CC BY
64
УДК:616.155-006-089.843
СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ В ОНКОГЕМАТОЛОГИИ И ИХ РЕШЕНИЕ
А.А. Айзенштадт 12, В.В. Багаева2, А.С. Хрупина 12, Е.Ю. Кананыхина2, Д.А. Иволгин 12,
А.Б. Смолянинов 1 2
1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия 2 Покровский банк стволовых клеток, Россия
ACTUAL PROBLEMS OF UMBILICAL CORD BLOOD HAEMATOPOIETIC STEM CELLS EXPANSION FOR TRANSPLANTATION AND THEIR SOLUTION
A.S. Aizenshtadt12, V.V. Bagaeva2, A.S. Khrupina 12, E.U. Kananykhina2, D.A. Ivolgin 12,
A.B. Smolyaninov 1 2
1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia
2 Pokrovskii Stem Cells Bank, Russia
© Коллектив авторов, 2012
Использование гематопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для лечения взрослых пациентов до сих пор остается ограниченным. Одной из главных причин этого является малый объем образца пуповинной крови по сравнению с объемом костного мозга, что может приводить к замедлению приживления или отторжению трансплантированного образца. Считается, что определяющим фактором успеха трансплантации является количество гемопоэтических стволовых клеток и общее количество ядросодержащих клеток в образце пуповинной крови. Поэтому среди методов улучшения исходов трансплантации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови актуальной является проблема чистого выделения и экспансии CD34+ гемопоэтических стволовых клеток in vitro.
Сегодня отсутствует общепринятый стандартизированный протокол экспансии гемопоэти-ческих стволовых клеток пуповинной крови in vitro с оптимальными комбинациями и концентрациями цитокинов. Целью данной работы является подбор оптимальных условий для выделения чистой фракции CD34+-клеток из пуповинной крови и культивирования популяции CD34+ клеток при сохранении их пролиферативной активности и уменьшении степени дифференцировки. При подобранных условиях культивирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови удалось добиться увеличения количества CD34+ клеток в 100-200 раз. Если общее количество ядросодержащих клеток в образце находится в пределах 1.000х106 клеток при среднем содержании CD34+ клеток 1-2 х106, то в результате применения метода культивирования из него можно получить около 7-25х107 CD34+-клеток. Что касается клинического использования культивированных образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, то благодаря данной методике и с учетом разработанных требований к образцу пуповинной крови возможна эффективная трансплантация таких образцов пациентам с онкогематологическими заболеваниями с массой тела более 60 кг.
Ключевые слова: гемопоэтические стволовые клетки, пуповинная кровь, культивирование популяции CD34+-клеток.
The use of umbilical cord blood haemopoietic stem cells for the treatment of adult patients is still limited. One of the main reasons for this is a small volume of cord blood unit compared with the bone marrow, which can lead to slower engraftment or rejection of the transplanted unit. It is believed that the determining factor in the success of transplantation is the amount of haemopoietic stem cells and the total nucleated cells in a cord blood unit. Therefore, a problem of pure isolation and expansion of CD34+ cells in vitro is of current interest.
Today there is no generally accepted standardized protocol of cord blood stem cells in vitro expansion with combinations and concentrations of cytokines. The aim of this work is the selection of the optimal conditions for isolation of pure fractions of CD34+-cells from cord blood and expansion of CD34+ cells populations while maintaining their proliferative activity and decreasing the differentiation. The conditions under cultivation of cord blood derived stem cells also lead to 100-200 fold increasing
the number of CD34+ cells. If the total nucleated cells count in the sample is within 1.000x106 cells with an average CD34+ cells count is 1-2x106, the method of cultivation will result in about 7-25x107 CD34+ cells. As for the clinical use of expanded cord blood stem cells units, thanks to this method, a transplantation of such samples to patient with hematologic malignancies with a body weight of 60 kg can be an effective.
Key words: haemopoietic stem cells, umbilical cord blood, expansion of CD34+ cells population.
