CC BY
6
23B
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
СОЗДАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, СТАБИЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СЕНСОРЫ
В.С. Усатова1, М.А. Берестовой1,
Н.М. Мишина2, A.B. Иваненко3, Д. Джэппи1,
А.В. Розов1, В.В. Белоусов1, 2
1 Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА, Москва, Россия
2 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова РАН, Москва, Россия
3 Центр высокоточного редактирования
и генетических технологий для биомедицины, РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры.
В данной работе был разработан подход для исследования внутриклеточных окислительно-восстановительных процессов в течение нейральной дифференциров-ки, а также на модели ишемической патологии нервной системы. Для этого с помощью CRISPR/Cas9 системы было создано несколько линий ИПСК человека, стабильно экспрессирующих генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры HyPer7 [2], SoNar [3] и SypHer3s [4], детектирующие ключевые показатели окислительно-восстановительных процессов — H2O2, соотношение NAD+/NADH и pH соответственно.
В данном исследовании была осуществлена полная дифференцировка линии ИПСК-HyPe^ в нейральном направлении до получения функционально зрелых нейронов. В процессе дифференцировки проводились прижизненные наблюдения за изменением внутриклеточных окислительно-восстановительных параметров с помощью флуоресцентной микроскопии. Было обнаружено, что на стадии получения нейральных предшественников происходит значительное повышение уровня продукции Н2О2 в цитоплазме большинства клеток по сравнению с клетками на предшествующих и последующих стадиях дифференцировки.
Далее была исследована возможность применения линии ИПСК-HyPe^ в экспериментах по моделированию ишемической патологии нервной системы, на примере нейроглиальных органоидов человека. Моделью ишемии-реперфузии являлась кислородно-глюкозная депривация, с последующей реоксигенацией и восстановлением контрольного уровня глюкозы в среде. Реализацию требуемых условий осуществляли на экспериментальной установке [5], которая позволяет точно и быстро контролировать изменения уровня кислорода в среде в процессе флуоресцентной микроскопии. Было обнаружено, что падение уровня кислорода в среде сопровождается изменением уровня Н2О2 в цитоплазме клеток в составе органоидов.
Литература:
1. Kostyuk A.I., Demidovich A.D., Kotova D.A. et al. International Journal of Molecular Sciences. 2019. V. 20. 4200.
2. Pak V.V., Ezerina D., Lyublinskaya O.G. et al. Cell metabolism. 2020. V. 31, № 3. P.642-653.
3. Zhao Y., Hu Q., Cheng F. et al. Cell metabolism. 2015. V. 21, № 5. P. 777-789.
4. Ermakova Y.G., Pak V.V., Bogdanova Y.A. et al. Chemical Communications. 2018. V. 54, № 23. P. 2898-290.
5. Kelmanson I.V., Shokhina A.G., Kotova D.A. et al. Redox Biology. 2021. V.48. 102178
ПЕРЕКЛЮЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ
АДЕНИЛАТЦИКЛАЗ И ФОСФОЛИПАЗ
В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК
В.А. Усачёв1, М.В. Воронцова2, К.Ю. Кулебякин1, 2,
П.А. Тюрин-Кузьмин1, И.В. Зубарев1
1 Факультет фундаментальной медицины, ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт Регенеративной Медицины, Медицинский научно-образовательный центр, ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: паратиреоидный гормон, аденилатцикла-
за, фосфолипаза, МСК, дифференцировка.
Мутации, происходящие в рецепторе или Ga-субъединице G-белка, нарушает передачу внутриклеточного сигнала и вызывают различные физиологические нарушения. Так, например, мутация в Gsa, связанного с PTH-рецептором, вызывает псевдогипопа-ратиреоз с наследственной остеодистрофией Олбрайта. Заболевание вызвано нарушает процессы дифференцировки клеток, обрывая передачу сигнала паратиреоидно-го гормона [1]. При подобных нарушениях, мишенью для фармокологических препаратов может служить следующее звено GPCR-сигнального пути — аденилатциклазы и фосфолипазы Cß.
Целью данной работы являлось выявление изменения профиля экспрессии различных изоформ аденилат-циклаз и фосфолипаз Cß в процессе дифференцировки МСК из разных источников. Методом real-time PCR был определен уровень экспрессии аденилатциклаз и фос-фолипаз Cß на 5, 10 и 15 сутки адипогенной и остеоген-ной дифференцировок МСК, полученных у здоровых доноров из жировой ткани и надкостницы.
В результате было показано, что в процессе дифференцировки МСК в адипогенном и остеогенном направлениях происходит изменение экспрессии некоторых изоформ аденилатциклаз и фосфолипаз Cß. Так адени-латциклаза 1 растет при остеогенной дифференцировке в МСК из жировой ткани, но падает в МСК из надкостницы и растет при адипогенной дифференцировке в обеих популяциях МСК. Аденилатциклаза 3 в МСК из надкостницы возрастает при остеогенной дифференцировке и МСК из жировой ткани при адипогенной дифференцировке. Экспрессия аденилатциклазы 6 падает при остеогенной дифференцировке в МСК из жировой ткани, но растет в МСК из надкостницы и растет при адипогенной диффе-ренцировке в обеих популяциях МСК. Аденилатциклаза 7 падает во всех источниках и дифференцировках по сравнению с контролем. Аденилатциклаза 8 растет при остеогенной дифференцировке МСК из жировой ткани и снижается в МСК из надкостницы.
Фосфолипазы Cß 1 и 3 ведут себя схожим образом. В МСК надкостницы они снижают свою экспрессию при адипогенной дифференцировке и незначительно возрастает при остеогенной. В МСК жировой ткани наблюдается различия во времени ответа: при адипогенной дифференцировке максимальный уровень экспрессии наблюдается на 5 сутки дифференцировки и постепенно снижается. В то время как их экспрессия при остеогенной
Гены & Клетки XVII, №3, 2G22
