CC BY-ND
43
СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ РАЗРАБОТКИ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ И МЕТОДОВ СЕРОЛОГ ИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
B.C. Кокорев, O.A. Кржижановская ФГУН «екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций Роспотребнадзора»
Развитие методов серодиагностики вирусных инфекций связано с исследованиями. направленными на совершенствование классических методов серологического анализа и разрабоку новых.
Классические методы лабораторной диагностики вирусных инфекций со всеми их модификациями останутся, по нашему мнению, в арсенале научно-исследовательских и практических вирусологических лабораторий еще многие годы, поскольку какими бы преимуществами не обладали методы серологического и вирусологического анализа последних поколений, они не смогли, к сожалению, до настоящего времени найти должного применения (во всяком случае в условиях лабораторной службы нашей страны) из-за своих недостатков.
К примеру, в 70-80-е годы прошлого века интенсивно разрабатывались и совершенствовались такие методы диагностики вирусных инфекций, как иммунофлюоресиентный (ИФМ), иммунофермеитиый (ИФА) и радиоиммунологический (РИА). Их высокая чувствительность и специфичность, относительная простота и экспрессивность, возможность проводить (ИФА) массовые серологические обследования при относительно небольших (при автоматизации метода) трудозатратах, - общеизвестны. Однако широкое их применение все еще сдерживается вследствие возможных несиецифических реакций, трудности приготовления высококонцентрированных и очищенных вирусных препаратов (ИФМ), необходимости соответствующего аппаратного оснащения для внедрения метода, стандартизации всех технических этапов анализа из-за возможных ложноположительных результатов и снижения чувствительности
реакции (ИФА), отсутствия коммерческих диагностических наборов и трудностей, связанных с созданием необходимой материально-технической базы, с анализом выходных данных (РИА), Следует заметить, что только полностью автоматизированные системы, играющие главную роль в крупных диагностических центрах, дадут возможность с наибольшей эффективностью использовать технические возможности современных методов серодиагностики при массовых обследованиях людей и животных.
В силу отмеченных выше недостатков и ограничений указанные тесты либо исчерпали возможности первоначальных вариантов (ИФА, ИФМ) и используются в усовершенствованных модификациях, либо практически полностью вытеснены (РИА) другими, лишенными многих недостатков, но еще более чувствительными и экспрессивными. Так, например, чувствительность твердофазного ИФА часто оказывается недостаточной, вследствие чего вирусспецифические антигены выявляются лишь в 50-55 % зараженных клещей. Метод требует относительно много времени для проведения анализа (в лучшем случае 2,5-3 часа). Лантанидный иммунофлюоресцент-ный анализ (ЛИФА) имеет определенные преимущества: более высокую чувствительность (в 10-100 раз выше ИФА), возможность сокращения общего времени анализа (используется одностадийный вариант), возможность анализа больших серий биоматериала с низким содержанием специфического антигена при эпидобследованиях, в том числе в переносчиках, крови грызунов,
В 90-е годы XX столетия активно разрабатывались и использовались следующие методы: ИФА - для диагностики венесуэльского энцефаломиелита лошадей, РС-инфекций, экспресс-индикации вирусов, чумы плотоядных, лихорадки Эбола; латекс-агглютинации - для диагностики ВИЧ, кори; лантанидного иммунофлюоресцентиого и иммуноферменгного анализов — для индикации вируса КЭ и др.
Современные тенденции совершенствования диагностических методов в вирусологии и разработки диагностических препаратов основаны на новых принципах выявления вирусспецифических белков, соответствующих им антител и нуклеиновых кислот. Наиболее перспективными представляются следующие исследования: повышение чувствительности ИФА при использовании флюоресцентных и хемилюминисцентных субстратов, ави-дин-биотиновых комплексов, лантанидных иммунофлюоресиентных меток (ЛИФА); совершенствование метода точечной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) с использованием нерадиоактивной метки; разработка в целях широкого практического применения метода ПЦР, иммуносенсорных методов (ИМС) определения антигенов патогенных объектов; повышение экспрессивности диагностических методик - совершенствование классических агглютинационных методов диагностики с нагрузкой антителами частиц латекса, целлюлозы, эритроцитов, бактерий; исключение некоторых этапов твердофазного иммунохимического анализа и сокращение времени инкубации; использование «липосомальных» модификаций диагностических тестов.