Введение
На данный момент наиболее распространенным способом лечения онкологических заболеваний крови в России является трансплантация гемопоэтических стволовых клеток костного мозга (ГСК КМ). Однако в составе ГСК КМ обнаруживаются высокоиммуноген-ные вещества и белки, способные вызывать реакцию «трансплантат против хозяина». В связи с достигнутыми в последнее время успехами в области клеточных технологий, созданием и развитием Общественных регистров доноров стволовых клеток пуповинной крови с полным HLA-типированием получило активное развитие новое направление в медицине - трансплантация ГСК пуповинной крови (ПК).
ГСК ПК получают из плаценты при рождении ребёнка. С 1989 г. трансплантацию ГСК ПК применяют для лечения многих злокачественных заболеваний крови, таких как лейкемия, лимфома, множественная миелома, талас-семия, а также некоторых доброкачественных заболеваний - аплазия костного мозга, врожденные дефекты кроветворения и иммунитета, диабет и ряд неврологических расстройств [1]. ГСК ПК, по сравнению с другими источниками, обладает рядом преимуществ: атравматич-ность получения материала, высокая репопу-лирующая способность клеток ПК [2], а также менее строгие требования к совместимости по системе HLA-трансплантата и реципиента (несовместимость от одного до трех антигенов) [3, 4]. В настоящее время хорошо отработаны методики сбора и длительного хранения ПК в замороженном состоянии, что увеличивает вероятность получения образцов с редким HLA-типом и сокращает время поиска HLA-совместимого трансплантата для аллогенной трансплантации с 4-6 месяцев как при поиске донора костного мозга до 4-6 дней [5]. ГСК ПК обычно идентифицируют по наличию на их поверхности гликофосфопротеина CD34+, а также на основании их функциональных свойств путем исследования клоногенности или коло-ниеобразования (КОЕ) in vitro.
С другой стороны, использование ГСК ПК для лечения взрослых пациентов до сих пор
остается ограниченным. Одной из главных причин этого является малый объем образца ПК по сравнению с объемом КМ, что может приводить к замедлению приживления или отторжению трансплантированного образца. Считается, что определяющим фактором успеха трансплантации является количество ГСК, то есть CD34+ клеток и общее количество ядросодержащих клеток в образце ПК: 1,5-1,7х105/кг массы тела пациента и 2,5х107/кг массы тела пациента соответственно [6]. Это обусловливает ограниченность применения ГСК ПК для лечения взрослых пациентов. Поэтому среди прочих методов улучшения исходов трансплантации ГСК ПК актуальной является проблема чистого выделения и экспансии CD34+ ГСК in vitro.
Несмотря на ряд успешных исследований в данной области, на данный момент отсутствует общепринятый стандартизированный протокол экспансии ГСК ПК in vitro с оптимальными комбинациями и концентрациями цитокинов [7, 8]. Известно, что пролифератив-ный потенциал и «стволовость» поддерживается некоторым набором цитокинов. Составы цитокиновых коктейлей, приведенных в литературе, различаются и набором цитокинов, и концентрацией каждого (табл.). Помимо цито-кинов исследователи описывают методы культивирования ГСК с использованием подложки из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [9], которые при сокультивировании выделяют растворимые факторы для поддержания пролиферации и замедления дифференцировки CD34+-клеток ПК.
В связи с вышеперечисленными фактами и возрастающей частотой опухолевых и других типов заболеваний, при лечении которых перспективным подходом считается применение ГСК ПК, очевидна необходимость создания унифицированного протокола культивирования ГСК ПК.
Таким образом, целью данной работы является подбор условий для выделения чистой фракции CD34+-клеток из ПК и культивирования популяции CD34+-клеток при сохранении их пролиферативной активности и уменьшении степени дифференцировки.
Концентрации цитокинов для культивирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови по данным разных авторов
Цитокины 1 2 3 4 5 НИЛ клеточных технологий СЗГМУ им. И.И. Мечникова, Покровский БСК
SCF, нг/мл 100 16 100 50 100 50
Flt3, нг/мл 100 7,47 100 - 100 25
TPO, нг/мл - 7,47 - - 50 25
IL6, нг/мл - - 20 10 - 25
IL3, нг/мл - 5,33 20 5 - 10
G-CSF, нг/мл - 3,33 - - - -
GM-CSF, нг/мл - 2,13 - - - -
MGDF 100 - - - - -
Экспансия, раз 100 32,7 20 5,43 30,8 80-200
Примечание: 1 - Shpall et al., 2002 [11]; 2 - Liu et al., 2006 [12]; 3 - Ahrens et al., 2011 [13]; 4 - Qunliang et al., 2006[14]; 5 - Madlambayan et al., 2006 [15].
