CC BY
532
Современные аспекты этиопатогенеза мочекаменной болезни
^ А.В. Серегин1, Н.С. Мулабаев1, Э.Р. Толордава2
1 Кафедра урологии и хирургической андрологии Российской медицинской академии последипломного образования, Москва 2 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва
В лекции рассматриваются эндогенные и экзогенные причины мочекаменной болезни, а также проблема существования бактерий в виде особых сообществ — биопленок. В составе биопленок возбудители защищены как от факторов иммунной системы организма, так и от различных лекарственных препаратов, в первую очередь от антибиотиков. Способность патогенных бактерий существовать в организме хозяина в виде биопленок рассматривается как одна из причин хронических инфекций.
Ключевые слова: мочекаменная болезнь, биопленка, “чувство кворума”.
Этиология и патогенез мочекаменной болезни
Мочекаменная болезнь (МКБ) остается одной из основных причин почечной недостаточности. От 3,6 до 7,3% пациентов, нуждающихся в проведении программного гемодиализа, составляют больные МКБ [1]. Причины развития МКБ делятся на экзогенные и эндогенные. Чем больше причин воздействует одновременно, тем сложнее патогенез МКБ и хуже ее прогноз, что обусловлено частыми рецидивами заболевания и быстрым ростом камней [2].
Экзогенные причины заложены в окружающей среде: это климатические факторы, биогеохимические особенности почвы и воды, питание, экологическая среда, социальные факторы и др. [2, 3]. Среди социальных факторов на первом месте находится гиподинамия, при которой в организме замедляются метаболические процессы, что сопровождается избыточным накоплением камнеобразующих веществ (кальций, фосфаты и мочевая кислота).
Проблема питания как фактора риска развития уролитиаза сложна и многогранна.
Контактная информация: Мулабаев Нозим Сато-рович, [email protected]
ц Лечебное дело 4.2012---------------------
Пища с высоким содержанием животного белка приводит к увеличению количества кальция, оксалатов, уратов и снижению уровня цитратов в моче [4]. Нередко факторами риска рецидива камнеобразования являются инородные тела мочевых путей. К ним относятся катетеры, нерассасываю-щийся шовный материал, нефростомы, стенты, цистостомы, которые применяются в процессе лечения пациента. Условно к инородным телам можно отнести сгустки крови и фрагменты собственных некротизи-рованных тканей, на которых часто формируются вторичные камни. Этиологическими факторами МКБ могут служить некоторые химические вещества и лекарственные препараты, например сульфаниламиды [5].
Эндогенные причины заложены в организме человека: они могут быть генетическими, врожденными и приобретенными. К эндогенным причинам следует отнести аномалии развития мочевыводящих путей, нарушения микроциркуляции в почках, инфекции почек, изменение состава мочи, усиленное выделение литогенных веществ, нарушение баланса между ингибиторами и активаторами кристаллообразования [6, 7].
В настоящее время выделяют три основных эндогенных механизма развития ги-
Этптшз мочекаменной болезни
перкальциурии: 1) повышенное всасывание кальция в кишечнике (абсорбтивная гиперкальциурия); 2) нарушение метаболизма в костях, что приводит к повышенной мобилизации кальция из костной ткани (резорбтивная гиперкальциурия); 3) нарушение почечной реабсорбции кальция или фосфора (реабсорбтивная гиперкальциурия) [2]. Врожденные и приобретенные изменения почечной ткани, обусловленные аномалиями развития органов мочевой системы и малого таза, наличием реф-люксов, беременностью, воспалением и другими факторами, могут приводить к нарушению уродинамики и/или гемодинамики в почках [8].
Регуляция фосфорно-кальциевого обмена в основном осуществляется тремя факторами нейроэндокринной системы: паратиреоидным гормоном, тиреокальци-тонином и витамином D. Основная роль принадлежит паратгормону. Составной частью метаболических нарушений при МКБ являются нарушения пуринового обмена и метаболизма мочевой кислоты. Пациенты, у которых образуются камни мочевой кислоты, имеют низкие показатели рН мочи [9].
Роль различных микроорганизмов в камнеобразовании неоднозначна. Некоторые бактерии являются сугубо “местной” причиной вторичного фосфатного камне-образования. К ним относится уреазообра-зующая микрофлора: Proteus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter. Другие микроорганизмы — Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Escherichia, Klebsiella — не выделяют уреазу, но могут потенцировать камнеобразование за счет воспалительного процесса, увеличения содержания муко-протеидов, уростаза, нарушения лимфоот-тока из почек и нарушения транспорта камнеобразуюших веществ в канальцевой системе почек [10].
