CC BY
28СОЗДАНИЕ НОВЫХ СОРТОВ ХЛОПЧАТНИКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ
ПИРАМИДИРОВАНИЕ ГЕНОВ
Дарманов М.М., Макамов А.Х., Хусенов Н.Н., Норбеков Ж.К., Буриев З.Т., Абдурахмонов И.Ю.
Центр геномики и биоинформатики АНРУз
CREATION OF NEW COTTON VARIETIES THROUGH GENE PYRAMIDING TECHNOLOGY
Darmanov M., Makamov А., Khusenov N., Norbekov J., Buriev Z., Аbdurakhmonov I.
Center for Genomics and Bioinformatics of the Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan
Аннотация
Пирамидировании генов - это объединение нескольких генов в один генотип, который контролирует многие характеристики, например, характеристики качества волокна. Современная технология молекулярной генетики и геномики «пирамидирование генов», является одной из основных стратегий в создании новых, улучшенных сортов.
В статье представлены результаты статистического анализа качественных показателей волокна хлопчатника сорта «Заковат». Новый сорт хлопчатника «Заковат» получен с помощью технологии пирамиди-рования генов с использованием ДНК-маркеров BNL1604, BNL3545 и NAU 2277, которые связаны с длиной волокна, прочностью волокна и удлинением волокна. Результаты экспериментов показали, что показатели качества волокна «Заковата» значительно улучшились по сравнению с контрольными генотипами.
Abstract
Gene pyramiding is the pyramiding of several genes into one genotype that controls many characteristics, such as fiber quality characteristics. Modern technology of molecular genetics and genomics "gene pyramid" is one of the main strategies in the creation of new, improved varieties.
This paper describes the results of statistical analysis of fiber quality traits of cotton cultivar "Zakovat". New cotton cultivar "Zakovat" derived through gene pyramiding technology using BNL1604, BNL3545 and NAU 2277 DNA markers that associated with microneire, fiber length, fiber strength and fiber elongation. The results of experiments showed that the fiber quality traits of "Zakovat" were significantly improved than control genotypes.
Ключевая слова: хлопчатник, ген, ДНК маркеры, локус, аллель, пирамидирования генов, параметры качества волокна.
Keywords: TOtton, DNA markers, locus, allele, gene pyramiding, fiber quality traits.
Введение. Доказана возможность применения молекулярных маркеров в пирамидировании генов, и до сих пор достигнуты очевидные успехи в селекции сельскохозяйственных культур. Кроме того, для маркер ассоциированное селекции можно использовать различные QTL или молекулярные маркеры, тесно связанные с урожайностью, качеством или устойчивостью. ДНК маркеры, связанные с интересующими областями генома, позволяют селекционера отбора индивидов на основе генотипа, а не фенотипа. Это очень полезно, если интересующий признак сложен и требует много времени для оценки, как это происходит со всеми количественными признаками.
Создание нового сорта с использованием традиционных методов селекции требует много тяжелой работы и длительное время [1,2]. В частности,
создание больших популяций, увеличение гибридов до поколения F9, F10, сложность отбора, влияние внешней среды на появление признака, в большинстве случаев необходимость дождаться завершающей стадии онтогенеза растений для отбора по признака и сложность объединения генов в один генотип [3,4].
Оценка генетических ресурсов с использованием новых молекулярно-генетических технологий значительно сокращает время на создание генотипов с желаемым признаком, что позволяет использовать их в селекционной работе [5]. Одним из важных направлений MAC-технологии является технология пирамидирования генов [6]. С помощью этой технологии предусмотрена стратегия одновременного объединения нескольких ценных генов в геноме любого сорта и создания новых, улучшенных сортов [7,8].
Пирамидирование генов интрогрессии несколько полезных генов в различных ресурсах ген-моплазмы в один геном с использованием обычного метода скрещивания, беккросс скрещивания и сложный гибридный метод, а затем индивидуальный отбор растения с таргетним генами с использованием молекулярных маркеров среди сегрегированных популяций [9]. Также необходимо подбирать растения с отличными признаками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Генетический материал. Исходным материалом для скрещивания в качестве доноров были выбраны две разновидности. Это линия С-419, которая имеет в геноме маркерный локус, отвечающий за длину и микронейр волокна, и второй донор -Saenr Репа85, с идентифицированным QTL-локусом, определяющим элонгацию волокна. В качестве генотипа-реципиента был выбран коммерческий сорт Андижан-35 [13]. На первом этапе исследований были получены простые гибриды в двух комбинациях скрещивания: (Андижан-35 х Saenr Репа85) и (Оккурган-2 х С-419). На следующем этапе эти простые гибриды были скрещены друг с другом для получения первого поколения сложного гибрида [(Андижан-35 х Saenr Репа85) х (Оккурган-2 х С-419)]. И, наконец, с целью закрепления остальных признаков сорта Андижан-35 и элиминации ненужных, кроме качества волокна, признаков доноров было проведено беккросс скрещивание полученных сложных гибридов с растением - реципиентом Андижан-35. Таким образом, были получены генотипы BC4F2.