Материалы и методы исследования
Получение пуповинной крови
В работе были использованы образцы ПК (34 образца), полученные методом сбора из пупочной вены при неосложненных родах у пациенток родильных домов г. Санкт-Петербурга. Условием сбора ПК являлось подписание роженицей информированного согласия на сбор ПК, а также отсутствие в анамнезе ВИЧ-инфекции, гепатита В и С, сифилиса, а также положительных результатов на маркеры данных заболеваний. Сбор ПК осуществлялся персоналом родовспомогающих учреждений, прошедшим обучение по сбору ПК по изложенной ниже методике.
Забор ПК осуществлялся сразу после рождения ребенка - пуповина клеммировалась в течение 30 сек после рождения ребенка, что увеличивает объем собираемой ПК [10], затем рассекалась между зажимами, и после обработки пуповины в месте предполагаемого прокола антисептиком производилась пункция пупочной вены. Кровь поступала в мешок самотеком. Сбор крови проводился до полного опустошения пупочной вены. По окончании сбора крови на трубку рядом с иглой накладывался зажим, игла извлекалась из вены, кровь перемешивалась с антикоагулянтом. Контейнер упаковывался в индивидуальный пластиковый пакет.
Выделение лейкоцитарной фракции
из пуповинной крови
В ходе работы нами были подобраны условия выделения наиболее чистой (свободной от эритроцитов и тромбоцитов) лейкоцитар-
ной фракции из образца свежеполученной ПК. Самыми распространенными методиками получения концентрата лейкоцитов из ПК являются выделение клеток на градиенте фикола, а также методом двойного центрифугирования с 6% раствором гидроксиэтилкрахмала (ГЭК) «Стаби-зол» (Berlin-Chemie, Италия). В нашей работе указанные методики были совмещены: сначала в образец ПК добавляли соответствующий объем раствора ГЭК в зависимости от объема крови (соотношение кровь: ГЭК = 5:1). Данную смесь инкубировали на орбитальном шейкере в течение 10 мин для лучшего связывания эритроцитов. Затем образец центрифугировали для осаждения эритроцитов (50 g 10 мин), после чего отделяли эритроцитарную массу с помощью плазмоэк-страктора. Получившуюся фракцию двукратно отмывали от ГЭК раствором Хенкса (HyClone, Новая Зеландия) на центрифуге (1000 об/мин 5 мин). Осадок ресуспендировали в 2-3-кратном объеме Хэнкса и наслаивали на фикол (Биолот, Россия), затем центрифугировали 30 минут при 400g. Далее аккуратно собирали белое кольцо лейкоцитов на границе раздела фаз фикол-плаз-ма, стараясь захватить только «белые» клетки. Проводили двукратную отмывку лейкоцитов от фикола раствором Хэнкса, избавляясь таким образом от большей части тромбоцитов.
Получение мезенхимальных стволовых
клеток костного мозга
Образцы КМ были получены от здоровых доноров (возраст 35-50 лет) методом пункции подвздошной кости таза при условии подписа-
ния донорами информированного согласия на проведение забора КМ с последующим культивированием мезенхимальных стволовых клеток (МСК) по следующей методике. После проведения премедикации в положении больного на спине (на боку) пальпировалась spina iliaca anterior superior, затем, отступив на 2-3 см кзади от передне-верхней ости подвздошной кости, отмечалась точка биопсии. После ограничения биопсийного поля проводилась его антисептическая обработка, выполнялась инфильтраци-онная и поднадкостничная анестезия 2% раствором новокаина (8-10 мл). Трепан проводился через мягкие ткани до надкостницы вращатель-но-поступательными движениями перпендикулярно плоскости крыла подвздошной кости до губчатого вещества. Затем, удалив мандрен, производилась активная эксфузия вещества КМ с помощью одноразового шприца (20 мл). После выполнения миелоэксфузии в необходимом объеме трепан удаляли и на место пункции накладывали стерильную повязку. Объем мие-лоэксфузии составлял 50-60 мл. Затем содержимое шприца перемещали в стерильный пакет для сбора крови с раствором антикоагулянта.