В последнее время установлено, что кальцийоксалатные конкременты могут иметь инфекционное происхождение. Внутриклеточные бактерии, обнаруживаемые в
мочевых камнях человека, способны образовывать фосфатную оболочку и, таким образом, служить центрами кристаллизации и последующего роста конкрементов [11].
Значительную этиологическую и патогенетическую роль в камнеобразовании играет хронический пиелонефрит. У 92% пациентов уролитиаз протекает на фоне пиелонефрита (коралловидный уролитиаз — у 100%). Даже в основе “асептического” уро-литиаза нередко лежит скрыто протекающий инфекционно-воспалительный процесс [2].
К факторам нефропатогенности микроорганизмов относятся тропизм к паренхиме почек, феномен прилипания грамотрица-тельных бактерий к эпителию мочевыводящих путей, сходство микробных антигенов с антигенами человека [12—14]. Основные пути проникновения микроорганизмов в почку — гематогенный, уриногенный и лимфогенный. Лимфостаз и отек интерсти-ция способствуют фиксации в паренхиме почек патогенных микроорганизмов, а гипоксия почечной ткани — поддержанию жизнедеятельности микробной флоры.
Известно несколько классификаций мочевых камней. Самая распространенная основана на химическом составе конкрементов: кальциевые, струвитные (фосфатные), мочекислые, цистиновые. Оптимальные значения рН для кристаллизации солей мочевой кислоты — до 5,5, щавелевой — 6,0—6,8, фосфорной — выше 7,0. Среди мочевых камней наиболее часто встречаются оксалаты (вевеллит, ведделит); фосфаты (карбонатапатит, апатит, струвит и др.), а также ураты (мочевая кислота и ее соли). Остальные минералы наблюдаются эпизодически [15].
Результаты анализа отечественной и зарубежной литературы свидетельствуют о том, что МКБ является одной из самых актуальных проблем урологии и медицины в целом. Современные методы диагностики и лечения заболевания могут давать определенные осложнения, что обусловливает необходимость поиска новых методов диа-
-------------------Лечебное дело 4.2012
Лекции
гностики, лечения, профилактики и мета-филактики уже сформировавшихся мочевых камней, а также путей предотвращения серьезных осложнений в интра- и послеоперационном периодах, в том числе воспалительного генеза. Кроме того, следует учитывать рост резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, в том числе к недавно внедренным в практику антибиотикам. Во многом это обусловлено способностью возбудителей существовать в виде биопленок — феномена, являющегося причиной хронизации инфекционных процессов.
Биопленки: феномен, структура, способы обнаружения
Еще со времен А. ван Левенгука микробиологам была известна способность бактерий образовывать сложные бактериальные сообщества. В последние годы способность к образованию биопленок была обнаружена более чем у 50 видов бактерий [16]. Прогрессу в понимании феномена биопленок способствовало совершенствование техники микроскопирования и особенно применение конфокального лазерного сканирующего микроскопа, что позволило изучать микроструктуру живых биопленок [17].
Биопленки — это высокоорганизованные бактериальные сообщества, образованные бактериями одного или нескольких видов и состоящие как из активно функционирующих клеток, так и из покоящихся или некультивируемых форм; бактерии заключены в экзополимерный матрикс и ад-гезированы к инертным или живым поверхностям [17—19].
Погруженные в межклеточный матрикс микроорганизмы в биопленках собраны в микроколонии, которые имеют свои микросреды, отличающиеся уровнями рН, усваиваемостью питательных веществ, концентрациями кислорода. Матрикс пронизан каналами, по которым циркулируют питательные вещества, продукты жизнедеятельности, ферменты, метаболиты, кис-
Лечебное дело 4.2012
лород, а также сигнальные молекулы, обеспечивающие взаимодействие бактериальных клеток в пространстве биопленки. В состав билипидного слоя поверхностной оболочки сообщества входит больше кар-диолипина и меньше лизофосфолипидов, чем в состав мембран бактериальных клеток, что придает этой структуре повышенную прочность и устойчивость к факторам окружающей среды [20]. Считается, что около 60% внутрибольничных инфекций обусловлены биопленками [21].
Методы исследования биопленок
Для изучения живых клеток и наблюдения их в процессе движения, в том числе при образовании биопленок, применяются фазово-контрастный и интерференционный микроскопы. Регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки. Использование трансмиссионной электронной микроскопии и специфических красителей позволило определить природу внеклеточных волокон в биопленках и уточнить характер их связи с клетками. Благодаря своей высокой разрешающей способности трансмиссионная электронная микроскопия на сегодняшний день является важнейшим инструментом для исследования биопленок in vitro и in vivo.