июнь № 6 /171/
ЗНиСО
15
Даже представленные в таком кратком перечне направления исследований дают возможность отчетливо видеть перспективы иммунобиотехно-логии XXI пека - гораздо более точной и эффективной науки, чем в недавнем прошлом, благодаря широкому использованию новых биотехнологических методов и приемов, а также новых принципов получения иммунобиологических препаратов. По-видимому, на решение упомянутых задач и будет направлена деятельность НИИ и предприятий Российской Федерации, профилированных на разработку и внедрение в практику вирусных и бактериальных препаратов.
Иммуносенсорным методом можно определять до 0,! мг/мл антигена. Метод точечной («енот») гибридизации вирусных нуклеиновых кислот (НК) позволяет выделять вирусные НК в пикограммовьгх количествах, повысить чувствительность ПЦР вплоть до возможности детекции одной молекулы НК и выявлять таким образом вирус в организме задолго до сероконверсии. Усовершенствованные классические агглютинационные методы, проигрывая в чувствительности, позволяют сократить время диагностики до нескольких минут, а использование ЛИФА сокращает общее время анализа до 20-30 минут.
Однако указанные методы не нашли широкого применения в практике из-за недостаточной чистоты используемых химреактивов и растворителей, отсутствия специальной автоматической аппаратуры (модифицированный ИФА, ИСМ), отечественных коммерческих комплексонов, усиливающих растворов и спектрофлюориметров с задержкой во времени (ЛИФА).
Следует отметить, что возможность повышения чувствительности диагностических тест-систем, основанных на выявлении вирусспецифичес-ких белков или противовирусных антител, определяется не только особенностями диагностической методики или полнотой солюбилизации детектируемых белков, которые при анализе формируют иммунный комплекс, но и, что не менее важно, авидитетом антигенных детерминант и активных центров антител диагностических препаратов, обусловливающим интенсивность их взаимной нейтрализации и в итоге эффективность любого метода серологического исследования - от первого до последнего поколения. Важность данного обстоятельства достойно оценена авторами работ, направленных на совершенствование лабораторной диагностики вирусных инфекций, о чем, прежде всего, свидетельствуют отечественные публикации 80-90-х годов XX и начала XXI века.
Нами был разработан и с успехом применен метод ИФА с использованием тест-системы на основе антител к авидному штамму 4072 вируса КЭ и микрокультуры клеток для вирусологического исследования отдельных экземпляров иксодовых клещей в целях определения вирусофорности клещей в документированных и предполагаемых очагах КЭ, титра вируса в отдельных экземплярах клещей, выделения штаммов вируса КЭ из отдельных экземпляров клещей и дальнейшего изучения их биологических свойств, экспресс-индикации возбудителя КЭ в клещах, снятых с людей
после присасывания. Вирусологическое исследование отдельных экземпляров клещей позволяло получить прямые сведения не только о проценте инфицированных клешей на обследуемых территориях, но и дать количественную оценку содержания вируса, исключить возможность генотипического и фенотипического смешивания при выделении вирусов, что не исключено при выделении их из пула клещей, а определение инфицированности клещей при их присасывании дает возможность для проведения своевременной и целенаправленной пассивной иммунизации. Преимущества метода микроанализа перед общепринятыми в вирусологической практике состоят в возможности прямого определения вирусного антигена в минимальных объемах исследуемого материала, простоте выполнения, высокой чувствительности и специфичности. Если вирус присутствует в пробе в количествах, не выявляемых в ИФА, его размножают в микрокультуре до уровня, превышающего порог чувствительности в ИФА. В свою очередь, к основным достоинствам метода микрокультуры клеток по сравнению с другими методами выделения вируса с использованием биологических моделей следует отнести высокую экономичность и возможность проведения массового исследования проб с минимальными трудозатратами и высокой эффективностью.
Позднее на основе использования авидного штамма 4072 вируса КЭ была разработана не имевшая аналогов тест-система на основе монокло-нальных антител из гибридомы КЭН 46-8 для диагностики КЭ методом прямой и непрямой иммунофлюоресценции, пригодная для индикации вируса КЭ в инфицированных культурах клеток, членистоногих переносчиках и инфицированных тканях животных и человека.