Аспират КМ разделяли на фракции методом центрифугирования (400 g, 30 мин) в градиенте фикола (Биолот, Россия). Полученное кольцо лейкоцитов на границе фаз промывали раствором фосфатного буфера (Gibco), растворяли в полной питательной среде (AdvanceStem, Gibco, Великобритания) c добавлением 20% сыворотки (Hyclone, Великобритания) и высеивали на флаконы (площадь 75 см2). Через 4 дня проводили смену среды и пассирование при достижении 80% конфлюентности. Культивировали МСК до 4 пассажа.
Иммуномагнитная сепарация
CD34+-^emoK
Для выделения чистой фракции CD34+-клеток из полученного лейкоконцентрата ПК использовали метод иммуномагнитной сепарации с использованием магнита MidiMACS Separator, колонок LS и антител к CD34+-клеткам согласно протоколу производителя (Miltenyi Biotec, Германия).
Экспансия CD34+-клеток
Для поддержания пролиферативной активности ГСК использовали МСК КМ, среду IMDM, заменитель сыворотки BIT 9500 (всё StemCellTechnologies, США) и цитокины: thrombopoietin (TPO), FMS-like tyrosine kinase
3 ligand (Flt-3L), фактор стволовых клеток (SCF), IL3, IL6 (всё Miltenyi Biotec, Германия).
Выделенные после иммуномагнитной очистки клетки разбавляли в полной ростовой среде с добавлением цитокинов до концентрации 1х104 кл/мл (оптимальная концентрация также была подобрана авторами работы в результате серии экспериментов) и высевали на флаконы или планшеты с подложкой из МСК КМ с кон-флюентностью 70-80%. Через 3 дня в культу-ральные сосуды добавляли трехкратный относительно изначального объем свежей ростовой среды. Культивирование проводили в течение 7-10 суток.
Оценка количества CD34+-клеток
до и после культивирования in vitro
Количественное определение CD34+-клеток после очищения ПК на иммуномагнитных колонках, непосредственно перед посевом и спустя неделю после начала культивирования производили на проточном цитометре FC500 (Beckman Coulter, США) с программным обеспечением CXP с длиной волны лазерного излучения 488 нм при окраске клеток набором Stem-Kit (Beckman Coulter, США) согласно инструкции производителя.
Постановка теста на колониеобразующие
единицы (КОЕ)
После завершения этапа культивирования в пробирку с полученной суспензией ГСК добавляли стерильный раствор Хенкса в таком количестве, чтобы объем суспензии составил 1,5 мл, и перемешивали. Затем шприцем набирали 5 мл фиколла и переносили в определенном соотношении в 15 мл пробирку и аккуратно наслаивали суспензию на поверхность фикол-ла, не допуская перемешивания. После этого пробирку центрифугировали при 400 G/мин в течение 30 мин. После центрифугирования в градиенте фиколла аккуратно, не допуская перемешивания, фракция ГСК отбиралась в пробирку с 5 мл раствора Хенкса. Затем суспензию ГСК осаждали центрифугированием (5 мин, 1000 об/мин), разводили в 1 мл среде IMDM и высеивали клетки в конечной концентрации 0,5 х104 - 2х104 кл/мл метилцеллюлозной среды MethoCult®, содержащую необходимые факторы гемопоэза (все StemСellTechnologies, США), на чашку Петри диаметром 3 см. Спустя 14 суток проводили количественную и качественную оценку колоний (BFU, GM-CFU, G-CFU, M-CFU, GEMM-CFU) с использованием
инвертированного светового микроскопа Axiovert 40C (Carl Zeiss, Германия).
Оценка экспрессии маркеров
дифференцировки
Для оценки экспрессии маркеров дифференцировки в полученных культурах ГСК CD34+, их метили FITC-конъюгированными антителами против CD3 антителами, конъю-гированными с фикоэритрином против CD4, CD19, CD8, CD16+56, HLA-DR в течение 20 мин в PBS при комнатной температуре. Измерения проводили на проточном цитометре FC500 (Beckman Coulter, США) с программным обеспечением CXP с длиной волны лазерного излучения 488 нм.