Создание в 1980-х годах однофокусного лазерного сканирующего микроскопа дало возможность изучить биопленки in situ в естественном состоянии без нарушения целостности матрикса и способствовало целой серии открытий, легших в основу современной концепции биопленкообразо-вания. В научно-исследовательской практике используются динамические методы получения биопленок in vitro в разнообразных сосудах и на поверхности различных носителей: во флаконах, в чашках Петри, в пластиковых планшетах и т.п. [22]. Для наблюдения за процессом формирования биопленок с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа конструируют так называемые проточные
Этпапшз мочекаменной болезни
камеры — непрерывно-проточные системы из тефлона, металла или пластика, сквозь которые непрекращающимся потоком пропускают питательную среду. Камеры снабжены визуализационными отверстиями, позволяющими осуществлять непосредственное наблюдение за процессом образования и развития биопленки без ее разрушения. Такие камеры чаще всего бывают однопроточными — для того чтобы свежая среда, поступающая в систему, проходила сквозь клетки и накапливалась в них, но не рециркулировала.
В настоящее время для изучения способности бактерий формировать биопленки разработаны методы их лабораторного получения и количественного учета способности бактерий к их образованию, без которых генетические исследования были бы невозможны. Одним из наиболее доступных и быстрых методов является культивирование исследуемых бактериальных клеток в 96-луночных пластиковых планшетах в условиях, наиболее подходящих для определенного вида бактерий. Метод основан на способности бактерий формировать биопленки на поливинилхлоридном пластике. Окрашивание полученной биопленки кристалл-виолетом и количественный учет связанного красителя в спектрофотометре позволяют проводить количественные сравнения способности образовывать биопленки различными мутантными штаммами бактерий для изучения генетического контроля этого процесса.
Благодаря интенсивным исследованиям удалось охарактеризовать процесс образования биопленок. Так, первичная стадия — это прикрепление планктонных бактерий к различным поверхностям, при котором существенная роль отводится флагеллам и пилям. Следующая стадия — созревание, при котором прикрепившиеся клетки теряют подвижность, начинается синтез экзо-полимерного матрикса — основного компонента биопленки, происходит окончательное формирование сообщества за счет размножения клеток и нарастания биомас-
сы матрикса, формируются трехмерные грибовидные или колоннообразные структуры. Конечный этап — процесс дисперсии бактерий из внутренних участков биопленки в окружающую среду: бактерии приобретают подвижность, выплывают через открытые каналы, с тем чтобы потом вновь прикрепиться к поверхности и образовать новое биопленочное сообщество [21].
Среди множества факторов, составляющих очевидную выгоду существования в форме биопленки, А. Бут и соавт. выделяют: прикрепление к субстрату, обеспечивающее более выгодные условия доступа к питательным веществам; способность бактерий к более легкому образованию кооперативных структур с другими видами; прикрепление и последующее размножение микроорганизмов с образованием микроколоний и/или пленки, что обеспечивает им более выгодные условия существования, связанные, в частности, с противодействием механическому удалению бактерий из макроорганизма [23].
На сегодняшний день известно, что у различных видов бактерий состав матрикса различается. Установлено, что основным компонентом матрикса биопленок, образуемых S. typhimurium, является целлюлоза, матрикса биопленок, образуемых P. aeruginosa, — альгинат (полианионный полисахарид), а образуемых В. cepacia — экзополисахарид, получивший наименование “сепа-циан” по видовому названию бактерий [24]. В состав матрикса биопленок входят также нуклеиновые кислоты: так называемая экстраклеточная ДНК (эДНК), которая рассматривается как результат лизиса клеток. Однако U. Bockelmann et al. доказали, что эДНК бактерий формирует некую пространственную структуру [25]. Ее образование может происходить как при росте биопленок, образованных бактериями одного вида, так и при формировании биопленок, образованных несколькими видами бактерий. Кроме того, предполагается роль эДНК в обмене генетической информацией в результате естественной трансформации,
--------------------Лечебное дело 4.2012
Лекции
а также использование ее клетками в качестве источника питания при голодании.
Биопленки, состоящие из нескольких видов микроорганизмов, толще и стабильнее, чем моновидовые, что может усиливать их устойчивость к антибиотикам [26]. Между отдельными клетками бактерий, принадлежащих к одному и тому же виду, а также к разным видам, родам и даже семействам, осуществляется передача информации с помощью определенного рода сигнальных молекул, которые можно считать “словами” в своеобразном общении бактерий. Передача информации способствует быстрой адаптации популяции бактерий к меняющимся условиям и их выживанию в природной среде [27, 28].