Опубликованы данные о возможности экспресс-индикации вирусов ЯЭ и Денге в клинических и полевых материалах в РИГА и вирусов москитных лихорадок в реакции коагглютинации (РКОА). Авторами впервые была проведена индикация вируса ЯЭ в переносчиках без предварительного биологического накопления. Процесс исследования проб в РНГА занял 2-2,5 часа, положительные результаты были подтверждены выделением вируса. В спинномозговой жидкости больных ЯЭ и в сыворотке крови больных лихорадкой Денге вирусспецифический антиген обнаруживали в первые дни болезни. Тем самым был расширен круг вирусных инфекций, при которых диагностическая ценность РНГА, в том числе с авидными диагностическими препаратами, была показана ранее: КЭ, КГ Л, ГЛПС. При использовании РКОА для экспресс диагностики ряда арбо- и аренавирусных инфекций, индикации и идентификации их возбудителей частота выявления специфических антигенов в полевом и клиническом материале составляла 50-60 % по сравнению с методом биопроб. Было выявлено, что РКОА более чувствительна, чем РСК, не уступает РГА, но в 8-10 раз менее чувствительна, чем РНГА. Несмотря на меньшую чувствительность по сравнению с РНГА, по быстроте получения ответа (в течение нескольких минут) РКОА не имеет, наряду с другими усо-
июнь № 6 /171/
ЗНиСО
17
вершенствованными агглютинадионными методами, равных при индикации вирусов и отличается рядом других известных преимуществ.
Широкое применение нашли иммуноферментные (ИФА) тест-системы для определения антител к гликопротеину Е или к полному набору структурных и неструктурных белков вируса КЗ. Создана иммун«ферментнаи система, основанная на МкАт и способная обнаруживать неструктурный белок N8-1 в низких концентрациях.
Изучена возможность модифицированного метода ИФА (использование биотин-стрептавидинового комплекса) при индикации анти генов вируса КЭ в переносчиках. Обладая достоинствами стандартного имм унофермент-ного метода, модифицированный вариант с использованием биспилирован-ных специфических антител и стрептавидин-пероксидазы >шеет более высокую чувствительность и специфичность за счет второго сроя специфических антител, меченных биотином, и большого сродства стр^птавидина к водорастворимому витамину биотину.
Для специфической диагностики заболеваний, вызываемых арбовиру-сами, применяется еще один вариант ИФА - метод «захвата» ДйМ антител. Простота и возможность постановки диагноза по результату исследования одной пробы сыворотки крови позволили рекомендовать этот вариант ИФА для внедрения в практические лаборатории в целях ускоренной специфической диагностики заболеваний, вызываемых вирусами Тягиня и ^1нко.
Дот-блот анализ (ДБА) как альтернативный вариант ИФА был предложен для диагностики паразитарных, бактериальных и вируснь** инфекций. Отечественными исследователями он был применен в различных модификациях для серологической диагностики ГЛПС, калифорнийского энцефалита и других вирусных инфекций. Этот метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет выявить антигенный различия у близких вирусов одной серогруппы, выявить в сыворотках специфические антитела классов ^М и Как альтернативный микровар^ант ИФА с использованием мембранных фильтров и микротитрационны * панелей с плоским дном для ДБА более прост в выполнении, не требует специальной техники для учета результатов и может быть использован для серодиагностики вирусных инфекций, массового серовирусологического скрининга не только в лабораторных, но и в полевых условиях.
В последние годы к различным иммунодиагностическим системам прибавились иммуносенсорные методы определения антигенов различных микроорганизмов и вирусов. Иммуносенсорный метод основан на регистрации с помощью соответствующего детектора тех физических и химических эффектов (температурного, лучевого, электрического и др.), которые возникают в результате взаимодействия антигена с антителом. В частности, содержание искомого антигена можно выражать в электрических сигнал^ датчиком которых служит электрод, покрытый полупроницаемой мембраной с присое-
дииенным к нему антителом. Контакт его с материалом, содержащим специфический антиген, и последующее образование комплекса антиген-антитело изменяет характеристики электрода, вызывает колебания тока в цепи. Таким образом можно определять 0,1 мг/мл антигена.
Весьма перспективным является создание иммуноферментных сенсоров с вольтометрометрической регистрацией сигнала, которые отличаются высокой чувствительностью, доступной стоимостью, простотой и экспрессивностью определения. В то же время все более широкое практическое применение для целей медицинской практики находят планарные электроды, изготовленные с помощью печатных (screen-printed) технологий.
В заключение целесообразно было бы отметить, что при оценке сравнительной эффективности различных методов микробиогенетической диагностики при актуальных инфекциях распределение предпочтительности современных диагностических методов следующее: иммунологические (серологические) методы выявления антител или антигенов - 29 и 31 % соответственно, молекулярно-генетические 16%, микроскопические 11 %, культуральные - 13 %. При диагностике вирусных инфекций распределение в пользу серологических тестов, можно полагать, составляет еще больший процент при тех же 16 %, приходящихся на молекулярно-генетические методы, что в очередной раз свидетельствует об актуальности дальнейшей разработки и совершенствования препаратов и методов серовирусологического анализа.
