CC BY
72
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
1
УДК 633.18:577.2:57.088
СОЗДАНИЕ СЕЛЕКЦИОННЫХ ФОРМ РИСА, НЕСУЩИХ ГЕН ШИРОКОГО СПЕКТРА УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ Pi-40, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ
Супрун Иван Иванович к.б.н., с.н.с. [email protected]
Ковалев Виктор Савельевич
д.с.-х.н. зам. директора института по научной
работе
Шиловский Валентин Николаевич д.с.-х.н. зав. отделом
Всероссийский научно-исследовател ьский институт риса, п.Белозерный, г.Краснодар, Россия
Представлены результаты работы по созданию селекционных форм риса, несущих ген широкого спектра устойчивости к пирикуляриозу Pi-40. Для идентификации доминантной аллели гена использовали ДНК - маркерный анализ. С применением кодоминантных ДНК-маркеров отобраны растения самоопыленных популяций, несущие доминантный аллель данного гена в гомозиготном состоянии
Ключевые слова: ПИРИКУЛЯРИОЗ, ГЕНЫ ШИРОКОГО СПЕКТРА УСТОЙЧИВОСТИ, PIRYCULARIA ORYZA, МАРКЕРНАЯ СЕЛЕКЦИЯ
UDC 633.18:577.2:57.088
CREATION OF RICE BREEDING LINES, CARRYING BROAD SPECTRUM BLAST RESISTANCE GENE Pi-40 USING DNA-MARKERS METHODS
Suprun Ivan Ivanovich Cand.Biol.Sci., senior staff scientist [email protected]
Kovalev Victor Savelyevich
Dr. Sci.Agr., deputy director of science
Shilovskiy Valentin Nikolaevich Dr.Sci.Agr., head of the laboratory All Russian Rice Research Institute, p.Belozerny, Krasnodar, Russia
The results of development of rice breeding lines, carrying the wide range resistance gene to rice blast disease - Pi-40. For identification of the dominant allele of the gene the DNA - marker analysis was used. With co-dominant DNA markers plants from inbred populations that carry a dominant allele of this gene in the homozygous state were selected
Keywords: RICE BLAST DISEASE, BROAD SPECTRUM RESISTANCE GENES, PIRYCULARIA ORYZA, MARKER-ASSISTED BREEDING
Доминирующее положение, по степени вредоносности для риса, в Краснодарском крае занимает пирикуляриоз. Основными причинами распространения и вредоносности этого заболевания являются: использование сортов интенсивного типа, применение повышенных доз азотных удобрений, регуляторов роста, неоправданное увеличение норм высева семян, нарушение приемов технологии возделывания риса [1].
В Краснодарском крае при благоприятных для патогена условиях отмечается эпифитотийное развитие болезни [2].
В системе интегрированной защиты растений от болезней наиболее эффективным элементом является селекция устойчивых сортов, возделывание которых позволяет снизить объем применения пестицидов,
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
2
загрязняющих окружающую среду, и получить стабильный
высококачественный урожай зерна риса. При этом особого внимания, с точки зрения эффективности, заслуживает создание сортов, несущих несколько генов устойчивости к патогену. Помимо создания сортов с пирамидированными (объединенными в одном генотипе)
расоспецифическими генами устойчивости, перспективным является селекция сортов, несущих гены широкого спектра устойчивости к пирикуляриозу [3, 4].
Одна из наиболее современных селекционных технологий - ДНК-маркерная селекция, предполагает использование ДНК-маркеров для идентификации генов устойчивости в селекционном материале без проведения фитопатологического тестирования экспериментальных растений, что позволяет сохранить гибридные образцы и использовать максимальное их количество для выполнения возвратных скрещиваний, при необходимости. Использование ДНК-маркерного отбора дает возможность в максимально короткие сроки выполнять интрогрессию генов устойчивости из генетически отдаленной генплазмы путем выполнения серии возвратных скрещиваний, при постоянном контроле наличия целевых генов в гибридном потомстве с помощью ДНК-маркеров
[5, 6].
Ген широкого спектра устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-40 в соответствии с современными литературными данными, обеспечивает устойчивость к широкому спектру рас патогена [7]. По данным выполненного ранее нами фитопатологического тестирования, линии риса, несущие данный ген, проявили высокую степень устойчивости к Краснодарской популяции возбудителя пирикуляриоза (от 4 до 13% ИРБ, при степени поражения сорта-стандарта Хазар 83%) [8].