Результаты и обсуждение
В ходе работы было использовано выделение ГСК с помощью имммуномагнитной сепарации, что позволило получить чистую популяцию ГСК для последующего культивирования. Для экспериментов были использованы образцы с общим числом ядерных клеток 0,7-1,0х109. Количество CD34+ клеток после иммуномаг-нитной сепарации составляло 1,0-3,0х106. Чистота выделения составила 90 ±3,2% (рис. 1.)
В ходе исследования были объединены два различных методических подхода к культивированию ГСК ПК, что позволило снизить финансовые затраты и улучшить результаты культивирования. Для этого в качестве фидерного слоя для ГСК с целью снижения степени дифференцировки CD34+-клеток были использованы полученные в нашей лаборатории культуры МСК КМ. Также для улучшения пролифератив-
ной активности клеток в состав ростовой среды добавляли цитокины ^С^ ТРО, Flt3, ^3, ^6). Благодаря методике сокультивирования удалось значительно уменьшить рабочую концентрацию каждого из цитокинов по сравнению с данными других авторов (см. табл.). Состав коктейля из цитокинов определяли экспериментально, для сравнения брали следующие показатели: увеличение количества CD34+-клеток и чистоту популяции на конец срока культивирования.
В результате культивирования общее количество клеток составило 7-25 х107 и таким образом удалось добиться увеличения количества культивируемых клеток в 80-200 раз.
При проведении теста на КОЕ после культивирования ГСК ПК, было определено, что на 14 сутки в культуре встречаются только несколько типов колоний клеток-предшественников: CFU-M (49%), CFU-G (40%) и CFU-GM (11%). Колоний эритроидного ряда не удалось обнаружить, вероятно, из-за отсутствия стимуляции ЕРО (метилцеллюлозная среда не содержит это вещество).
Методом проточной цитофлуорометрии было показано, что более 50% культивированных ГСК ПК на конец срока экспансии несут на себе поверхностный маркер ГСК CD34+, что в целом соответствует данным литературы (рис. 2.).
При анализе на наличие маркеров дифферен-цировки в полученных культурах ГСК CD34+, было показано, что клетки не несут на себе CD3, CD4, CD19, CD8, CD16, CD56 (рис. 3.), т.е. являются недифференцированными.
Рис. 1. Популяция гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, полученная после выделения методом иммуномагнитной сепарации. Окраска фикоэритрином
Рис. 2. Гематопоэтические стволовые клетки пуповинной крови после 7 суток культивирования. Окраска фикоэритрином
Рис. 3. Экспрессия маркеров дифференцировки в полученных культурах гемопоэтических стволовых клеток:
FL1 - окраска FITC; FL2 - окраска фикоэритрином
Однако 11% клеток в полученных популяциях были положительны по HLA-DR (рис. 4Б). Причем при культивировании без МСК положительными по HLA-DR было 31,8% популяции (рис. 4А).
Стоит отметить, что критическим моментом эффективности культивирования ГСК ПК является начальный этап выделения чистой фракции CD34+-клеток из ПК. Снижение уровня очистки клеток уменьшает и пролифератив-ную активность клеток и увеличивает степень
их дифференцировки. Благодаря проведению повторного этапа иммуномагнитной сепарации после культивирования, чистоту CD34+-клеток можно увеличить до 80-90%. Также было показано, что после проведения повторного этапа иммуномагнитной сепарации после культивирования полученные клетки не несли на себе HLA-DR (рис. 4В). Таким образом, удалось получить чистую популяцию недифференцированных CD34+ ГСК.
СРША-
А
С0Н1А
Б
С0Н1А-1
В
Рис. 4. Экспрессия HLA-DR в полученных культурах: А - при культивировании без МСК; Б - при сокультивировании с мезенхимальными стволовыми клетками; В - после повторного этапа
иммуномагнитной сепарации. Окраска фикоэритрином
Таким образом, что касается клинического использования культивированных образцов ПК, то благодаря данной методике и с учетом разработанных требований к образцу ПК, возможна эффективная трансплантация таких образцов пациентам с массой тела 60 кг и более [16].
