недорогого кормового белка. В связи с этим были разработаны среды и технологии длительного культивирования, позволяющие получать значительную биомассу дрожжей, что явилось одной из причин широкого использования дрожжей P. pastoris в биотехнологии [7]. Еще одним преимуществом P. pastoris является наличие сильного строго регулируемого промотора гена AOX1, транскрипция которого репрессируется глюкозой и глицерином и индуцируется только метанолом. Это отличает дрожжи P. pastoris от дрожжей Hansenula polymorpha, у которых экспрессия гомологичного гена MOX1 происходит и на среде с глицерином [14]. В то же время P. pastoris является неудобным генетическим объектом вследствие гомоталлич-ности, и поэтому генетика объекта развита слабо.
В силу этого создание тест-системы, основанной на использовании репортерно-го гена PHO5 сахаромицетов, находящегося под контролем промотора гена АОХ1 P. pastoris, позволит изучать как генетический контроль регуляции экспрессии гена AOX1, так и влияние факторов среды на уровень экспрессии этого гена.
КФ2 имеет классическую сигнальную последовательность, состоящую из 17 аминокислот [11]. Существуют примеры успешной секреции гетерологичных белков дрожжами S. cerevisiae при помощи этой лидерной последовательности, например, гирудина Hirudo medicinalis, потенциального ингибитора тромбина [9]. Известно, что мутантная КФ2, лишенная сигнальной последовательности, тем не менее, оказывается на поверхности клеток дрожжей. Причиной этого является наличие дополнительного сигнала секреции, расположенного в N-концевой части зрелого белка [13]. В предварительных экспериментах нами было показано, что в отличие от дрожжей-сахаромицетов уровень секреции КФ у P. pastoris очень низок. Причиной может являться менее эффективная работа сигнального пептида PHO1 или отсутствие дополнительного сигнала секреции.
Использование данной тест-системы представляет не только практический, но и теоретический интерес, так как позволит подобрать оптимальные условия для культивирования метилотрофных дрожжей-продуцентов и оценить возможности использования сигнальной последовательности КФ2 дрожжей сахаромицетов для секреции гетероло-гичных белков дрожжами P. pastoris.
Литература
1. Гловер Д. Клонирование ДНК. М., 1988. С. 538.
2. Захаров И. А., Кожин С. А., Кожина Т. Н., Федорова И. В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л., 1976. 143 с.
3. Краснопевцева Н. Г., Уразманова Н. А., Падкина М. В, Смирнов М. Н. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей. XII. Выделение и характеристика репресси-бельных кислых фосфатаз у дрожжей // Вестн. Ленингр. ун-та. 1986. №3 (3). С. 98-106.
4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984. 480 с.
5. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М., 2002. 248 с.
6. Самсонова М. Г., Падкина М. В., Краснопевцева Н. Г., Кожин С. А. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. 1975. №9 (11).
С. 104-115.
7. Cereghino J. L., Cregg J. M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // FEMS Microbiol. Rev. 2000. Vol. 24. P. 45-66.
8. Cregg J. M., Vedvick T. S., Raschke W. C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris // Biotechnology. 1993. Vol. 11. P. 905-910.
9. Heim J., Takabayashi K., Meyhack B., Marki W., Pohlig G. C-terminal proteolytic degradation of recombinant desulfato-hirudin and its mutants in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 226. P. 341-353.
10. Lin-Cereghino G. P., Godfrey L., de la Cruz B. J., Jonson S., Khuongsathiene S., Tol-storukov I., Yan M., Lin-Cereghino J., Veenhuis M., Subramani S., Cregg J. Mxr1p, a key regulator of the methanol utilization pathway and peroxisomal genes in Pichia pastoris // Mol. Cell Biol. 2006. Vol. 26. P. 883-897.
11. Monod M., Sive S., Haguenauer-Tsapis R., Rauseo-Koenig I., Hinnen A. In vivo and in vitro studies of PHO5 mutants at the signal peptidase cleavage site // Proc. Alko Symp. on Industr. Yeast Genet. Helsinki, 1987. Vol. 5. P. 149-154.
12. Sambrook J., Russel D. W. Molecular cloning: A laboratory manual, 3d ed. New York, 2001. 2222 p.
13. Silve S., Volland C., Hinnen A., Haguenauer-Tsapis R. In vivo translocation of the cell wall acid phosphatase across the yeast endoplasmic reticulum membrane: are there multiple signals for the targeting process // Biochimie. 1990. Vol. 72. P. 103-114.
14. Sudbery P. E. The expression of recombinant proteins in yeast // Curr. Opin. Biotechnol. 1996. Vol. 7. P. 517-524.
15. Tschopp J.F., Brust P.F., Cregg J.M., Stillman C.A., Gingeras T. R. Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris // Nucl. Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 3859-3876.
Статья поступила в редакцию 31 июля 2009 г.