Данный ген был интрогрессирован в геном культурного риса Oryza sativa подвида из дикого вида Oryza australensis. В качестве реципиента
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
3
при интрогрессии был использован корейский сорт подвида japonica. Была получена интрогрессивная линия IR65482-4-136-2-2, несущая данный ген. Эта линия в дальнейшем использовалась при создании гибридной популяции, при выполнении картирования данного гена. Кроме того, на ее основе корейскими учеными был создан ряд селекционных линий, несущих ген Pi-40.
Данный ген был картирован на коротком плече хромосомы 6. В настоящее время идентифицирована область генома с локализацией данного гена протяженностью 95 тыс. пар оснований (Рис. 1) [9].
Рисунок 1 Генетическая карта области локализации гена широкого спектра устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-40 На рисунке стрелкой отмечена локализация гена. ДНК-маркер 9871.T7 является косегрегирующим (сонаследуемым) с данным геном, что делает его наиболее ценным для использования в маркерной селекции. В то же
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
4
время, два фланкирующих микросателлитных локуса (RM527 и RM 3330), расположенных на дистанции 1,1 и 2,4 сантиморганид также представляют ценность, т.к. являются кодоминантными и могут выявлять гомо- и гетерозиготное состояние локуса данного гена. Это необходимо для идентификации гибридных растений, гомозиготных по доминантной аллели при получении самоопыленных потомств.
Широкий спектр устойчивости, определяемый данным геном, его эффективность по отношению к Краснодарской популяции возбудителя пирикуляриоза, а также наличие ДНК-маркеров, позволяющих проводить его ПЦР - идентификацию обусловили целесообразность выполнения представленной работы, основной целью которой являлось создание селекционных форм риса на основе отечественных сортов, несущих данный ген устойчивости.
Материал и методы
Донором гена Pi-40 послужили линии риса IR 83260-1-1-1-5-В, IR 83260-2-10-5-2-1-В. Линии риса, несущие ген устойчивости Pi-40 были предоставлены ВНИИриса доктором К.КЭепа (IRRI) в рамках работы международного Консорциума TRRC.
Сортами реципиентами при создании линий, несущих ген устойчивости Pi-40, послужили отечественные сорта риса Хазар и Новатор, которые использовались в качестве материнской формы. Кроме того, реципиентом являлась и гибридная линия, несущая ген устойчивости к пирикуляриозу Pi-b, созданная нами ранее на основе отечественного сорта риса Янтарь, с применением ДНК-маркерной селекции [10].
Гибридизация растений осуществлялась методом ТВЕЛЛ с применением пневмокастрации в лаборатории исходного материала [11].
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
5
Образцы ДНК выделяли из свежесрезанной части листовой пластинки гибридных растений на различных стадиях вегетационного развития. Экстракцию ДНК проводили буфером следующего состава: 20мл 1М Tris-HCl (pH 7.5), 5 мл 5M NaCl, 5 мл 0.5M EDTA (pH 8.0), 5 мл 10% SDS в общем объеме 100 мл. Часть листа (2-3см) растирали в 500 мкл экстрагирующего буфера в пластиковой пробирке объемом 1,5мл. Инкубировали образцы при 600С в течение 3 часов. Отделяли супернатант центрифугированием при 12000 об/мин. К перенесенной в чистую пробирку верхней фазе добавляли 500 мкл изопропанола, оставляли для преципитации на 10-20 минут при комнатной температуре, предварительно перемешав. После этого образец центрифугировали 5 минут при 12000 об/мин, полученный осадок промывали 300мкл 70% этанола, высушивали и растворяли в 200мкл 0,1*ТЕ. В ПЦР смесь добавляли по 2,5 мкл раствора ДНК, выделенного данным методом.
ПЦР проводили по стандартным методикам, с выполнением предварительной оптимизации экспериментальных параметров [12].
Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР маркеров использовали 8% акриламидный гель на основе 1*Трис-боратного буфера (0,09 М Трис, 0,09 М Борной кислоты, 2мМ ЭДТА, рН=8,2). Полимеризацию геля проводили при комнатной температуре в течение 30 минут. В качестве катализаторов полимеризации использовали ТЕМЕД и аммония персульфат, из расчета 40 мкл ТЕМЕ Да (100% раствор) и 350 мкл аммония персульфата 10%-ного на 40 мл раствора геля.
После окончания полимеризации лунки геля промывали электродным 1*Трис-боратным буфером и проводили предварительный электрофорез без внесенных образцов, для удаления из геля остатков катализаторов и незаполимеризовавшегося акриламида, при
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
6
напряжении 150V, в течение 30 минут. После этого вносили в лунки геля по 10 мкл продуктов амплификации, предварительно смешав их с буфером нанесения (40% сахароза, 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксилен цианол), при этом соблюдали соотношение: продукты ПЦР/буфер нанесения = 5/1.