Полевой эксперимент. Семена нового сорта Заковат и их 4 родителей были посеяны в поле в трех повторностях рандомизированного дизайна в течение апрель 2020 г. Каждая повторность была посажена в один ряд, состоящий из 15 растений, расположенных на расстоянии 25 см внутри и 90 см между рядами. От посева до сбора урожая соблюдались все рекомендованные агрономические приемы и методы защиты растений.
ДНК-маркеры. До проведения последующих беккроссного скрещивания гибриды первого бек-кросс (ВС1 ) поколения были анализированы на предмет таргетного признака через ПЦР -анализ с помощью ДНК маркеров ^Ш277, ВМЬ1604, ассоциированного с микронейр, длиной и прочностью волокна, а также ВМЬ3650, ассоциированного с элонгацией волокна [10,11].
Выделение геномной ДНК. Выделение геномной ДНК из листьев каждого растения проводили СТАВ методом с незначительными модификациями [12].
ПЦР и генотипирование. Для генотипирова-ния использовали панель микросателлитных маркеров, созданных в рамках ранее проведенных исследований, чья ассоциация с определенными признаками качества волокна была уже установлена [10, 11]. Микросаттелитное генотипирование было проведено в соответствии с методом Reddy et al., 2001 [13].
Анализ качественных показателей волокна.
Оценка качества волокна материалов исследования проводилась на оборудовании HVI (High Volume Instrumentation) в центре сертификации качества волокна "СИФАТ".
Статистический анализ. Дисперсионный и статистический анализ (корреляция Пирсона, ANOVA, Two-Sample T-Test) были выполнены с использованием SOFA версии 1.4.5 и NCSS 2003 с целью изучения наследственности и развития количественных признаков.
РЕЗУЛЬТАТИ
В результате исследований были получены гибриды поколения BC4F2 в гомозиготном состоянии по перенесенных QTL локусам. Гибриды поколения BC4F2 были проведени самоопыление до поколением BC4F6. В качестве нового сорта была выбрана гибридная линия BC4F6, улучшившая все количественные характеристики.
Количественные характеристики нового сорта хлопчатника "Заковат", были проанализированы в лаборатории, такие как длина волокна, масса коробочки, масса 1000 семян и выход волокна. Лабораторный анализ штапельного длины волокна и количественных характеристик в собранных образцах хлопчатника показал следующее: средняя штапельного длина волокна у реципиента Андижан-35 и контрольного сорта Наманган-77 составляет 34,0 и 32,0 мм, а у "Заковат" генотипы имеют 38 мм соответственно. Существенные различия в штапельного длина волокна между "Заковат" и его реципиент-ным генотипом Андижан-35 рассматривались из-за положительного эффекта перенесенных QTL.
Подробные результаты лабораторных анализов собранных образцов семян хлопчатника представлены в таблице 1.
Таблица 1
Признакы Заковат Андижан-35 Наманган-77
Штапельного длина волокна мм. 38.0 34.0 32.0
Масса коробочки г. 7.5 6.8 5.5
Масса 1000 семян г. 125 115 108
Выход волокна (%) 35.0 36.0 36.0
Результаты показывают, нових сорт хлопчатника Заковат, гомозиготные по обоим QTL локусам, имеют длину волокна (Len), равную 1,20 дюймам, прочность (STR) - 36,0 гс/текс, элонгацию (Elg) -7,0% и микронейр (MIC) 4,3. У реципиента-Ан-дижан-35 эти показатели значительно ниже: длина волокна - 1,13 дюйма, прочность - 32,0 гс/текс, элонгация -6,4% микронейр (MIC) 4,8.
Статистический анализ был проведен для определения влияния QTL на улучшение основных параметров качества волокна у сорта Заковат, как
произошли его изменения по сравнению с реципиентом и различий по сравнению с контрольным образцом (стандартный сорт - Наманган-77), а также для определения корреляции между черты интереса. Результаты дисперсионного анализа (ANOVA - Анализ вариаций) показали, что основные параметры качества волокна (микронейрь волокна, прочность, длина, однородность и удлинение) и агрономических признаком были улучшены по сравнению с реципиентом, а также наблюдались значительные различия по сравнению с контрольным генотипом (Рисунок 1,2).
9
i
Андижан-35 С-417 Наманган-77 Оккурган-2 SaenrPena-85 Заковат
Андижан-35 С-417 Наманган-77 Оккурган-2 SaenrPena-85 Заковат
2
3
Аддиясан-35 С-417 Наманган-77 Оккурган-2 SaenrPena-85 Заковат
Ф
Андижан-35 С-417 Наманган-77 Оккурган-2 SaeiifPetia-85 Заковат
Рисунок 1. Дисперсионный анализ (Е-тест, альфа = 0,05) основных показателей качества волокна
хлопчатника сорта «Заковат».
Рисунок 2. Дисперсионный анализ (Е-тест, альфа = 0,05) показателей качества волокна и агрономических признаком хлопчатника сорта «Заковат».