Роль регуляторного механизма “чувство кворума” в образовании биопленок
В настоящее время наблюдается переход от традиционного представления о бактериальных популяциях как об обособленных бактериальных клетках к представлению о них как о целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в зависимости от изменения условий обитания. Понятие “чувство кворума” (quorum sensing) означает восприятие клетками изменений среды, которые возникают при достижении бактериальной культурой некоторой пороговой численности, и реакцию на эти изменения. “Чувство кворума” — это межклеточный механизм бактериального общения, предназначенный для контроля экспрессии генов в зависимости от плотности бактериальной популяции и реализуемый за счет синтеза низкомолекулярных соединений (аутоиндукторов). Аутоиндукторы являются сигнальными молекулами, позволяющими клеткам взаимодействовать друг с другом. Аутоиндукторы синтезируются самими бактериями и относятся к различным классам химических соединений. Один вид может иметь несколько систем, обеспечивающих “чувство кворума”, и использовать несколько сигнальных молекул [29, 30]. Известны три основные системы:
Лечебное дело 4.2012-------------------
одна используется преимущественно грам-отрицательными бактериями, другая — грамположительными, третья является универсальной. Уровень синтеза аутоиндукторов возрастает по мере увеличения плотности клеточной популяции. Аутоиндукторы накапливаются до необходимого порогового значения, что приводит к активации экспрессии определенных генов [31].
Роль биопленок в поддержании хронической инфекции
В настоящее время отмечается тенденция к росту удельного веса инфекций в общей структуре заболеваемости: увеличивается количество случаев хорошо известных инфекций, описаны новые инфекционные заболевания. Значительная их часть приходится на долю хронических инфекций, причем более половины развивается у людей с ослабленной иммунной системой. У таких людей возбудителями заболевания являются инфекционные агенты, обитающие в окружающей среде, например Р. аег^епоБа, обитающая в водоемах. Одним из механизмов хронического инфекционного процесса является образование биопленок. Установлено, что многие хронические инфекции, а также инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантируемого оборудования — линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, — вызываются бактериями, растущими в виде биопленок.
Если роль биопленок при катетер-ассо-циированных инфекциях несомненна, то связь биопленок с инфекциями, не вызываемыми чужеродными агентами, не совсем ясна. Как правило, инфекционные заболевания являются результатом сложного взаимодействия между патогеном и хозяином. За прошедшее десятилетие была доказана роль биопленок в развитии целого ряда инфекций человека. По данным Центра по контролю и профилактике заболеваний США (СБС), до 65% заболеваний человека может быть связано с формированием биопленок. Наиболее важной отличительной
Этптшз мочекаменной болезни
особенностью бактерий, существующих в составе сообществ, является повышенная (в 100—1000 раз) резистентность к антибактериальным препаратам [32, 33]. Антибиотики в терапевтических концентрациях оказываются эффективными лишь по отношению к диффузно распределенным планктонным культурам, в то время как бактерии внутри биопленки способны размножаться и вновь диссеминировать после завершения курса лечения, приводя к формированию хронических процессов и рецидивам заболевания. Биопленки успешно выживают в присутствии концентраций антибиотиков, значительно превосходящих минимальную подавляющую концентрацию (МПК) [20]. Механизм, при котором бактерии в биопленке достигают такой устойчивости, до конца не изучен. Предположительно, речь идет о таких фенотипических изменениях у бактерий, которые приводят к устойчивости клеток внутри биопленки. Также выделяют два других фактора: инактивацию антибиотиков экс-траклеточными полимерами или модифицированными ферментами и ограничение в скорости роста при недостатке питательных веществ. Биопленочная инфекция редко устраняется иммунной системой хозяина: бактерии биопленок освобождают антигены, стимулируют продукцию антител и приобретают устойчивость к защитным механизмам.
С помощью математической модели было доказано, что мощным барьером для проникновения антибиотиков служит их дезактивация во внешних слоях биопленки. Другие исследователи объясняют ослабление биопленочной восприимчивости к антибиотикам тем, что часть клеток в биопленках испытывают нехватку питательных веществ и существуют в покоящемся или некультивируемом состоянии, а медленно растущие и/или не растущие клетки слабовосприимчивы ко многим антибиотикам. Наиболее распространенной точкой зрения относительно механизма, ослабляющего восприимчивость биопленок к антибиоти-
кам, является представление о том, что некоторые клетки в биопленке приобретают особый защитный фенотип в зависимости от того, на какой поверхности (кость, мягкая ткань, металл или пластик) она образуется [34].