Выводы
1. При подобранных условиях культивирования ГСК ПК удалось добиться увеличения количества CD34+-клеток в 80-200 раз.
2. Учитывая среднее содержание CD34+ клеток 1,0-2,0 х 106 в одном образце ПК, в результате применения метода культивирования из него удалось можно получить около 7,0-25,0х107 клеток.
3. Клетки, полученные в результате культивирования, не несут на себе маркеры дифферен-цировки.
4. Клетки, полученные в результате культивирования, обладают высокой колониеобразую-щей активностью.
Литература
1. Gluckman, E. Hematopoietic reconstitution of a patient with Fanconi anemia by means of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling / E. Gluckman, H.E. Broxmeyer, A.D. Auerbach // N. Engl. J. Med. - 1989. -Vol. 321, № 17. - Р. 1174-1178.
2. Saulnier, N. From stem cell to solid organ. Bone marrow, peripheral blood or umbilical cord blood as favorable source? / N. Saulnier [et al.] // Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. - 2005. - Vol. 9, № 6. - P. 315-324.
3. Rubinstein, P. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors / P. Rubinstein [et al.] // N. Engl. J. Med. - 1998. - Vol. 339, № 22. - P. 1565-77.
4. Dalle, J.H. Results of an unrelated transplant search strategy using partially HLA-mismatched cord blood as an immediate alternative to HLA-matched bone marrow / J.H. Dalle [et al.] // Bone Marrow Transplant. - 2004. - Vol. 33, № 6. -P. 605-611.
5. Barker, J.N. How I treat: the selection and acquisition of unrelated cord blood grafts / J.N. Barker, C. Byam, A. Scaradavou // Blood. -2011. - Vol. 117, № 8. - P. 2332-2339.
6. Rocha, V. Improving outcomes of cord blood transplantation: HLA matching, cell dose and other
graft- and transplantation-related factors / V. Rocha, E. Gluckman // British Journal of Haematology. -2009. - Vol. 147, № 2. - P. 262-274.
7. Mohamed, A.A. Ex vivo expansion of stem cells: defining optimum conditions using various cytokines/ A.A.Mohamed[etal.] // Lab. Hematol.-2006. - Vol. 12, № 2. - P. 86-93.
8. Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation / W. Piacibello [et al.] // Leukemia. - 1998. - Vol. 12, № 5. -P. 718-727.
9. Zhang, Y. Coculture of umbilical cord blood CD34+ cells with human mesenchymal stem cells / Y. Zhang [et al.] // Tissue Eng. - 2006. - Vol. 12, № 8. - P. 2161-2170.
10. Jones, J. Obstetric predictors of placental / umbilical cord blood volume for transplantation / J. Jones [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2003. -Vol. 188, № 2. - P. 503-509.
11. Shpall, E.J. Transplantation of ex vivo expanded cord blood / E.J. Shpall [et al.] // Biol. Blood Marrow Transplant. - 2002. - Vol. 8, № 7. -P. 368-376.
12. Liu, Y. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood in rotating wall vessel / Y. Liu [et al.] //J. Biotechnol. -2006. - Vol.124, № 3. - P. 592-601.
13. Ahrens, I. Successful in vitro expansion and differentiation of cord blood derived CD34+ cells into early endothelial progenitor cells reveals highly differential gene expression / I. Ahrens [et al.] // PLoS One. - 2011. - Vol. 6, № 8
14. Qunliang, L. A comparative gene-expression analysis of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells grown in static and stirred culture systems / L. Qunliang [et al.] // Cell Mol. Biol. Lett. - 2006. - Vol. 11, № 4. - P. 475-487.
15. Madlambayan, G.J. Clinically relevant expansion of hematopoietic stem cells with conserved function in a single-use, closed-system bioprocess / G.J. Madlambayan [et al.] // Biol. Blood Marrow Transplant. - 2006. - Vol. 12, № 10. - P. 1020-1030.
16. Gluckman, E. Ten years of cord blood transplantation: from bench to bedside / E. Gluckman // British Journal of Haematology. -2009. - Vol. 147, № 2. - P. 192-199.
Д.А. Иволгин
Тел.: 8-965-063-23-03
e-mail: [email protected]