Кроме того, с использованием коэффициента корреляции Пирсона были определены генетические корреляции основными характеристиками качества волокна этого сорта. Согласно результатам анализа, отрицательной генетической корреляции между всеми признаками качества волокна у сорта
"Заковат" при р<0,05 не наблюдалось. Например, у сорта "Заковат" также наблюдалась положительная корреляция между с длиной волокна (Ьеп) и прочность волокна ^г), удлинением волокна (Е^), однородностью (ип£) и микронейр (рис. 3).
Рисунок 2. Взаимная генетическая корреляция показателей качества волокна у сорта "Заковат". А -между длиной волокна (Ьеп) и прочностю (р <0,001, г = 0,3875), Б - между длиной волокна (Ьеп) и однородности (ипА) (р = 0,02, г = 0,2653), С - между длиной волокна (Ьеп) и удлинением (ЕЩ (Р = 0,001, г =0,1798), Д- находится между длиной волокна (Ьеп) и его микронейр (р <0,001, г = -0,2166).
Таким образом, мобилизация новых QTL-регионов из донорных линий в геном реципиента (Андижан-35) при «пирамидировании генов» значительно улучшила параметры микронейр, длины, прочности и элонгации волокна полученных нових сорт Заковат, не затрагивая и не изменяя при этом другие параметры качества волокна. Более того, результаты статистического анализа подтверждают наличие достоверной ассоциации ДНК-маркеров NAU2277, BNL1604 и BNL3545 с тестированными признаками волокна.
Список литературы
1. Moreau, L., Charcosset, A. and Gallais, A. (2004): Experimental Evaluation of Several Cycles of Marker-Assisted Selection in Maize. - Euphytica 137: 111-118.
2. Robbins, M. and Staub, J. (2009): Comparative Analysis of Marker-Assisted and Phenotypic Selection for Yield Components in Cucumber. - Theoretical and Applied Genetics, 119: 621-634.
3. Gupta, P. K. and Varshney, R. K. (2000): The Development and Use of Microsatellite Markers for Genetic Analysis and Plant Breeding with Emphasis on Bread Wheat. - Euphytica 113: 163-185.
4. Ribaut, J. M. and Ragot, M. (2006): Marker-
Assisted Selection to Improve Drought Adaptation in Maize: The Backcross Approach, Perspectives, Limitations, And Alternatives. - Journal of Experimental Botany 58: 351-360.
5. Hospital, F. & Charcosset, A. 1997 Marker-assisted introgression of quantitative trait loci. Genetics 147, 1469-1485.
6. Barone, A., Ercolano, M. R., Langella, R., Monti, L. and Frusciante, L. (2005): Molecular Marker-Assisted Selection for Pyramiding Resistance Genes in Tomato. - Advances in Horticultural Science 19: 147152.
7. Guo Wang-Zhen, Zhang Tian-Zhen, Zhu Xie-Fei, Pan Jia-Ju (2005): Modified Backcross Pyramiding Breeding with Molecular Marker-Assisted Selection and Its Application in Cotton. - Acta Agronomica Sinica. Vol.31, No.8, pp. 963-970.
8. Ferreira J.J., Campa A., Pe'rez-Vega E., Rodn'guez-Sua'rez C., Giraldez R. (2012) Introgression and pyramiding into common bean market class fabada of genes conferring resistance to anthracnose and potyvirus. - Theor Appl Genet 124:777-788. DOI 10.1007/s00122-011-1746-x.
9. Qin G, Li Y R, Chen C H. Application of gene pyramiding in selection of crop new varieties [J]. Guangxi Agricultural Science, 2006, 37 (4): 345-349.
10. Abdurakhmonov I.Y., Saha S., Jenkins J.N.,
Buriev Z.T., Shermatov S.E., Scheffler B.E., Pepper A.E., Yu J.Z., Kohel R.J., Abdukarimov A. Linkage disequilibrium based association mapping of fiber quality traits in G. hirsutum L. variety germplasm // Genetica. - Berlin, - 2009.
11. Abdurakhmonov, I.Y., R.J. Kohel, J.Z. Yu, A.E. Pepper, A.A. Abdullaev, F.N. Kushanov, I.B. Salakhutdinov, Z.T. Buriev, S. Saha, B.E. Scheffler, J.N. Jenkins, and A. Abdukarimov. 2008. Molecular diversity and association mapping of fiber quality traits in exotic G. hirsutum L. germplasm. Genomics 98: 478-487.
12. Paterson A H, Brubaker C L, Wendel J F. 1993. A rapid method for extraction of cotton (Gossy-pium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter, 11, 122127.
13. Reddy O.U.K., Pepper A.E., Abdurakhmonov I.Y., Saha S., Jenkins J.N., Brooks T.D., Bolek Y. and El-Zik K.M. The identification of dinucleotide and trinucleotide microsatellite repeat loci from cotton G.hir-sutum L, J. Cotton Sci. (Memphis), 2001. - No 5. - pp. 103-113.