Электрофорез проводили при напряжении 250V в течение 4 часов для маркера 9871.T7E и 3 часов для ДНК-маркеров RM527 и RM 3330. В работе был использован аппарат вертикального электрофореза VE-3 фирмы Хеликон. После электрофореза гелевые пластины помещали на 10 минут в раствор бромистого этидия 5мкг/мл, и фотографировали в ультрафиолетовом свете.
Результаты и обсуждение
Ранее нами была проведена оценка линий-доноров данного гена по продолжительности вегетационного периода. В результате для
гибридизации отобрали линии IR 83260-1-1-1-5-В, IR 83260-2-10-5-2-1-В, обладающие вегетационным периодом близким по продолжительности к сортам риса, районированным в Краснодарском крае.
После проведения гибридизации с отечественными сортами риса Хазар, Северный и Новатор, полученные гибридные растения Fi были проанализированы с использованием наиболее сонаследуемого с данным геном ДНК-маркера - 9871.T7. Гибридные растения с
идентифицированной доминантной аллелью использовались в качестве отцовских родительских форм при проведении возвратных скрещиваний.
Для проведения ДНК-анализа на начальном этапе были оптимизированы параметры ПЦР и электрофореза. Оптимальной для ДНК-маркеров использованных в работе определили следующую программу
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
7
ПЦР: начальная денатурация 5 мин. - 94°С, следующие 30 циклов(30 сек.- 94°С, 45 секунд -60°С, 45 секунд. - 72°С), финальный цикл синтеза 5 мин. - 72°С.
На рисунке 2 представлены результаты ПЦР - анализа с ДНК-маркером 9871.T7E2b, косегрегирующим с данным геном устойчивости.
МВ К+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 К+МВ
Рисунок 2 Результаты ДНК - маркерного анализа гибридных растений на предмет наличия доминантной аллели гена Pi-40.
МВ-маркер молекулярной массы ДНК; К + линия 1Я83260-1-1-1-5-В стандарт наличия доминантной аллели гена Pi-40. 1-сорт Хазар; 2-14 -образцы гибридной популяции: 2, 6, 7, 13, Pi-40 «+» образцы; 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 14 - Pi-40 «-» образцы.
На рисунке стрелками обозначены целевые фрагменты, специфичные для доминантной аллели искомого гена устойчивости. Видно, что у образцов 2, 6, 7, 13, как и у положительного контроля, присутствует данный фрагмент. Это свидетельствует о наличии у них доминантной аллели гена Pi-40.
В дальнейшем ДНК - маркерный контроль наличия доминантной аллели гена Pi-40 проводился в каждом последующем гибридном поколении, полученном при возвратном скрещивании. В настоящее
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
8
время получены BC2Fi гибридные растения, несущие данный ген устойчивости в комбинации Хазар/IR 83260-1-1-1-5-В. Кроме того, в результате самоопыления гибридных растений были получены самоопыленные гибридные поколения F3 и BCiF3 комбинациях Хазар/IR 83260-1-1-1-5-В, Новатор/IR 83260-2-10-5-2-1-В. Для идентификации гибридных растений, несущих доминантную аллель гена в гомозиготном состоянии использовали фланкирующие микросателлитные ДНК маркеры, являющиеся кодоминантными. На рисунках 3 и 4 представлены результаты электрофоретического анализа продуктов ПЦР по данным ДНК-маркерам у шести гибридных образцов поколения F3.
1 2 3 4 5 6 7 К+ МВ
Рисунок 3 Результаты анализа гибридных растений с ДНК-маркером
RM3330.
МВ-маркер молекулярной массы ДНК; К + линия Ш.83260-1-1-1-5-В стандарт наличия доминантной аллели гена Pi-40; 7-сорт Хазар; 1-6 образцы гибридной популяции.
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
9
1 2 3 4 5 6 7 К+ МВ
Рисунок 4 Результаты анализа гибридных растений с ДНК-маркером
RM527.
МВ-маркер молекулярной массы ДНК; К + линия Ш.83260-1-1-1-5-В стандарт наличия доминантной аллели гена Pi-40; 7-сорт Хазар; 1-6 образцы гибридной популяции.