При изучении совместного действия ферментов и антибиотиков на бактерии в биопленках В.В. Тец и соавт. использовали препараты в концентрациях, составляющих 5—100 МПК для диффузно растущих планктонических культур бактерий [35]. Применение антибиотиков в дозе, соответствующей МПК, не сопровождалось статистически значимым уменьшением количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в биопленках всех исследованных штаммов [34]. Для эталонных штаммов бактерий и штаммов бактерий, выделенных от пациентов, были получены результаты, имеющие ряд характерных признаков. Общим оказалось снижение выживаемости бактерий в биопленках в присутствии антибиотиков и ферментов, взятых в концентрациях, по отдельности не изменяющих числа КОЕ в сообществе. Этот эффект зарегистрирован как у грамотрицательных, так и у грамположительных бактерий. В присутствии папаина число КОЕ в биопленках при действии различных антибиотиков снижалось в среднем в 2—4 раза, в присутствии вобэнзима — в 2—10 раз [35].
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ферменты в небольших концентрациях могут не только частично угнетать образование микробных биопленок, но и усиливать действие различных неродственных антибиотиков. Такой эффект имеет важное практическое значение, поскольку при развитии инфекционного процесса в естественных условиях клиническая симптоматика возникает в сроки, соответствующие стадии колонизации и формирования различных моновидовых и смешанных микробных сообществ, отграниченных от внешней среды. Таким образом, применение ферментов, не влияющих на жизнеспособность отдельных микроор-
--------------------Лечебное дело 4.2012
Лекции
ганизмов или чувствительность к антибиотикам, позволяет эффективно бороться с бактериальными инфекциями.
Мишенью для воздействия на инфекционный и микробный процесс являются не только сами бактерии, но и биопленки. Если бы нам удалось препятствовать формированию гликокаликса, в который заключены микробы, наверное, достижение цели элиминации бактерий было бы намного более реальным. Начиная с конца 1990-х годов стали появляться работы, в которых изучалась способность некоторых препаратов, например кларитромицина, ингибировать образование гликокаликса, продуцируемого метициллинрезистентным золотистым стафилококком [36].
Для синегнойной палочки также выявлена способность к формированию биопленки. При детальном изучении механизма воздействия кларитромицина на образование биопленки доказано, что структура биопленки изменяется, уменьшается количество альгината, гексозы, истончается гликокаликс, что способствует проникновению антимикробного препарата, в данном случае фторхинолона. Эффективность фторхинолона оказалась значительно более высокой в присутствии кларитромици-на, что привело к эрадикации синегнойной палочки [37].
Также следует отметить, что микробные биопленки повышают устойчивость бактерий к антибиотикам, по некоторым данным, в 100—1000 раз [38]. В то же время результаты целого ряда исследований свидетельствуют о том, что кларитромицин не только разрушает матрикс биопленок, образованных Р. аег^поБа, но и уменьшает ее двигательную активность, что способствует снижению вирулентности и существенно-
му повышению эффективности специфических антисинегнойных препаратов [39]. Кроме того, кларитромицин разрушает матрикс биопленки, облегчая доступ другим антибиотикам.
В последних исследованиях доказана роль биопленок в камнеобразовании у урологических пациентов [19]. Разрушение камней во время перкутанной нефролито-лапаксии может явиться пусковым механизмом активации роста микроорганизмов, интегрированных в биопленку, а миграция бактерий в новообразованные сосуды в соединительной ткани внутри камня может вызвать бактериемию и септические осложнения. Сохранение спаек с элементами кристаллоподобных образований почечного конкремента после литотрипсии или оперативного удаления камней служит одной из значимых причин рецидива неф-ролитиаза [40].
Одним из факторов, определяющих эффективность антибактериальной терапии, является длительное сохранение оптимальной терапевтической концентрации антибиотиков в очаге воспаления, способность их проникать в биопленки и оказывать непосредственное воздействие на микроорганизмы инфекционного очага. В связи с этим возникла необходимость в углубленном изучении роли биопленок в этиопато-генезе МКБ в общем и рецидиве камнеоб-разования в частности, в разработке новых подходов к лечению бактериальных инфекций при МКБ, способствующих предотвращению формирования биопленок или обеспечивающих их разрушение.
Со списком литературы вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru
Urolithiasis: Current Aspects of Etiology and Pathogenesis A.V. Seregin, N.S. Mulabaev, and E.R. Tolordava
The article deals with endogenous and exogenous causes of urolithiasis as well as the problem of existence of bacteria in the form of biofilms. In biofilms pathogens are protected from both immune system and different drugs, especially from antibiotics. At the present time biofilm is considered one of the causes of common chronic infections. Key words: urolithiasis, biofilm, quorum sensing.
Лечебное дело 4.2012---------------------------------------------------------------------------------------------------