На рисунках 3 и 4 видно, что у образцов 1, 3, 4, 5 и 6 присутствует только фрагмент, аналогичный по размеру ПЦР - продукту линии IR83260-1-1-1-5-В, что говорит о наличии у них доминантной аллели в гомозиготном состоянии. У образца номер 2, наряду с ПЦР - фрагментом, специфичным для доминантной аллели гена Pi-40, идентифицируется фрагмент, аналогичный фрагменту у сорта Хазар, и соответствующий рецессивной аллели. Это говорит о гетерозиготности локуса данного гена. Использование кодоминантных маркеров позволит отбирать растения, гомозиготные по доминантной аллели для дальнейшей их оценки по комплексу признаков в условиях селекционного питомника.
В дальнейшем нами планируется выполнить пирамидирование генов Pi-b, Pi-z, Pi-ta и Pi-40 для получения форм риса с высокой степенью устойчивости к пирикуляриозу. На данный момент с этой целью выполнено скрещивание линии на основе сорта Янтарь, несущей доминантный аллель гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-b в
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
10
гомозиготном состоянии и гибридного растения BC1F3 из комбинации Хазар/IR 83260-1-1-1-5-В с идентифицированным геном Pi-40. ДНК -маркерный анализ позволит выявить образцы, несущие оба указанных гена.
Таким образом, в результате выполненной работы, с применением ДНК-маркерного отбора, получены селекционные формы риса на генетической основе отечественных сортов и несущие ген широкого спектра устойчивости к пирикуляриозу. Наряду с этим начата селекционная программа по пирамидированию данного гена устойчивости с генами Pi-b, Pi-z и Pi-ta. Комбинирование нескольких генов с разным типом устойчивости позволит создать сорта, обладающие длительной устойчивостью к данному заболеванию риса.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и региональных инвесторов: проект № 11-04-96596-р_юг_ц.
ЛИТЕРАТУРА
1 Система рисоводства Краснодарского края: Рекомендации / Под общ. ред. Е.М.Харитонова.- Краснодар: ВНИИ риса, 2005.- 340 с.
2 Зеленский Г.Л. Селекция сортов риса, устойчивых к пирикуляриозу, рисовой листовой нематоде и бактериальному ожогу в условиях Российской Федерации: Автореф. дис....д-ра с.-х. наук.- Краснодар.- 1993.-48 с.
3 Leach J.E., Davidson R., Liu B., Manosalva P., Mauleon R., Carrillo G., Bruce, M., Stephens J., Diaz M. G., Nelson R., Vera Cruz C., Leung H. Understanding broad-spectrum durable resistance in rice // Rice Genet. 2007. V. 191-207.
4 Deng Y., Zhu X., Shen Y., He Z. Genetic characterization and fine mapping of the blast resistance locus Pigm(t) tightly linked to Pi2 and Pi9 in a broad-spectrum resistant Chinese variety // Theor. Appl. Genet. 2006. №113. P. 705-713.
5. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур // Сельскохозяйственная биология.-2003.- №3.- С.26-41.
6 Jena K.K., Moon H.P., Mackill D.J. Marker assisted selection- a new paradigm in plant breeding // Korean J. Breed.- 2003.- V.35.- P. 133-140
7 Suh J. P., Roh J. H., Cho Y. C., Han S. S., Kim Y. G., and Jena K. K. The Pi40 Gene for Durable Resistance to Rice Blast and Molecular Analysis of Pi40-Advanced Backcross Breeding Lines // Phytopathology. 2009. №3. V. 99
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
Научный журнал КубГАУ, №86(02), 2013 года
11
8 Супрун И. И. Оценка линий риса с генами Pi-b, Pi-z и Pi-40 на устойчивость к
Краснодарской популяции возбудителя пирикуляриоза (Pirycularia oryza) / Супрун И.И., Харченко Е. С.; Серая Л. И.; Ковалев В. С. // Электронный политематический научный журнал КубГАУ.- № 76(02).-2012. - режим доступа онлайн:
http://ej.kubagro.ru/2012/02/pdf/57.pdf, шифр информрегистра: 0421200012\0105.
9 J. U. Jeung, B. R. Kim, Y. C. Cho et al. A novel gene, Pi-40(t), linked to the DNA markers derived from NBS-LRR motifs confers broad spectrum of blast resistance in rice // Theoretical and Applied Genetics 2007. V. 115. P. 1163-1177
10 Супрун И.И., Ильницкая Е.Т., Мухина Ж.М. Создание внутригенного ДНК-маркера гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-b и его использование в практической селекции // Сельскохозяйственная биология. 2007. - № 5.- С. 63-66.
11 Лось Г.Д., Третьяков А.Р. Создание исходного материала для селекции риса // Рисоводство.- 2003.- №3.- С.12-13.
12 Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов // Молекулярная клиническая диагностика.- М.: Мир, 1999.- С. 395427.
http://ej.kubagro.ru/2013/02/pdf/18.pdf
